Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết trình bày việc phân lập được chủng vi khuẩn B. thuringiensis serovar kurstaki (Btk) MSS1.1 có khả năng thủy phân chitin cao. Chủng Btk MSS1.1 đã được dùng để tạo chế phẩm kháng nấm gây bệnh thực vật và diệt côn trùng gây hại, tuy nhiên hiệu suất còn thấp và khó nâng cao hiệu quả sinh tổng hợp của chitinase - enzyme chìa khóa quyết định hiệu quả phòng bệnh của chế phẩm.
Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 15(3): 571-579, 2017 BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH CHITINASE TỪ BACILLUS THURINGIENSIS SEROVAR KURSTAKI TRONG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI Trịnh Thị Thu Hà1,2, Đồng Văn Quyền1,2, Ngơ Đình Bính1, * Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam * Người chịu trách nhiệm liên lạc E-mail: binh.gen@gmail.com Ngày gửi bài: 03.4.2017 Ngày nhận đăng: 28.6.2017 TÓM TẮT Trong nghiên cứu trước, phân lập chủng vi khuẩn B thuringiensis serovar kurstaki (Btk) MSS1.1 có khả thủy phân chitin cao Chủng Btk MSS1.1 dùng để tạo chế phẩm kháng nấm gây bệnh thực vật diệt côn trùng gây hại, nhiên hiệu suất thấp khó nâng cao hiệu sinh tổng hợp chitinase - enzyme chìa khóa định hiệu phòng bệnh chế phẩm Để khắc phục hạn chế nhà nghiên cứu áp dụng công nghệ protein tái tổ hợp để sản xuất chitinase qui mô công nghiệp Hướng giúp nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp chitinase đồng thời dễ dàng tinh thu hồi enzyme so với việc sử dụng chủng tự nhiên Nhằm mục đích thu lượng lớn enzyme có hoạt tính cao, chúng tơi tiến hành biểu thu nhận chitinase tái tổ hợp (rChiA) từ chủng Btk E coli Gene mã hóa chitinase chủng Btk thiết kế vào vector biểu pET28b(+) vị trí EcoRI XhoI Protein tái tổ hợp biểu dạng tan trì hoạt tính sinh học Hoạt tính chitinase tái tổ hợp tăng 1,26 lần so với chitinase tự nhiên rChiA tinh thành công sắc ký lực sử dụng cột Probond Nikel Resin Kết thử nghiệm cho thấy, chitinase tái tổ hợp có khả kháng loại nấm gây bệnh thực vật Fusarium oxysporum Rhizoctinia solani không gây ảnh hưởng đến Mucor sp Ngồi ra, chitinase tái tổ hợp làm tăng hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) sâu khoang (Spodoptera litura) protein tinh thể thu nhận từ chủng B thuringiensis tự nhiên Khi sử dụng kết hợp rChiA với protein tinh thể từ chủng SP10.6 rút ngắn thời gian gây chết từ 72 xuống 48 (gây chết 100% sâu tơ 84,3% sâu khoang), đồng thời giá trị LC50 giảm 8,04 % 6,80% sâu tơ sâu khoang Từ khóa: kháng nấm, nồng độ gây chết 50%, protein tinh thể, protein tái tổ hợp, tinh protein, vector biểu MỞ ĐẦU Chitin chất hữu đứng thứ tự nhiên sau cellulose Hàng năm, ước tính có khoảng 29,9 triệu chitin phụ phẩm từ lồi động vật có vỏ, khoảng 1,4 triệu từ hàu 0,7 triệu từ mực ống (Narayanan et al., 2014), gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Một phương pháp chuyển hóa chitin tạo dẫn xuất mạch ngắn chitinoligosaccharide có giá trị kinh tế ứng dụng cao, an tồn người mơi trường sử dụng chitinase Các enzyme có giá trị ứng dụng không để sản xuất dẫn xuất enzyme hữu ích mà tác nhân kiểm sốt nấm gây bệnh thực vật tăng hoạt tính