Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết trình bày kết quả nghiên cứu sự phân bố của vi khuẩn ưa kiềm, chịu mặn từ các vùng biển của Vịnh Bắc Bộ, tuyển chọn chủng có hoạt tính cao để sản xuất Proteaza kiềm chịu mặn.
27(3): 72-81 Tạp chí Sinh học 9-2005 Nghiên cứu vi sinh vật a kiềm a mặn sinh proteaza kiềm nớc biển Vịnh bắc bộ, Việt Nam Lê Gia Hy, Lại Thanh Tùng, Phạm Thị Bích Hợp Viện Công nghệ sinh học Trên giới, việc ứng dụng chế phẩm enzym ngành công nghiệp chế biến thực phẩm ngày phát triển rộng r i Trong 10 năm trở lại đây, thị trờng tăng lên khoảng 70% năm [1]; đặc biệt, proteaza đợc dùng nhiều công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, chế biến sữa, sản xuất nớc mắm [3] Ngoài ra, proteaza đợc sử dụng công nghiệp bánh kẹo, phân giải nguyên liệu protein giá trị thành peptit axit amin dễ hấp thụ để làm thức ăn cho động vật [2] công nghiệp thuộc da mỹ phẩm Hơn nữa, việc bổ sung loại enzym chịu kiềm, chịu mặn vào chất tẩy rửa để sử dụng cho vùng nớc biển cần thiết Ngày nay, proteaza không đợc sản xuất từ động vật thực vật mà đợc sản xuất từ vi sinh vật,bởi vi sinh vật có khả sinh tổng hợp proteaza cao ngày chiếm u nguồn cung cấp vô tận, rẻ tiền Việc nghiên cứu hệ vi sinh vật biển nớc ta cha đợc ý nhiều, diƯn tÝch biĨn cđa ViƯt Nam lµ rÊt lớn Trong này, trình bày kết nghiên cứu phân bố vi khuẩn a kiềm, chịu mặn từ vùng biển Vịnh Bắc Bộ, tuyển chọn chủng có hoạt tính cao để sản xuất proteaza kiềm chịu mặn I phơng pháp nghiên cứu Vật liệu Các mẫu nớc biển đợc lấy vùng biển khác thuộc Vịnh Bắc Bộ theo quy trình lấy mẫu nớc biển Phần thu thập mẫu nớc biển đợc thực Phòng Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Phân viện Hải dơng học Hải Phòng Các mẫu nớc biển đợc ký hiệu nh bảng Bảng Các mẫu nớc biển thu thập từ vùng biển Vịnh Bắc Bộ Mẫu 10 11 12 Ký hiÖu CT1 CT3 CT3* MC QL1 VC VM CL3 SS BL CL ĐS Địa điểm Điểm 1-Vịnh Cô Tô-tầng mặt Điểm 3-Vịnh Cô Tô-tầng mặt Điểm 3-Vịnh Cô Tô-tầng đáy Điểm 2-Minh Châu Quán Lạn Vạn Cảnh-Ngọc Vừng Vạn Mỹ-Đông Hng Cửa Lò Sầm Sơn Bà Lạt Cửa Lục Đồ Sơn Công trình đợc hỗ trợ kinh phí Chơng trình nghiên cứu 72 Môi trờng nuôi cấy vi sinh vật M«i tr−êng nu«i cÊy vi sinh vËt −a kiỊm AM-1 AM-2 [2] đợc thực nh sau: thành phần môi trờng đợc hòa tan vào lít nớc, sư dơng Na CO ®Ĩ ®iỊu chØnh ®Õn pH = 10 vµ trïng ë atm kÐo dài 45 phút Sau trùng, môi trờng đặc đợc phân vào hộp petri ống nghiệm để phân lập bảo quản giống, môi trờng lỏng đợc phân vào bình tam giác với tỷ lệ 10% thể tích bình để nuôi cấy chìm Phơng pháp nghiên cứu a Xác định thành phần số lợng nhóm vi sinh vật Số lợng nhóm vi sinh vật đợc xác định theo phơng pháp pha lo ng tới hạn nuôi môi trờng thạch tơng ứng với loại vi sinh vật Số lợng vi sinh vật đợc tính theo công thức sau: N= (n + n 10 −1 ∑C ) + + nn 10n1 d.m (tế bào/ml) Trong đó: C: tổng số khuẩn lạc đếm đợc tất hộp petri n1: