Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết nghiên cứu giám định loài sán lá phổi Paragonimus Heterotremus Chen ET Hisa, 1964 ở Việt Nam bằng phương pháp sinh học phân tử. Để nắm chi tiết nội dung nghiên cứu mời các bạn cùng tham khảo bài viết.
25(1): 39-44 3-2003 Tạp chí Sinh học Giám định loài s¸n l¸ phỉi Paragonimus heterotremus Chen et Hsia, 1964 ë việt nam phơng pháp sinh học phân tử Lê hòa, nguyễn bích nga Viện Công nghệ sinh học Nguyễn Văn Đề, Lê Đình Công Viện Sốt rét, Ký sinh trùng Côn trùng trung ơng đặng tất Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Hiện nay, giới có khoảng 50 loài sán phổi đ đợc xác định thuộc giống Paragonimus Braun, 1899 (tên ®ång nghÜa: Paragonimus Chen, 1963) vµ gièng cã quan hƯ họ hàng với Paragonimus Euparagonimus Chen, 1962 Các loài sán phổi có phân bố rộng, gồm châu (bao gồm phía Đông, từ Pakistan đến §«ng Nam n−íc Nga, ë phÝa Nam, tõ Xri Lanka đến Inđônêxia Papua Niu Ghinê), châu Mỹ (bao gồm Canađa phía Bắc, Brazin Pêru Nam Mỹ) toàn châu Phi [3] Những trờng hợp ngời bị nhiễm sán phổi thuộc giống Paragonimus đợc xác nhận Việt Nam vào năm 1993 Sìn Hồ (Lai Châu) nguyên nhân gây bệnh Paragonimus heterotremus [4, 6] Mặc dù P heterotremus đợc coi nguyên nhân gây bệnh sán phổi (paragonimiasis) Việt Nam, nhng việc xác định vào hình thái học đặc tính gây bệnh động vật thí nghiệm Vấn đề đặt liệu loài Paragonimus sp đợc xác định hình thái học nói có phải P heterotremus hay không? Vì vậy, việc giám định xác để có kết luận cuối loài cần thiết để thức công bè nÕu thùc sù cã Ýt nhÊt sù tån t¹i P heterotremus Việt Nam Các kết giám định tạo sở khoa học cho việc giám định loài Paragonimus khác (nếu có) chủng khác P heterotremus Các phơng pháp phân loại giám định sinh vật dựa thị phân tử ADN đ đợc phát triển ứng dụng rộng r i, với nguyên lý dựa vào đặc điểm thay đổi kiểu gien mức độ phân tử thay cho phân biệt thay đổi hình thái (kiểu hình) [2, 7] Độ tin cậy phơng pháp phân tử cao, cha có biến đổi kiểu hình, cần mẫu vật, hoàn toàn không phụ thuộc vào giai đoạn phát triển cá thể sinh vật Do vậy, việc giám định phân tử phù hợp đợc ứng dụng để phân biệt loài ký sinh trùng, đặc điểm hình thái chúng khó nhận biết động vật bậc cao [5] Hiện nay, toàn chuỗi ADN hệ gien ty thĨ (mitochondrial DNA - mtDNA) cđa nhiỊu loµi sán dẹt, có sán phổi (loài P westermani, Ngân hàng Gen: AF219379) đ đợc xác định, nh có nhiều chuỗi nucleotit nhiều loài Paragonimus khác, tạo điều kiện thuận lợi cho giám định phân tử [1, 2] Trong nghiên cứu này, đ sử dụng phơng pháp giám định loài có độ tin cậy cao sở trình tự gien ty thể thức xác nhận có mét loµi lµ Paragonimus heterotremus Chen et Hsia, 1964, tån gây bệnh Việt nam, khẳng định việc công