diệt trùng vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) (Barboza-Corona et al., 2008) Chitinase sản sinh loài vi sinh vật, thực vật số côn trùng với hàm lượng thấp Các nhà khoa học nghiên cứu sử dụng công nghệ protein tái tổ hợp để sản xuất chitinase qui mô công nghiệp Hướng giúp nâng cao suất sinh tổng hợp enzyme đồng thời lượng enzyme thu dễ dàng tinh sử dụng chủng tự nhiên Hệ biểu E coli thường lựa chọn để biểu gen ngoại lai số ưu điểm E coli dễ nuôi cấy, môi trường rẻ tiền, tốc độ sinh trưởng nhanh nên có khả tổng hợp lượng lớn protein tái tổ hợp, biểu protein lạ lên đến 50% protein tổng số tế bào, điều giúp dễ dàng tối ưu nâng cao sản lượng protein tái tổ hợp công nghệ lên men giảm giá thành sản phẩm protein tái tổ hợp Gene mã hóa chitinase nhiều tác giả giới nghiên cứu tạo dòng biểu E coli (Lobo et al., 2013; 571 Trịnh Thị Thu Hà et al Castaneda-Ramírez et al., 2013; De la FuenteSalcido et al., 2016; Pechsrichuang et al., 2016) Trong nghiên cứu này, tiến hành biểu tinh chitinase tái tổ hợp E coli, đồng thời xác định khả ức chế phát triển nấm gây bệnh thực vật chitinase tác dụng tương hỗ diệt côn trùng chitinase tái tổ hợp kết hợp với protein tinh thể Bt VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP (kháng thể kháng His - tag), độ pha loãng 5000 lần Sau giờ, màng rửa lại TBST lần tiếp tục ủ màng với kháng thể (cộng hợp kháng thể kháng kháng thể gắn peroxidase), độ pha lỗng 10000 lần nhiệt độ phòng Loại bỏ cộng hợp, rửa màng lần TBST, lần TBS mầu cách bổ sung dung dịch chứa chất cho peroxidase (Promega) Màng dung dịch màu ủ nhiệt độ phòng - 10 phút, sau dừng phản ứng H2O Quan sát ghi nhận kết Vật liệu Tinh protein Plasmid tái tổ hợp pGEM-chiA mang gen chiA mã hóa chitinase thiết kế từ nghiên cứu trước (Trịnh Thị Thu Hà et al., 2014) Plasmid pET28b(+) (Novagen) dùng làm vector biểu Chủng E coli BL21(DE3) (Invitrogen) dùng làm chủng biểu Enzyme cắt hạn chế EcoRI, XhoI, thang DNA (Thermo Fisher scientific), thang protein chuẩn (Gangnam-Introbio), chitin powder (Sigma), kháng thể kháng His – tag (Hytest) Cột Probond Nikel Resin (Thermo Fisher Scientific) dùng để tinh rChiA Đoạn gen chiA cắt khỏi vector tách dòng pGEM-chiA EcoRI XhoI nối vào vector pET28b(+) xử lý trước enzyme để tạo thành vector tái tổ hợp pET28chiA Thu tế bào từ 100 ml môi trường biểu cách ly tâm 5000 vòng/phút 10 phút, hòa tan 10 ml đệm phá tế bào (50 mM đệm phosphate, 10 mM imidazole, pH 8), bổ sung 10 mg lysozyme, ủ đá 30 phút, siêu âm 10 phút Ly tâm 13.000 vòng/phút 15 phút thu dịch Chuẩn bị cột Probond Nikel Resin (Thermo Fisher Scientific), rửa cân cột đệm cân (phosphate 50 mM, imidazole 10 mM, pH 8) hướng dẫn nhà sản xuất Đưa mẫu dịch thu lên cột Các protein không chứa đuôi His-tag chảy qua cột, tiếp tục bị loại bỏ trình rửa cột Các protein chứa His-tag gắn cột đẩy khỏi cột 10 ml đệm đẩy (50 mM đệm phosphate, 250 mM Immidazol, pH 8), thu phân đoạn ml Các protein tái tổ hợp sau tinh kiểm tra gel SDS-PAGE bảo quản -800C Biểu rChiA Thử hoạt tính sinh học Các tế bào E coli mang vector biểu pET28chiA ni cấy mơi trường LB lỏng có bổ sung kanamycin nồng độ 