sè khuÈn l¹c hép petri ë tû lệ pha lo ng lần n2: số khuẩn lạc hép petri ë tû lƯ pha lo ng lÇn nn: sè khuÈn l¹c hép petri ë tû lƯ pha lo ng lÇn n d: tû lƯ pha lo ng lần m: khối lợng mẫu ban đầu (g) b Hình dạng vi sinh vật Vi khuẩn đợc nhuộm gram, xạ khuẩn nấm mốc đợc quan s¸t trùc tiÕp d−íi kÝnh hiĨn vi quang häc có độ phóng đại 400-800 lần c Hoạt tính thuỷ phân protein Hoạt tính proteaza sơ đợc xác định phơng pháp cấy chủng vi sinh vật đĩa thạch, sau đột cục thạch có vi sinh vật phát triển chuyển sang môi trờng có cazein Sau ủ qua đêm, màu thuốc thử tricloaxetic đo vòng phân giải xung quanh cục thạch Hoạt tính proteaza chủng a kiềm đợc nuôi môi trờng lỏng (AM1) máy lắc 200 v/p 24ữ48 giờ, nhiệt độ nuôi cấy: 28ữ30C Sau dịch nuôi đợc ly tâm 10.000 v/p phút để loại bỏ sinh khối Nhỏ 200àl dịch enzym thô vào lỗ thạch có đờng kính 10mm hộp petri chøa m«i tr−êng cã cazein Sau đ ë nhiƯt độ 40C 24 giờ, đo vòng phân giải xung quanh lỗ thạch d Hoạt độ proteaza đợc xác định theo phơng pháp Babakina Các chủng vi khuẩn đợc nuôi cấy môi trờng lỏng AM-1 máy lắc 220 vòng/phút kéo dài 48 đến 72 Sau ly tâm 10.000 v/p kéo dài phút để loại bỏ sinh khối, dịch ly tâm đợc xác định hoạt tính proteaza phơng pháp Babakina [10] Khả sinh tổng hợp proteaza chủng đợc đánh giá thông qua hoạt độ proteaza có ml dịch enzym thô Một đơn vị hoạt độ proteaza (HdP) lợng enzym thủy phân cazein tới mức làm cho khả liên kết với HCl giảm lợng 1ml HCl 0,1 N sau xử lý nhiệt độ 40C, độ pH 8,0ữ8,2 Hoạt độ proteaza theo phơng pháp Babakina 1g 1ml chế phẩm enzym đợc tính theo công thức sau: HdP = a.50 10b k (đvhd) đây, a hiƯu sè ®óng cđa sè ml NaOH 0,1N ® dïng chuẩn mẫu thí nghiệm mẫu đối chứng Cách tìm: lÊy a (sè ml NaOH 0,1 N ® dïng chuÈn mÉu thÝ nghiƯm) trõ ®i a k (sè ml NaOH ® dïng chn mÉu kiĨm tra) HiƯu sè thu ®−ỵc đem so sánh bảng tìm hiệu số 50: số ml hỗn hợp đem lọc (gồm 20ml cazein 5% + 10 ml dÞch chiÕt enzym + 10 ml HCl + 10 ml Na2SO4) 10: sè ml n−íc lọc đ lấy chuẩn độ 73 b: lợng chế phẩm enzym cã 10ml n−íc chiÕt enzym k: hƯ sè hiệu chỉnh dung dịch kiềm Để tính độ hoạt động 1g chế phẩm enzym khô tuyệt đối, ta nhân kết thu đợc với tỷ số 100 Hệ sè hiƯu chØnh dung 100 − ϕ dÞch kiỊm k = 0,99 ®é Èm cđa vËt phÈm men ϕ = 100% II Kết thảo luận Thành phần số lợng vi sinh vật nớc biển Vịnh Bắc Bộ Trong nớc, có nhiều loại vi sinh vËt: vi khuÈn, nÊm men, nÊm mèc, x¹ khuÈn nh−ng nhiều vi khuẩn Trong nớc biển, nồng độ muối cao nhng số lợng vi khuẩn Có khoảng vài chục đến vài nghìn vi khuẩn mililít nớc biển [5] Trong nớc biển, vi khuẩn a mặn, có nhiều loại vi khuẩn khác Thờng nớc biển chứa trực khuẩn có bào tử (Bacillus) không bào tử (Bacterium), có cầu khuẩn, niêm vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men nấm mốc [5] Kết phân tích thành phần số lợng nhóm vi sinh vật nớc biển Vịnh Bắc Bộ (bảng 2) cho thấy phân bố c¸c nhãm vi sinh vËt n−íc