bố trớc loài Kino cs [4] I phơng pháp nghiên cứu Mẫu vật sán phổi Mẫu vật sán phổi trởng thành đợc thu nhận từ hai tỉnh Lai Châu (ký hiệu PLCVN) Sơn La (PSLVN) Đây loài mà qua kiểm tra phơng pháp hình thái học đợc công bố 39 Paragonimus heterotremus [4] Các mẫu vật đợc bảo quản cồn 70o, cất giữ nhiệt ®é -20oC, cho ®Õn sư dơng 35 chu kú tiÕp theo: 94oC - phót, 52oC - vµ 72oC - phót, chu kú ci kÐo dµi 10 phút 72oC Chọn chuỗi gien để so sánh Giải trình trình tự xử lý số liệu Cho đến nay, toàn hệ gien ty thể (mtDNA) Paragonimus westermani (Ngân hàng Gen, AF219379), chuỗi nucleotit khác nhiều loài Paragonimus khác gien cytochrome oxidase (cox1) chúng đợc thu nhận phản ứng nhân gien PCR (polymerase chain reaction) Chúng chọn gien cox1 gien có độ bảo tồn cao hệ gien ty thể [7] để làm số liệu so sánh giám định loài Paragonimus sp Việt nam Sản phẩm PCR đợc tinh chế hoá chất QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN Inc.) đợc giải trình tự trực tiếp dòng hoá vào vectơ pCR2.1 hoá chất TAcloning Kit (Invitrogen Inc.) chọn lọc khuẩn lạc theo phơng pháp kháng sinh thị màu Tách chiết ADN plasmit có chứa PCR đợc thực với bé ho¸ chÊt QIAprep Spin Plasmid Extraction Kit (QIAGEN Inc.) Chuỗi ADN đợc giải trình tự máy động ABI 377 PRISM (Perkin- Elmer) vµ thùc hiƯn víi nhiỊu plasmit tái tổ hợp nhằm thu đợc kết xác Các trình tự tơng ứng với đoạn ADN nghiên cứu từ số quần thể thuộc giống Paragonimus đ đợc công bố [2] đăng ký Ngân hàng Gien, đợc sử dụng để so sánh đối chiếu Sắp xếp, đối chiếu trình tự tơng ứng đoạn gien hệ chơng trình máy tính AsemblyLIGN 1.9 MacVector 6.5.3 (Oxford Molecular Inc.) Trình tự axit amin đợc dịch m theo b¶ng m di trun mt-DNA sè 21 cđa sán dẹt (platyhelminth mitochondrial code) giới thiệu Ngân hàng Gen Phả hệ sơ đợc xử lý chơng trình phụ hệ MacVector 6.5.3 Tách chiết ADN tổng số ADN tổng số đợc tách chiết hoá chất DNeasy Tissue Kit (QIAGEN Inc.) theo quy trình nhà sản xuất Mô tả rút gọn nh sau: mẫu vật bảo quản cồn 70o đợc lấy cho cồn bay hết, sau rửa nhiều lần PBS Mẫu vật đợc nghiền kỹ xử lý với dung môi Kit, hấp phụ lên màng ly chiết ADN theo quy trình tách chiết Hàm lợng ADN sử dụng cho phản ứng PCR (50 microlit) khoảng 150 nanogam Mồi (primer) tiến hành phản ứng PCR Cặp mồi đợc thiết kế để dùng nhân ADN đích phản ứng PCR dựa sở trình tự bảo tån cđa gien cox1 Måi xu«i JB3F: 5’ TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTT AT3’ mồi ngợc JB4.5R: 5'TAAAGAAAGA ACATAATGAAAATG3' ADN đích đ đợc nhân PCR tiêu chuẩn với hoá chất PCR Master Mix Kit (Promega) Chu tr×nh nhiƯt cđa PCR máy Perkin-Elmer (Perkin-Elmer Inc., Mỹ) gồm bớc nh sau: 94oC - phút, Địa điểm tiến hành giám định Công việc giám định phân tử giải trình tự đợc tiến hành