50µg/ml, lắc qua đêm 370C chuyển 1% sang môi trường LB chứa kháng sinh Tiếp tục nuôi OD600nm = 0,6-0,8 bổ sung Isopropylthio-βgalactoside (IPTG) với nồng độ cuối 0,5 mM để cảm ứng tổng hợp protein ngoại lai Quá trình biểu rChiA thực 370C thu mẫu sau nuôi cấy cảm ứng Thu tế bào cách ly tâm 5000 vòng/phút 10 phút Protein tái tổ hợp phân tích SDS-PAGE Western blot Để xác định hoạt tính kháng nấm rChiA: nấm F oxysporum, R solani Mucor sp cấy thảm phát triển tốt mơi trường thạch Dùng khoan nút chai đường kính 0,7 cm khoan lấy thỏi thạch dày 0,5 cm đặt vào đĩa môi trường PDA Các đĩa PDA đục lỗ đường kính 0,7 cm bổ sung 100 µl, 200 µl dung dịch enzyme dung dịch enzyme bất hoạt 1000C phút (đối chứng) vào giếng Hoạt tính ức chế phát triển sợi nấm chitinase xác định sau 3-5 ngày nuôi 280C Phương pháp Thiết kế vector biểu Kiểm tra biểu rChiA Western blot Mẫu protein điện di biến tính gel SDSPAGE 12,5% chuyển lên màng PVDF nhờ chuyển màng BioRad giờ, 120V Sau rửa màng lần đệm TBST (0,1% Tween 20 đệm Tris-saline), màng ủ với kháng thể 572 Nghiên cứu ảnh hưởng rChiA tinh lên thành tế bào sợi nấm: Nấm cấy lam kính có phủ lớp mỏng mơi trường PDA, ni ngày 280C bổ sung 100 µl rChiA vào sợi nấm Sau 120 phút ủ 400C, kiểm tra thủy phân thành tế bào nấm kính hiển vi mô tả nghiên cứu trước (Harighi et al., 2007) Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 15(3): 571-579, 2017 Xác định khả tăng hiệu diệt sâu chitinase: sử dụng loại sâu thử sâu tơ (Plutella xylostella), sâu khoang (Spodoptera litura) độ tuổi Tiến hành thử theo phương pháp Park cộng (1997): bắp cải cải xanh rửa để khơ, cắt vào đĩa petri Thí nghiệm tiến hành lô: Lô 1: phun dung dịch protein tinh thể chủng Bt SP10.6 phân lập từ mẫu đất Sa Pa có mang gen cry1Ab, cry1Ac (gen mã hóa protein Cry1Ab, Cry1Ac diệt trùng Bộ cánh vẩy) vào đĩa rau cải với nồng độ 300 ng/cm2 diện tích bề mặt cải (đối với sâu tơ) 500 ng/cm2 (đối với sâu khoang); nồng độ đĩa làm khô tủ cấy vơ trùng Sau cho đĩa 10 sâu non tuổi 2, sau 24 thử nghiệm kiểm tra số sâu chết sau 12 giờ; Lô 2: phun dung dịch chitinase tinh với nồng độ 100 ng/cm2 Mỗi nồng độ đĩa, đĩa 10 sâu; Lô 3: phun protein tinh thể nồng độ 300 ng/cm2 diện tích bề mặt cải (đối với sâu tơ) 500 ng/cm2 (đối với sâu khoang), bổ sung chitinase nồng độ 100 ng/cm2 Mỗi nồng độ đĩa, đĩa 10 sâu • Tỉ lệ sâu chết tính theo cơng thức Abbott: A= C −T C X 100 Trong đó, A: % sâu chết; C: Số sâu sống mẫu đối chứng; T: Số sâu sống mẫu thí nghiệm KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Biểu rChiA E coli Vector tái tổ hợp pET28b(+) mang gen chiA từ chủng Btk (pET28chiA) thiết kế mô tả mục vật liệu phương pháp nghiên cứu Để biểu rChiA, vector tái tổ hợp pET28chiA biến nạp vào tế bào khả biến E coli BL21(DE3) phương pháp sốc nhiệt Các dòng biến nạp ni cấy mơi trường LB có bổ sung kanamycin cảm ứng IPTG Dịch phá tế bào điện di kiểm tra gel SDS-PAGE 12,5% (Hình 1A) Kết điện di cho thấy, sau cảm ứng xuất băng protein với kích thước khoảng 70 kDa đậm so với mẫu lại (băng 3, Hình 1A) Kích thước theo lý thuyết protein ChiA 74 kDa, gen chiA có trình tự tín hiệu dài 34 amino acid (~4 