biĨn kh¸ phong phú đa dạng Bảng Thành phần số lợng nhóm vi sinh vật mẫu nớc biển lấy từ vùng biển Vịnh Bắc Bộ (CFU/ml) MÉu Ký hiÖu 10 11 12 CT1 CT3 CT3* MC QL1 VC VM CL3 SS BL CL §S Vi khuÈn hiÕu khÝ 3.103 5.102 5.10 1.102 1.104 1.10 4.105 2.105 4.104 2.103 4.105 5.105 Vi khuẩn kỵ khí 2,5.10 0 0 1,6.10 1.102 0 2.102 1,5.10 Hầu hết nhóm vi sinh vật xuất hiện; số lợng cao vi khuẩn, sau đến nấm mốc xạ khuẩn Tuy nhiên, nhìn chung, số lợng vi sinh vật tổng số mẫu nớc biển thuộc loại trung bình Đánh giá hàm lợng chất hữu có mẫu nớc nhìn chung thấp Chất rắn tổng số có mẫu nớc biển từ 0,0113 đến 0,0382 g/l chất rắn hòa tan từ 0,00308 đến 0,03216 g/l Do tính đa dạng vi sinh vật biển, đặc biệt nhiều loài vi sinh vật biển cho chất có hoạt tính sinh học quý, nên cần quan tâm nghiên cứu nhiều để bảo vệ tính đa dạng vi sinh vËt biĨn, 74 X¹ khn NÊm mèc NÊm men 0 4.102 0 4.103 1.10 2.102 4.103 2.102 0 2.103 4.105 4.103 2.105 1.10 0 4.102 4.102 4.10 4.102 2.10 2,2.102 0 0 2,2.102 0 0 b¶o vƯ ngn gien quý hiếm, bảo vệ sinh thái biển đây, sâu nghiên cứu khả a kiềm, a mặn sinh tổng hợp proteaza vi khuẩn biển, nhằm tạo chủng sinh proteaza cao để sử dụng công nghiệp sản xuất enzym bảo vệ môi trờng Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn chịu kiềm Trên môi trờng AM-1, đ tuyển chọn đợc 50 chủng vi khuẩn a kiềm Kết nghiên cứu đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn a kiềm đ tuyển chọn đợc trình bày bảng kết khảo sát khả phát triển chủng vi khuẩn đợc trình bày bảng Bảng Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn a kiềm phân lập đợc từ vùng biển Vịnh Bắc Bộ Mẫu Chủng CT1 Màu sắc Độ đồng Tính tạo sắc tố Tròn Trắng Có Không Bề mặt Không bóng, lồi giữa, mép phẳng Không bóng, lồi mép xù xì Phẳng, bóng, mép phẳng Bóng, lồi giữa, mép phẳng 1ữ4 Tròn Trắng Có Không 4ữ5 Tròn Nâu vàng Có Không 1ữ4 Tròn Có Không 1ữ5 Tròn Có Không 3ữ4 Tròn Trắng Có Không Tròn Trắng Có Không Tròn Trắng Có Không Tròn Trắng Có Không Bóng, lồi mép phẳng Bóng, nhẵn, mép phẳng Mép phẳng, bóng, bề mặt nhẵn Nhẵn, mép phẳng Tròn Trắng Có Không Bóng, mép phẳng Tròn Tròn Trắng Trắng Vàng da cam đậm Da cam nhạt Trắng nhờ Có Có Không Không Không Không Xù xì, mép phẳng Nhẵn, mép lợn Bóng, mép phẳng, lồi Có Không Phẳng, mép phẳng Có Không Phẳng, mép xù xì Vàng chanh Trắng suốt Mép phẳng, lồi Dạng điểm Dạng điểm 2 3ữ5 Tròn Dạng điểm Hình thoi 1ữ9 Tròn 1ữ3 Tròn Trắng Có Không 1ữ5 Tròn Trắng bóng Có Không Dạng điểm Tròn Trắng Có Không Phẳng, mép phẳng 2ữ5 Tròn Có Không Khô, lõm giữa, mép xù xì 3ữ5 Tròn Có Không Phẳng, mép phẳng 3ữ5 Tròn Không Không Lõm giữa, mép phẳng 2 CM QL1 VC 1ữ5 Hình dạng CT3 CT3* Đờng kính (mm) Trắng Trắng đục Da cam đậm Bóng, lồi giữa, mép phẳng Bóng, lồi giữa, mép phẳng 75 Có Không Lồi cao, bóng, mép phẳng, Có Không Phẳng, mép phẳng Có Không Lõm, mép phẳng Có Không Có Không Trắng Có Không Tròn Trắng Có Không