phòng thí nghiệm Ký sinh trùng học phân tử thuộc Viện nghiên cứu Y học Queensland, ôxtrâylia II Kết thảo luận Đối chiếu phân tử so sánh phân đoạn gien cox1 A PhetChina PhetThai PSLVN1 PSLVN2 PLCVN1 PLCVN3 PLCVN4 Pbangkok_H P_harinasu P_siamensi Piloktsuen Pmacrorchi 40 : : : : : : : : : : : : * 20 * 40 * 60 * 80 * TTTAATTTTGCCTGGATTTGGTGTTGTGAGACATATCTGCATGACTTTGACTAATAAAGATTCTTTGTTCGGTTATTATGGCTTGGTTTTTGCC .T .T .T .T .T .T C T C.G C.A C G G T C T GC T G G C T G A G A A T T GC T C G G C T G T GA T T G T C T G A G G A A GA T T C.A G T A G T A G T T G A C C T T A : : : : : : : : : : : : 94 94 94 94 94 94 94 94 94 94 94 94 PMexEcuado : G C G T T T .T T G A G : PohiraiKin : A A GA T T C.A G T A G T : PohiraiTan : A A GA T T C.A G T C A G T : 94 94 94 PhetChina PhetThai PSLVN1 PSLVN2 PLCVN1 PLCVN3 PLCVN4 Pbangkok_H P_harinasu P_siamensi Piloktsuen Pmacrorchi PMexEcuado PohiraiKin PohiraiTan : : : : : : : : : : : : : : : 100 * 120 * 140 * 160 * 180 ATGGGGGCTATTGTGTGTTTGGGGAGGGTTGTTTGAGCGCACCATATGTTTATGGTTGGTTTAGATGTCAAGACTGCTGTTTTTTTTAGTTCTG T C .T C C C A G T T T G G T T G T C G G A G T T T G C T T C G G A A .A T G G T G T G G A T C G C .G T A A C A T T G G T C.T T C .C A A A A T G T C G G A T C G C .G T A A C A G A T C G C .G T A A C A : : : : : : : : : : : : : : : 188 188 188 188 188 188 188 188 188 188 188 188 188 188 188 PhetChina PhetThai PSLVN1 PSLVN2 PLCVN1 PLCVN3 PLCVN4 Pbangkok_H P_harinasu P_siamensi Piloktsuen Pmacrorchi PMexEcuado PohiraiKin PohiraiTan : : : : : : : : : : : : : : : * 200 * 220 * 240 * 260 * 280 TTACTGGGGTGATTGGGATTCCCACAGGGATTAAGGTTTTTTCTTGGTTGTTTATGTTGGGGGGGACTCGTTTACGGTTTTGAGATCCGGTGGT T C G A T C G .T G T AA A T C G C .T C G T AA .C C T A T G T .A A C A T G .G TC G T CT G A T T A A C C G T AA G T T G T C.A A C G C AA T T T G A T T G A C T G A T T A A T C G T AA G A T T A A T C G T AA : : : : : : : : : : : : : : : 282 282 282 282 282 282 282 282 282 282 282 282 282 282 282 PhetChina PhetThai PSLVN1 PSLVN2 PLCVN1 PLCVN3 PLCVN4 Pbangkok_H P_harinasu P_siamensi Piloktsuen Pmacrorchi PMexEcuado PohiraiKin PohiraiTan : : : : : : : : : : : : : : : * 300 * 320 * 340 * 360 * TTGGTGAATTTTAGGCTTTATTTTTCTTTTTACTATTGGTGGTGTAACTGGGATTATTTTGTCTTCTTCTATTTTGGATAGTCTGTTACATGAT C C A A G G C G C G G A C C T G C A G G G G G A T G G G C.T T C CT.G A G C T G .C A A .T G A A C.T G C T.G A A G A C C T.A G C A G A A G G G A T G G A G G .C A A C T C A A C.T G C T.G A A G A C C T.A G C A A C.T G C T.G A A G A C C T.A G C : : : : : : : : : : : : : : : 376 376 376 376 376 376 376 376 376 376 376 376 376 376 376 B PhetChina : PhetThai : PSLVN1 : PSLVN2 : PLCVN1 : PLCVN3 : PLCVN4 : Pbangkok : P_harinasu : P_siamensi : P_iloktsuen: P_macrorchi: P_mexicanus: P_ohirai1 : P_ohirai2 : P_sado : * 20 * 40 * 60 * LILPGFGVVSHICMTLTNNDSLFGYYGLVFAMGAIVCLGSVVWAHHMFMVGLDVKTAVFFSSVTGVIGIPT .I I I I I PhetChina PhetThai PSLVN1 PSLVN2 80 * 100 * 120 GIKVFSWLFMLGGTRLRFWDPVVWWILGFIFLFTIGGVTGIILSSSILDSLLHDTWFV : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : 71 71 71 71 71 71 71 71 71 71 71 71 71 71 71 71 129 129 129 129 41 PLCVN1 : PLCVN3 : PLCVN4 : P_bangkok : P_harinasu : P_siamensis: P_iloktsuen: P_macrorchi: P_mexicanus: P_ohirai1 : P_ohirai2 : P_sadoensis: I I .A L L V I I I I I : : : : : : : : : : : : 129 129 129 129 129 129 129 129 129 129 129 129 Hình So sánh trình tự nucleotit (A) axit amin (B) đoạn gien cox1 cđa mét sè chđng Paragonimus sp cđa ViƯt Nam víi chủng P heterotremus Trung Quốc Thái Lan, nh loài khác giới Ghi chú: dấu (.): biểu thị giống với trình tự P heterotremus Trung Quốc; sai khác nucleotit axit amin đợc thể chữ ký hiƯu cđa chóng PhetChina vµ PhetThai: Paragonimus heterotremus Chen et Hsia, 1964 (chủng Trung Quốc chủng Thái Lan); PSLVN: Paragonimus sp ViƯt Nam (chđng S¬n La); PLCVN: Paragonimus sp ViƯt Nam (chđng Lai Ch©u); P_bangkok: P bangkokensis Miyazaki and Vajrasthira, 1967; P_harinasu: P harinasutai Miyazaki and Vajrasthira, 1968; P_siamensis: P siamensis Miyazaki and Wykoff, 1965; P_iloktsuen: P iloktsuenensis Chen, 1940; P_macrorchi: P macrorchis Chen, 1962; P_mexicanus: P mexicanus Miyazaki and Ishii, 1968; P_sadoensis: P sadoensis Miyazaki, Kawashima, Hamajima and Otsuru, 1968 H×nh 1A cho thÊy tr×nh tù nucleotit cđa đoạn gien cox1 Paragonimus heterotremus Trung Quốc Thái Lan hoàn toàn giống Các chủng Paragonimus sp Việt Nam thu nhận Sơn La (ký hiệu PSLVN1 PSLVN2) sai khác nucleotit chủng thu nhận Lai Châu (ký hiệu PLCVN1, PLCVN3, PLCVN4) sai khác 3-4 nucleotit, cho mức độ tơng đồng 99,0-99,2% Sai khác chủng Paragonimus sp Việt Nam với trình tự loài khác, ví dụ với loài P ohirai 55/376, mức độ tơng đồng thấp (85.4%); với loài P siamensis 62/376, tỷ lệ tơng đồng đạt 83,5% Trình tự axit amin tất c¸c chđng cđa P heterotremus cđa ViƯt Nam, Trung Qc Thái Lan hoàn toàn giống Thành phần axit amin loài khác không thay đổi lớn, trừ loài P siamensis (5/129, đạt 3,9%), chứng tỏ thay đổi nucleotit không làm thay đổi axit amin thành phần đoạn gien cox1 nghiên cứu (hình 1B) loài châu khác nhằm đảm bảo tính khách quan phân tích Nói chung, chủng loài đợc phân nhãm cïng nhau, vÝ dơ loµi P myiazaki cđa NhËt Bản hay loài P skrịabini Tất chủng loµi Paragonimus sp cđa ViƯt Nam vµ Paragonimus heterotremus cđa Trung Quốc Thái Lan nằm chung nhóm, nhánh phả hệ khác với loài khác (hình 2) Tỷ lệ tơng đồng nucleotit nh axit amin coi tuyệt đối chủng loài Paragonimus sp Việt Nam (trên 99%) phân nhóm hoàn toàn