kDa) đầu N Theo thiết kế vector biểu hiện, rChiA biểu dung hợp với Histidine đầu C 36 amino acid đầu N Như vậy, protein tái tổ hợp rChiA có kích thước khoảng 79 kDa Kết biểu thu băng protein khoảng 70 kDa Như vậy, trình tự tín hiệu đầu N bị cắt với 36 amino acid vector Để khẳng định, tiến hành kiểm tra Western blot sử dụng kháng thể kháng His-tag đồng thời kiểm tra hoạt tính protein tái tổ hợp phản ứng DNS Kết Western blot (Hình 1B) cho thấy protein tái tổ hợp phản ứng mạnh với kháng thể kháng His-tag thể băng tín hiệu đậm kích thước ~70 kDa Ngồi ảnh Western blot xuất số băng protein có kích thước thấp so với băng 70 kDa hồn tồn khơng có băng có kích thước lớn Sự xuất băng thấp giải thích protein chitinase tái tổ hợp bị thủy phân không đặc hiệu protease trình chuẩn bị mẫu Xác định trạng thái biểu rChiA rChiA khơng giữ hoạt tính sinh học biểu dạng thể vùi (inclusion body) Do chúng tơi tiến hành kiểm tra trạng thái biểu rChiA Kết điện di SDS-PAGE (Hình 1C) cho thấy phần lớn protein tái tổ hợp nằm phần hòa tan, phù hợp với kết nghiên cứu trước biểu rChiA E coli (Lobo et al., 2013; Pechsrichuang et al., 2016) Từ kết trên, kết luận protein tiết khoang chu chất peptide tín hiệu (gồm 34 amino acid đầu N) bị loại bỏ peptidase rChiA chuyển qua màng Kết nghiên cứu trước Lobo (Lobo et al., 2013) cho thấy, gen mã hóa chitinase từ Chromobacterium violaceum có chứa peptide tín hiệu, biểu E coli thu protein môi trường ni cấy rChiA có hoạt tính thủy phân chitin cao Bên cạnh đó, enzyme chitosanase B subtilis biểu E coli, protein tái tổ hợp dễ dàng thu từ môi trường nuôi cấy khoang gian bào peptide tín hiệu nhận chế tiết E coli (Pechsrichuang et al., 2016) Ngoài ra, endochitinase từ Bt serovar konkukian biểu E coli Protein tái tổ hợp thu có kích thước 70 kDa (kích thước protein trưởng thành sau peptide tín hiệu bị cắt) (Mehmood et al., 2010) Trong nghiên cứu trước đó, gen chiA74 từ Bt biểu E coli chủng K12, hoạt tính enzyme tái tổ hợp thu tăng xấp xỉ 500% so với biểu E coli DH5α (Cristobal et al., 2013) Gần đây, gen chiA mã hóa endochitinase từ chủng vi khuẩn Bt tenebrionis DSM- 2803 573 Trịnh Thị Thu Hà et al biểu E coli Protein tái tổ hợp thu có khả ức chế phát triển nấm Colletotrichium gloeosporioides gây bệnh thán thư thực vật (De la Fuente-Salcido et al., 2016) Thử nghiệm ban đầu cho thấy, hoạt tính chitinase A protein tái tổ hợp tạo 1,10 U/ml cao hoạt tính chitinase tự nhiên 1,26 lần (kết khơng nêu đây) Do kết luận chitinase tái tổ hợp biểu thành cơng E coli B C Hình Protein kiểm tra biểu rChiA gel SDS-PAGE (A) ; Phân tích Western blot (B) Trạng thái biểu rChiA (C) A: Băng 1: Protein tổng số từ chủng E coli 21 mang vector pET28 trước cảm ứng; Băng 2: Protein tổng số từ chủng E coli BL21 mang vector pET28 sau cảm ứng; Băng 3: Protein tổng số từ chủng E coli BL21(DE3) mang pET28chiA sau cảm ứng IPTG; Băng 4: Protein tổng số từ chủng E coli BL21(DE3) mang pET28chiA trước cảm ứng IPTG; B: Băng 1: Dịch chiết protein từ E coli BL21(DE3) mang pET28chiA sau cảm ứng; Băng 2: Dịch chiết protein từ E coli BL21(DE3) mang pET28chiA trước cảm ứng; M: Thang protein chuẩn C: Băng Protein tổng số pha tan; Băng Protein tổng số thể vùi; M: Thang protein chuẩn B Hình Điện di SDS-PAGE chitinase tinh (A) thử nghiệm hoạt tính chitinase trước sau tinh phương pháp khuếch tán đĩa thạch A: M Thanh protein chuẩn, Protein sau tinh sạch, Protein trước tinh Hình B: 1, Đối chứng (1 Protein tổng số từ E coli không mang gen chiA, Đệm chiết protein tinh sạch), Protein trước tinh sạch, Protein sau tinh Tinh protein chitinase tái tổ hợp Như trình bày trên, rChiA biểu dạng hòa tan có gắn thêm His-tag, chúng tơi tiến hành tinh phương pháp khơng biến tính sử dụng cột Probond Nikel Resin hướng dẫn hãng Thermo Fisher Scientific Protein thu sau tinh điện di kiểm tra gel 574 SDS-PAGE (Hình 2A) Kết phân tích bằng phần mềm Dolphin 1D cho thấy, protein chitinase tái tổ hợp có độ tinh 94% , lẫn protein tạp Hoạt tính dịch rChiA trước sau tinh định tính sơ phương pháp khuếch tán đĩa thạch có chứa chitin huyền phù 0,5% Kết cho thấy giếng xuất vòng thủy phân chitin màu trắng sau nhuộm dung dịch 1% lugol (Hình 2B), mẫu Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 15(3): 571-579, 2017 đối chứng âm (dịch protein từ chủng vi khuẩn E.coli không mang gen chiA dung dịch đệm tinh protein) khơng cho vòng phân giải chitin Kết chứng tỏ rChiA tinh thành công giữ hoạt tính sinh học mong muốn Thử nghiệm khả kháng nấm gây bệnh thực vật rChiA Hoạt tính ức chế phát triển số nấm gây bệnh thực vật F oxysporum R solani rChiA thử nghiệm Các bước thực mơ tả trên, hoạt tính ức chế quan sát sau 3-5 ngày tiến hành thí nghiệm Kết cho thấy, giếng bổ sung rChiA sợi nấm phát triển hẳn so với giếng đối chứng bổ sung enzyme bất hoạt (Hình 3A, 3B) Đối với nấm Mucor sp sợi nấm giếng bổ sung chitinase phát triển bình thường giống giếng đối chứng (Hình 3C) Mặt khác quan sát kính hiển vi chúng tơi nhận thấy, nấm F oxysporum R solani xử lý với rChiA sợi nấm bị thủy phân, biến dạng sợi nấm xử lý với nước giữ nguyên hình dạng ban đầu Ngược lại, sợi nấm Mucor sp không ảnh hưởng xử lý với rchiA (Hình 4) Kết nghiên cứu gần cho thấy, chitinase có hoạt tính kháng nấm khác cấu trúc bề mặt tỷ lệ chitin thành tế bào nấm khác (Yan et al., 2008) Chitinase dễ dàng tương tác với chitin có thành tế bào nấm vật liệu bên xếp theo cách cho phép tiếp xúc với bó sợi chitin bề mặt thành tế bào nấm Các enzyme dễ dàng liên kết với chất chitin thành tế bào nấm, sau tăng vận tốc thủy phân chitin ức chế nấm gây bệnh Trên giới có nhiều cơng bố khả kháng nấm chitinase từ vi sinh vật khác nhau: chitinase từ lồi Apergillus terrus có khả kháng loại nấm gây bệnh thực vật với mức độ khác nhau, hoạt tính thể mạnh A niger yếu F oxysporum (Aida, Taghreed, 2014), chitinase tái tổ hợp biểu Pichia pastoris ức chế cách hiệu phát triển Rhizopus stolonifer Botrytis squamosal không gây ảnh hưởng đáng kể đến Aspergillus niger Pythium aphanidermatum (Yan et al., 2008) 3 A C Hình Sự ức chế phát triển nấm F oxysporum (A), R solani (B) Mucor sp (C) rChiA 1: đối chứng (nước), 2-4: rChiA Hiệu diệt côn trùng rChiA Chủng B thuringiensis SP10.6 cho hoạt tính diệt sâu tơ (100%) sâu khoang (83.3%) sau 72 thử nghiệm Hoạt tính diệt côn trùng