Đang tải... (xem toàn văn)
. Nhân trần cát (Adenosma indianum (Lour.) Merr.) là một loại cây dược liệu có giá trị phân bố ở một số vùng đất cát ven biển nhưng hiện nay đã không còn phổ biến. Để duy trì nguồn giống loại cây này, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu tái sinh chồi in vitro cây nhân trần cát thông qua sự phát sinh callus. Kết quả nghiên cứu cho thấy thời gian thích hợp để khử trùng mẫu lá, thân cây nhân trần cát là 10 phút, mẫu cuống lá là 6 phút với tỷ lệ mẫu nhiễm lần lượt là 18,52 %; 7,04 % và 0,00 %. Môi trường thích hợp để tạo callus từ lá là MS cơ bản có bổ sung 0,30 mg/l NAA, tạo callus từ cuống lá 0,20 mg/l IBA và từ đoạn thân là 0,50 mg/l NAA; tỷ lệ tạo callus lần lượt là 80,55 %, 66,67 % và 76,39 %. Môi trường MS cơ bản bổ sung 0,50 mg/l BAP và 0,10 mg/l NAA thích hợp để tạo chồi từ callus, tỷ lệ tạo chồi là 43,52 % và số chồi/callus là 3,43.
Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa họ c Tự nhiên; ISSN 1859–1388 Tập 127, Số 1C, 2018, Tr 53–60; DOI: 10.26459/hueuni-jns.v127i1C.4891 NGHIÊN CỨU TÁI SINH CHỒI CÂY NHÂN TRẦN CÁT (Adenosma indianum (Lour.) Merr.) THÔNG QUA NUÔI CẤY CALLUS Hoàng Tấn Quảng1,*, Trần Thị Diệu2, Lê Thị Lệ Quyên3, Phạm Thị Diễm Thi1, Trương Thị Hồng Hải1, Trần Quốc Dung3 Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế, Tỉnh lộ 10, Phú Thượng, Phú Vang, Thừa Thiên Huế, Việt Nam Trường đại học Nông Lâm, Đại học Huế, 102 Phùng Hưng, Huế, Việt Nam Trường đại học Sư phạm, Đại học Huế, 32 Lê Lợi, Huế, Việt Nam Tóm tắt Nhân trần cát (Adenosma indianum (Lour.) Merr.) loại dược liệu có giá trị phân bố số vùng đất cát ven biển khơng phổ biến Để trì nguồn giống loại này, chúng tơi tiến hành nghiên cứu tái sinh chồi in vitro nhân trần cát thông qua phát sinh callus Kết nghiên cứu cho thấy thời gian thích hợp để khử trùng mẫu lá, thân nhân trần cát 10 phút, mẫu cuống phút với tỷ lệ mẫu nhiễm 18,52 %; 7,04 % 0,00 % Mơi trường thích hợp để tạo callus từ MS có bổ sung 0,30 mg/l NAA, tạo callus từ cuống 0,20 mg/l IBA từ đoạn thân 0,50 mg/l NAA; tỷ lệ tạo callus 80,55 %, 66,67 % 76,39 % Môi trường MS bổ sung 0,50 mg/l BAP 0,10 mg/l NAA thích hợp để tạo chồi từ callus, tỷ lệ tạo chồi 43,52 % số chồi/callus 3,43 Từ khóa: Adenosma indianum, callus, dược liệu, khử trùng, tái sinh chồi Đặt vấn đề Cây nhân trần cát (Adenosma indianum (Lour.) Merr.), tên thường gọi chè nội, chè cát, chè tạng, bồ bồ, nhân trần ta loài thực vật có hoa họ hoa mõm sói (Scrophulariaceae) Đây loại dược liệu có vị cay, đắng, mùi thơm, tính ơn nhẹ, có tác dụng diệt giun, gây tăng tiết mật, tăng cường chức thải chất độc gan Bên cạnh đó, có tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn, ức chế phát triển khuẩn Shigella dysenteriae, Sh shigae, Staphylococcus aureus 209P Streptococcus hemolyticcus S84, giảm phân tiết dịch vị, giảm độ acid tự acid toàn phần dày Cây dùng để chữa sốt, cảm cúm, viêm gan vàng da, tiêu hóa kém, viêm ruột, đau bụng, thuốc kích thích ăn ngon cho phụ nữ sau sinh [1, 4, 6] Cây nhân trần cát trước phổ biến đất nước ta, thường gặp bờ ruộng, rừng thưa rụng lá, nơi đất trống có cát cỏ, đầm lầy đất ẩm Tuy nhiên, năm gần