protein tinh thể độc Cry1Ab, Cry1Ac chủng Bt SP10.6, tách riêng Cry1Ab, Cry1Ac thử nghiệm khả diệt trùng protein tinh thể thể hoạt tính cao Đặc biệt kết hợp Cry1Ab, Cry1Ac với rChiA sâu chết nhanh hơn, tỷ lệ chết đạt 100% 84.3% sau 48 xử lý tương ứng sâu tơ sâu khoang Trong đó, xử lý với rChiA đơn lẻ tỷ lệ chết sâu tơ sâu khoang không đáng kể (dưới 10% sau 72 thử nghiệm) (Hình 5, Hình 6) Từ kết tiến hành xác định giá trị LC50 protein tinh thể từ chủng Bt SP10.6, thu kết sau: LC50 sâu tơ 167,8 ng/cm2, sâu khoang 283,5 ng/cm2 Giá trị LC50 kết hợp với rchiA 154,3 ng/cm2 sâu tơ 264,2 ng/cm2 sâu khoang (Bảng 1) 575 Trịnh Thị Thu Hà et al Hình Sợi nấm F oxysporum, R solani Mucor sp xử lý với nước (A, C, E) với rChiA (B, D, F) Nấm F oxysporum R solani xử lý với rChiA sợi nấm bị thủy phân, biến dạng (B, D) sợi nấm xử lý với nước giữ nguyên hình dạng ban đầu (A, C) Sợi nấm Mucor sp không ảnh hưởng xử lý với rchiA (F) E F A A SP10.6 576 B ĐC Hình Hình ảnh thử sâu tơ (A) sâu khoang (B) rChiA tinh thể Cry Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 15(3): 571-579, 2017 Như vậy, sử dụng kết hợp rChiA với protein tinh thể từ chủng Bt SP10.6 rút ngắn thời gian gây chết từ 72 xuống 48 (tỷ lệ chết 100% sâu tơ 84,3% sâu khoang), đồng thời giá trị LC50 giảm 8,04% 6,80% sâu tơ sâu khoang Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu trước (Ni et al., 2015) Theo Ni, thêm chitinase tinh Chi9602 ChiW50A vào chế phẩm bào tử, tinh thể chủng Bt YBT-1502 làm tăng hoạt tính diệt trùng ấu trùng sâu bướm H armigera, thể giá trị LC50 giảm 17,6% 30,4% tương ứng Chitinase có tác dụng tăng khả diệt côn trùng rút ngắn thời gian gây chết côn trùng enzyme dễ dàng phân hủy màng peritrophic, lớp màng bao bọc ruột trùng, màng có cấu trúc protein sợi chitin Đây rào ngăn cản nhiễm trùng vi khuẩn vi rút cho phép dòng chảy chất dinh dưỡng, chất khoáng nước Khi chitinase tiếp xúc với màng peritrophic enzyme phân cắt ngẫu nhiên vị trí bên mạch chitin dẫn đến suy yếu ruột côn trùng, gây thủng màng peritrophic, tạo điều kiện cho độc tố Cry tăng cường khả tiếp xúc với thụ thể biểu mô ruột, giúp cho trình gây độc protein tinh thể Cry diễn dễ dàng nhanh Bảng Nồng độ gây chết 50% (LC50) protein tinh thể Cry rChiA 2 Mẫu thử nghiệm LC50 sâu tơ (ng/cm ) LC50 sâu khoang (ng/cm ) SP10.6 167,8 283,5 SP10.6 + rChiA 154,3 264,2 A B Hình Thử nghiệm khả diệt sâu tơ (A) sâu khoang (B) protein tinh thể Cry, rChiA Protein tinh thể chủng SP10.6 sử dụng đơn lẻ tỷ lệ chết đạt 100% 83,3% sâu tơ sâu khoang sau 72 thử nghiệm, sử dụng kết hợp với rChiA sâu chết nhanh hơn, tỷ lệ chết đạt 100% 84.3% sau 48 xử lý tương ứng sâu tơ sâu khoang Enzyme rChiA sử dụng đơn lẻ tỷ lệ chết sâu tơ sâu khoang không đáng kể (dưới 10% sau 72 thử nghiệm) KẾT LUẬN Đã biểu thành cơng gen chiA mã hóa protein chitinase từ chủng vi khuẩn Btk MSS1.1 E coli Chitinase tái tổ hợp thu dạng tan có hoạt tính cao gấp 1,26 lần so với chitinase tự nhiên rChiA sau tinh có khả kháng loại nấm gây bệnh thực vật F oxysporum R solani Ngoài ra, sử dụng kết hợp rChiA với protein tinh thể Cry rút ngắn thời gian gây chết từ 72 xuống 48 (tỷ lệ chết 100% sâu tơ 84,3% sâu khoang), đồng thời giá trị LC50 giảm 8,04 % 6,80% tương ứng sâu tơ sâu khoang Lời cảm ơn: Cơng trình tài trợ Nhiệm vụ Quỹ gen Bộ Khoa học Công nghệ: “Khai thác phát triển nguồn gen diệt côn trùng vi khuẩn Bacillus thuringiensis phục vụ cho sản xuất chế phẩm sinh học” PGS TS Ngơ Đình Bính làm chủ nhiệm 577 Trịnh Thị Thu Hà et al TÀI LIỆU THAM KHẢO Aida FM, Taghreed AS (2014) Production, optimization, characterization and untifungal activity of chitinase produced by Aspergillus terrus Afr J Biotechnol 13(14): 1567-1578 Barboza-Corona JE, Reyes-Rios DM, Salcedo-Hernández R, Bideshi D (2008) Molecular and biochemical characterization of an endochitinase (ChiA-HD73) from Bacillus thuringiensis subsp kurstaki HD-73 Mol Biotechnol 39(1): 29-37 Castaneda-Ramirez JC, de la Fuente-Salcido NM, SalcedoHernandez R, León-Galvan F, Bideshi DK, Barboza – Corona JE (2013) High-level synthesis of endochitinas e ChiA74 in Escherichia coli K12 and its promising potential for use in biotechnology Folia Microbiol DOI 10.1007/s12223-013-0229-7k De la Fuente-Salcido NM, Casados-Vázquez LE, GarcíaPérez AP, Barboza-Pérez UE, Bideshi DK, SalcedoHernández R, Garcia-Almendarez BE, Barboza-Corona JE (2016) The endochitinase ChiA Btt of Bacillus thuringiensis subsp tenebrionis DSM-2803 and its potential use to control the phytopathogen Colletotrichum gloeosporioides Microbiology Open 5(5): 819–829 Lobo MD, Silva FD, Landim PG, da Cruz PR, de Brito TL, de Medeiros SC, Oliveira JT, Vasconcelos IM, Pereira HD, Grangeiro TB (2013) Expression and efficient secretion of a functional chitinase from Chromobacterium violaceum in Escherichia coli BMC Biotechnol 13: 46 doi: 10.1186/1472-6750-13-46 Mehmood MA, Xiao X, Hafeez FY, Gai Y, Wang F (2010) Molecular characterization of an endochitinase from Bacillus thuringiensis subsp konkukian World J Microbiol Biotechnol 26(12): 2171–2178 Narayanan K, Karthik A, Parameswaran B and Ashok P (2014) Production, purification and properties of fungal chitinases-A review Indian J Exp Biol 52: 1025-1035 Ni H, Zeng S, Qin X, Sun X, Zhang S, Zhao X, Yu Z, Li L (2015) Molecular docking and site-directed mutagenesis of a Bacillus thuringiensis chitinase to improve chitinolytic, synergistic Lepidopteran-larvicidal and nematicidal activities Int J Biol Sci 11(3): 304-315 Park SH, Koo BT, Shin BS, Choi SK, Jeong YM, Pan JG and Kim JI (1997) Characterization of 1925 Bacillus thurrigiensis isolates from plants in Korea Kor J Appl Microbiol Biotechnol 25(2): 159-165 Trịnh Thị Thu Hà, Đồng Văn Quyền, Đặng Văn Tiến, Ngô Đình Bính (2014) Phân lập gen mã hóa endochitinase từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis serovar kurstaki Hà Nội Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 12(4): 757-763 Pechsrichuang P, Songsiriritthigul C, Haltrich D, Roytrakul S, Namvijtr P, Bonaparte N, Yamabhai M (2016) OmpA signal peptide leads to heterogenous secretion of B subtilis chitosanase enzyme from E coli expression system Springerplus 5(1): 1200 doi: 10.1186/s40064-016-2893-y Harighi MJ, Zamani MR, Motallebi M (2007) Evaluation