đây, số lượng giảm mạnh số hoạt động người mở * Liên hệ: htquang@hueuni.edu.vn Nhận bài: 23–7–2018; Hoàn thành phản biện: 5–8–2018; Ngày nhận đăng: 9–8–2018 Hoàng Tấn Quảng CS Tập 127, Số 1C, 2018 rộng đất canh tác, chuyển đổi trồng… làm môi trường sống Nhân trần cát trở thành loại dược liệu cần bảo vệ để tránh nguy trở nên khan [3] Để nhân giống nhân trần cát, số nơi bắt đầu trồng thử nghiệm phương pháp nhân giống truyền thống gieo hạt, giâm cành… thường cho tỷ lệ sống không cao nhiễm bệnh Hơn nữa, hạn chế nguồn giống góp phần làm giảm hiệu phương pháp nhân giống truyền thống Đối với nhân trần cát, việc nhân giống kỹ thuật ni cấy mơ tế bào chưa có nhiều nghiên cứu công bố Trên đối tượng nhân trần khác, Tu cs thành công nhân giống in vitro nhân trần A glutinosum thông qua giai đoạn callus [7] Do đó, chúng tơi thực nghiên cứu nhằm xác định khả nhân giống nhân trần cát thông qua giai đoạn callus Đối tượng phương pháp 2.1 Đối tượng liệu Đối tượng nghiên cứu nhân trần cát (A indianum) thu thập vùng đất cát Hải Dương, Hải Lăng, Quảng Trị (Hình 1) Mẫu vật sử dụng nghiên cứu lá, cuống đoạn thân từ tự nhiên khỏe mạnh 2.2 Phương pháp Ảnh hưởng thời gian khử trùng mẫu đến tỷ lệ sống nhân trần cát Lá, cuống đoạn thân (1–2 cm) nhân trần cát rửa nhiều lần vòi nước chảy, cắt bỏ bị hỏng phần không cần thiết, lấy lá, cuống đoạn thân dài 1–2 cm cho vào bình Rửa nước cất lần, lần/2 phút Tiếp tục khử trùng HgCl2 0,10 % 5–10 phút Rửa nước cất vô trùng 3–4 lần trước cấy vào môi trường MS (Murashige Skoog) [5] có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng theo cơng thức thí nghiệm cụ thể Tỷ lệ mẫu nhiễm đánh giá sau tuần ni cấy Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng lên khả cảm ứng tạo callus Lá, cuống đoạn thân sau khử trùng đặt lên giấy thấm vô trùng, dùng dụng cụ vơ trùng cắt bỏ phần bị tổn thương hóa chất Cấy mẫu lên môi trường dinh dưỡng MS bổ sung IBA nồng độ 0,10–0,50 mg/l; NAA nồng độ 0,10–0,50 mg/l riêng lẻ phối hợp với BAP nồng độ 0,50 mg/l để thăm dò khả tạo callus mẫu nuôi cấy [7] Khả tạo callus đánh giá sau tuần nuôi cấy Các loại môi trường sử dụng cho nuôi cấy điều chỉnh pH đến 5,8 khử trùng nhiệt độ 121 °C, áp suất atm 15 phút Các thí nghiệm nuôi cấy thực 25±2 °C, cường độ chiếu sáng khoảng 2000 lux thời gian chiếu sáng 10–12 giờ/ngày 54 jos.hueuni.edu.vn Tập 127, Số 1C, 2018 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả tái sinh chồi từ callus Callus có nguồn gốc từ (khoảng 0,5 cm) cấy chuyển lên môi trường MS bổ sung BAP nồng độ 0,50 mg/l NAA nồng độ 0,10–0,50 mg/l [7] Số chồi tái sinh ghi nhận sau tuần nuôi cấy Xử lý số liệu Các thí nghiệm bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên, thí nghiệm lặp lại lần Kết thí nghiệm tính trung bình phân tích ANOVA với Duncan’s test (p < 0,05) phần mềm SPSS 17.0 Kết thảo luận 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng mẫu đến tỷ lệ sống nhân trần cát Mẫu (lá, cuống lá, đoạn thân) nhân trần cát cấy lên môi trường MS bổ sung 0,10–0,50 mg/l IBA 0,10–0,50 mg/l NAA để tạo callus Sau tuần theo dõi với khoảng thời gian khử trùng khác nhau, thu kết tỷ lệ nhiễm mẫu Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng mẫu trình bày Bảng Kết nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mẫu nhiễm ở phút cao (61,11 %), giảm đáng kể tăng thời gian khử trùng lên phút có tỷ lệ nhiễm thấp khử trùng 10 phút (18,52 %), lúc mẫu bắt đầu có dấu hiệu chết (chiếm 5,56 %) Đối với mẫu thân, kết tốt thu sau 10 phút khử trùng, tỷ lệ mẫu nhiễm thấp (7,40 %) mẫu chết Đối với cuống lá, thời gian khử trùng phút phù hợp Bảng Ảnh hưởng thời gian khử trùng mẫu đến tỷ lệ sống nhân trần cát Thời gian Lá Thân Cuống khử trùng Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ mẫu (phút) nhiễm (%) chết (%) nhiễm (%) chết (%) nhiễm (%) chết (%) 61,11a 0,00a 55,56a 0,00 11,11a 0,00b 24,07b 0,00a 31,48b 0,00 0,00b 0,00b 21,30bc 0,00a 27,78b 0,00 0,00b 0,00b 10 18,52c 5,56a 7,40c 0,00 0,00b 13,89a Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p < 0,05 (Duncan’s test) Các thích dùng chung cho bảng 2–5 55 Hoàng Tấn Quảng CS 3.2 Tập 127, Số 1C, 2018 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng lên khả hình thành callus Ảnh hưởng loại chất điều hòa sinh trưởng riêng lẻ Sau khử trùng mẫu HgCl2, mẫu cấy lên mơi trường MS chứa chất điều hòa sinh trưởng nhóm auxin IBA NAA có nồng độ 0,10–0,50 mg/l để thăm dò khả tạo callus Kết trình bày Bảng cho thấy tất môi trường thử nghiệm callus bắt đầu hình thành sau gần tuần cảm ứng Callus ban đầu xuất vết cắt, có màu vàng nhạt sau chuyển sang màu xanh lục (Hình 1) So với IBA, NAA có khả cảm ứng tạo callus nhân trần cát tốt Đối với mẫu lá, tỷ lệ tạo callus lên tới 80,55 % (NAA nồng độ 0,30 mg/l), mẫu cuống 58,93 % mẫu thân 76,39 % (NAA nồng độ 0,50 mg/l) Như vậy, môi trường MS có bổ sung 0,30 mg/l NAA cho tỷ lệ tạo callus tốt đoạn thân, mơi trường có 0,3 mg/l IBA tạo callus tốt mẫu cuống Bảng Ảnh hưởng nồng độ IBA lên khả cảm ứng tạo callus Nồng độ IBA (mg/l) Tỷ lệ tạo callus (%) Lá Cuống Thân 0,10 33,33b 50,00c 41,67b 0,20 44,44ab 63,89a 44,44b 0,30 59,72a 66,67a 35,00b 0,40 56,94a 61,11a 38,89b 0,50 51,39ab 58,33b 66,67a Đối với chất điều hòa sinh trưởng IBA, mẫu cho tỷ lệ tạo callus cao 59,72 % nồng độ IBA 0,30 mg/l, mẫu cuống 66,67 % nồng độ 0,30 mg/l mẫu thân 66,67 % nồng độ 0,50 mg/l Bảng Ảnh hưởng nồng độ NAA lên khả cảm ứng tạo callus 56 Tỷ lệ tạo callus (%) Nồng độ NAA (mg/l) Lá Cuống Thân 0,10 72,22a 45,44q 38,08b 0,20 74,45a 48,61a 44,44ab 0,30 80,55a 48,61a 51,11ab 0,40 78,89a 51,81a 56,94ab 0,50 49,44b 58,93a 76,39a jos.hueuni.edu.vn Tập 127, Số 1C, 2018 Hình Cây nhân trần cát tự nhiên (A) callus hình thành mơi trường tối ưu (B từ đoạn thân, C từ mảnh lá, D từ cuống lá) Ảnh hưởng phối hợp chất điều hòa sinh trưởng Tu cs nghiên cứu khả tạo callus nhân trần A glutinosum Kết nghiên cứu cho thấy môi trường MS bổ sung BAP nồng độ 0,50 mg/l NAA nồng độ 0,10 mg/l 0,50 mg/l có tỷ lệ cảm ứng callus đạt 98,90 %, bổ sung 0,50 mg/l BAP NAA nồng độ 0,30 mg/l tỷ lệ cảm ứng đạt 100 % [7] Trong đó, He cs nhận thấy BAP kết hợp với IBA cho kết tốt trình nhân giống in vitro nhân trần A glutinosum [2] Dựa kết này, tiến hành nghiên cứu khả cảm ứng tạo callus kết hợp BAP 0,50 mg/l với NAA IBA nồng độ khác nhau, kết trình bày Bảng Kết nghiên cứu cho thấy khả cảm ứng tạo callus kết hợp chất điều hòa sinh trưởng thấp sử dụng riêng lẻ Trong loại mẫu ni cấy, mẫu có khả tạo callus nhiều nhất, đạt cao kết hợp BAP 0,50 mg/l NAA 0,20 mg/l, tỷ lệ tạo callus 42,86 % Mẫu thân có khả tạo callus cao, nhiên có cơng thức tạo callus 57 Hoàng Tấn Quảng CS Tập 127, Số 1C, 2018 Bảng Ảnh hưởng kết hợp BAP với NAA IBA lên khả cảm ứng tạo callus Chất điều hòa sinh trưởng (mg/l) Tỷ lệ tạo callus (%) BAP NAA IBA Lá Cuống Thân 0,50 0,10 – 41,18a 16,67b 37,50b 0,50 0,20 – 42,86a 0,00c 50,00a 0,50 0,30 – 23,53b 0,00c 0,00c 0,50 0,50 – 20,00b 0,00c 0,00c 0,50 – 0,10 16,67b 27,27a 0,00c 0,50 – 0,30 0,00c 0,00c 0,00c 0,50 – 0,50 0,00c 0,00c 0,00c So với nghiên cứu Tu cs [7], tỷ lệ cảm ứng callus A glutinosum nuôi cấy môi trường MS bổ sung BAP 0,50 mg/l NAA 0,10–0,50 mg/l cao A indianum nghiên cứu 3.3 Tái sinh chồi từ callus có nguồn gốc từ Trong nghiên cứu này, nhận thấy mẫu có tỷ lệ tạo callus cao nhất, vậy, chúng tơi tiếp tục sử dụng callus có nguồn gốc từ để tái sinh chồi in vitro Callus tạo thành q trình ni cấy in vitro cấy lên môi trường dinh dưỡng MS, bổ sung BAP với nồng độ 0,50 mg/l NAA có nồng độ 0,10–0,50 mg/l để khảo sát tái sinh chồi từ callus Kết nuôi cấy sau tuần trình bày Bảng Kết trình bày Bảng cho thấy callus tất cơng thức thí nghiệm có khả tái sinh thành chồi Môi trường bổ sung 0,50 mg/l BAP 0,10 mg/l NAA có khả tạo chồi từ callus cao hẳn so với mơi trường lại: tỷ lệ 43,52 %, số chồi/callus 3,43 Chồi tạo thành sinh trưởng tốt, có màu xanh đậm (Hình 2) Các mơi trường có nồng độ NAA cao cho khả tái sinh chồi thấp hơn, nồng độ NAA cao khả tái sinh thấp, chồi sinh trưởng kém, màu xanh nhạt Bảng Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng lên khả tái sinh chồi từ callus Chất điều hòa sinh trưởng (mg/l) 58 Khả tái sinh chồi BAP NAA Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi/callus (chồi) 0,50 0,10 43,52a 3,43a 0,50 0,20 22,22ab 1,83ab 0,50 0,30 13,89b 1,60ab 0,50 0,50 6,48b 0,49b jos.hueuni.edu.vn Tập 127, Số 1C, 2018 Hình Chồi tái sinh mơi trường MS bổ sung 0,50 mg/l BAP 0,10 mg/l NAA (A) hay 0,30 mg/l NAA (B) Trong nghiên cứu nhần trần A glutinosum mình, Tu cs nhận thấy công thức bổ sung 0,50 mg/l BAP 0,01 mg/l NAA thu 7,2 chồi/callus, cao gấp đôi nghiên cứu chúng tơi [7] Như vậy, thấy điều kiện nuôi cấy, khả nhân giống in vitro A glutinosum cao A indianum Kết luận Chúng thành công việc tái sinh chồi nhân trần cát thông qua giai đoạn callus Thời gian thích hợp để khử trùng mẫu lá, thân nhân trần cát 10 phút, mẫu cuống phút Mơi trường thích hợp để tạo callus từ MS có bổ sung 0,30 mg/l NAA, tạo callus từ cuống 0,20 mg/l IBA từ đọan thân 0,50 mg/l NAA Môi trường MS bổ sung 0,50 mg/l BAP 0,10 mg/l NAA thích hợp để tạo chồi từ callus Tài liệu tham khảo Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiền, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mân, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2006), 1000 thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội He L C., Xuan L., Hua X G (2010), Tisue culture and rapid propagation of Adenosma glutinosum (L.) Druce Plant Physiology Journal, 46(6): 601–602 