of antifugal activity of purified chitinase 42 from Trichoderma atroviride PTCC5220 Biotechnol 6(1): 2833 Yan R, Hou J, Ding D, Guan W, Wang C, Wu Z, Li M (2008) In vitro antifungal activity and mechanism of action of chitinase against four plant pathogenic fungi J Basic Microbiol 48(4): 293–301 EXPRESSION AND PURIFICATION OF RECOMBINANT CHITINASE BACILLUS THURINGIENSIS SEROVAR KURSTAKI IN ESCHERICHIA COLI FROM Trinh Thi Thu Ha1,2, Dong Van Quyen1,2, Ngo Dinh Binh1 Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology Graduate University of Science and Technology, Vietnam Academy of Science and Technology SUMMARY Bacillus thuringiensis is a Gram-positive soil bacterium that is known to be a bacterial biopesticide that produces insecticidal proteins called crystal proteins (Cry) Chitinase, an enzyme produced by B thuringiensis, facilitate the invasion of Cry proteins into epithelial membranes and lead to cell death by forming ionic pores on the cell membranes Previously, we have isolated a B thuringiensis serovar kurstaki (Btk) strain MSS1.1 showing high chitinase activities This BtK strain has been used to produce biopesticides, however it showed some limitations such as high cost and difficult to increase the biosynthesis of chitinase - a key enzyme in antifulgal and pesticidal activities of B thuringiensis In this study, we cloned and expressed a chitinase gene (chiA) from BtK in Escherichia coli The recombinant Chitinase (rChiA) was expressed in a soluble form and successfully purified by ProBond™ Nickel-Chelating Resin (Thermo fisher scientific) under native condition and its bioactivities was also characterized The chitinase activity of rChiA was 1.26 times higher than the native enzyme The rChiA revealed tocixity against pathogenic fungi F.oxysporum and R solani but has no 578 Tạp chí Công nghệ Sinh học 15(3): 571-579, 2017 effect on Mucor sp In addition, the rChiA showed increased larval insecticidal synergism activity of Cry proteins to Plutella xylostella and Spodoptera litura When using rChiA combined with crystal proteins from SP10.6 strain, the killing time was reduced from 72 hours to 48 hours (100% lethal rate for Plutella xylostella and 84.3% for Spodoptera litura), the LC50 value decreased by 8.04% and 6.80% toward Plutella xylostella and Spodoptera litura, respectively Keywords: antifugi, lethal concentration 50%, crytal protein, recombinant protein, protein purification, expression vector 579 ... Protein tổng số từ E coli không mang gen chiA, Đệm chiết protein tinh sạch) , Protein trước tinh sạch, Protein sau tinh Tinh protein chitinase tái tổ hợp Như trình bày trên, rChiA biểu dạng hòa... Đã biểu thành cơng gen chiA mã hóa protein chitinase từ chủng vi khuẩn Btk MSS1.1 E coli Chitinase tái tổ hợp thu dạng tan có hoạt tính cao gấp 1,26 lần so với chitinase tự nhiên rChiA sau tinh. .. hóa endochitinase từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis serovar kurstaki Hà Nội Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 12(4): 757-763 Pechsrichuang P, Songsiriritthigul C, Haltrich D, Roytrakul S, Namvijtr P,