Phạm Thị Lành, Trần Thị Ê Ly, Lê Phương Nhật (2015), Nghiên cứu đặc điểm sinh học khả tái sinh tự nhiên nhân trần (Adenosma indiana (Lour.) Merr.) xã Hải Dương, huyện Hải Lăng, tỉnh Quảng Trị Kỷ yếu hội nghị khoa học sinh viên năm học 2015–2016, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế: 61–62 Đỗ Tất Lợi, (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội Murashige T., Skoog F (1962), A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures Physiologia Plantarum, 15(3): 473–497 59 Hoàng Tấn Quảng CS Tập 127, Số 1C, 2018 Dương Thị Hồng Nhung (2015), Nghiên cứu thành phần hóa học họat tính sinh học loài bồ bồ (Adenosma indiana (Lour) Merr.) phân bố địa bàn huyện Đại Từ – tỉnh Thái Nguyên Luận văn Thạc sĩ Khoa học vật chất, Trường đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên Tu R P., Hu J Y., Ji Q Q., Xia G H., Zheng B S (2012), Highly efficient in vitro adventitious shoot regeneration of Adenosma glutinosum (Linn.) Druce using leaf explants African Journal of Biotechnology, 11(29): 7542–7548 IN VITRO SHOOT REGENERATION OF Adenosma indianum (Lour.) Merr THROUGH CALLUS INDUCTION Hoang Tan Quang1,*, Tran Thi Dieu2, Le Thi Le Quyen3, Pham Thi Diem Thi1, Truong Thi Hong Hai1, Tran Quoc Dung3 Institute of Biotechnology, Hue University, Road No 10, Phu Vang, TTHue, Vietnam University of Agriculture and Forestry, Hue University, 102 Phung Hung St., Hue, Vietnam University of Education, Hue University, 32 Le Loi St., Hue, Vietnam Abstract Adenosma indianum (Lour.) Merr is a valuable medicinal plant distributed in coastal sandy areas but is no longer popular This paper presents the results of in vitro shoot regeneration of Adenosma indiana (Lour.) Merr through callus induction The samples (leaf pieces, petioles and stems) were sterilized with HgCl2 0.1 % from to 10 minutes The suitable effective sterilization time is 10 for leaves and stems and for petioles with the contamination rate of 18.52 %, 7.04 % and 0.00 %, respectively The medium for callus formation from leaves was basal MS supplemented with 0.30 mg/l NAA, from petioles was 0.20 mg/l IBA and from stems was 0.50 mg/l NAA with the ratio of callus formation of 80.55 %, 66.67 % and 76.39 %, respectively The basal MS medium supplemented with 0.50 mg/l BAP and 0.10 mg/l NAA was suitable for shoot generation from callus The shoot forming ratio was 43.52 % with an average of 3.43 shoots/callus Keywords: Adenosma indianum, callus, medicinal plant, shoot regeneration, sterilization 60 ... nhân giống in vitro nhân trần A glutinosum thông qua giai đoạn callus [7] Do đó, chúng tơi thực nghiên cứu nhằm xác định khả nhân giống nhân trần cát thông qua giai đoạn callus Đối tượng phương... Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng lên khả tái sinh chồi từ callus Chất điều hòa sinh trưởng (mg/l) 58 Khả tái sinh chồi BAP NAA Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi/ callus (chồi) 0,50 0,10 43,52a... 7,2 chồi/ callus, cao gấp đôi nghiên cứu chúng tơi [7] Như vậy, thấy điều kiện nuôi cấy, khả nhân giống in vitro A glutinosum cao A indianum Kết luận Chúng thành công việc tái sinh chồi nhân trần