với Paragonimus heterotremus Trung quốc Thái lan, cho phép kết luận loài Paragonimus sp Việt Nam (chủng Lai Châu Sơn La) Paragonimus heterotremus qua so sánh phân tích trình tự xếp phả hệ III Kết luận Sơ xem xét quan hệ loài P heterotremus Việt Nam Giám định sinh học phân tử thức cho thấy mẫu sán phổi Paragonimus sp Việt Nam (chủng Lai Châu Sơn La) Paragonimus heterotremus Chen et Hsia, 1964 Hình biểu thị sơ phả hệ phân nhóm loài chủng giống Paragonimus Các loài chọn lọc để phân tích phả hệ bao gồm loài châu nhiều Paragonimus heterotremus Việt Nam có mức độ tơng đồng phân tử cao với P heterotremus Trung Quốc Thái Lan (trên 99,0% nucleotit 100% axit amin) 42 Pxiangshanensis.txt Pmenglaensis.txt 0.056 0.021 0.003 0.005 PbangkokHainan.txt 0.033 0.028 Pharinasutai.txt 0.033 PwThai.txt 0.040 0.009 PwleytePhilippine.txt 0.024 0.036 0.005 0.062 PwMingqing.txt 0.002 0.005 0.006 0.001 0.017 0.001 0.004 0.004 PwMieJpan.txt PwKorea.txt PwHyogo.txt PwAmak3n.txt Psiamensis.txt 0.065 EupNanjing2.txt 0.003 EupNanjing1.txt 0.067 0.009 0.016 0.007 BigAnhui2.txt BigAnhui.txt 0.001 Ppaish2.txt 0.002 Ppaish1.txt 0.075 PsadoensisJp.txt 0.000 PohiraiKinosakiJp.txt 0.001 0.001 0.010 0.064 0.045 PLCVN3.txt PLCVN1.txt 0.002 0.002 0.000 PSL383.txt 0.000 0.007 0.005 0.002 0.035 PhetThai.txt PhetChina.txt PSL331.txt 0.010 0.006 0.006 Piloktsuenensis.txt PMexEcua.txt PLCVN4.txt 0.005 0.000 0.005 0.010 PohiraiTanegJp.txt 0.002 0.066 PSL1.txt 0.240 0.058 PsYunnan1.txt 0.039 0.002 0.001 0.003 0.013 0.003 0.007 0.009 0.012 0.006 0.004 Phokuoensis2.txt 0.006 0.010 0.003 0.003 0.000 0.002 0.002 PsHubei1.txt PsJapan(Ken).txt PsGuangdong.txt PsGuang1.txt 0.028 0.000 0.003 0.008 0.002 PsSichuan.txt 0.002 0.017 0.000 0.001 Parag-like.txt Pmacrorchis.txt Phokuoensis1.txt PmiyaOK.txt PsJian1.txt PmiyaJianou.txt PsJanou.txt PmiyaShizu.txt PmiyaNanko.txt PmiyaHiwas.txt Hình Sơ phả hệ dựa trình tự nucleotit đoạn gien cox1 số chủng Paragonimus sp cđa ViƯt Nam víi c¸c chđng P heterotremus Trung Quốc Thái Lan, loài khác giới Paragonimus sp Việt Nam đợc liệt kê vào nhóm với P heterotremus Trung Quốc Thái Lan 43 Sơ phân định phả hệ cho thấy P heterotremus Việt Nam hoµn toµn cïng nhãm víi P heterotremus cđa Trung Qc Thái Lan, nhng khác xa với loài Paragonimus khác Tài liệu tham khảo Blair D., 1993: Acta Trop., 53: 227-289 Blair D et al.,1998: Proceedings of the 9th International Congress of Parasitology Chiba, Japan: 643-647 Blair D., Xu Z B and Agatsuma T., 1999: Adv Parasitol., 42: 113-222 Kino H et al., 1995: Jpn J Parasitol., 44: 470-472 Mc Manus D P and Bowles J., 1996: Int J Parasitol., 26: 687-704 NguyÔn Thị Lê, Đặng Tất Thế, Phạm Ngọc Doanh, 1997: Tạp chÝ Y häc ViƯt Nam, 2: 35- 40 Lª Thanh Hòa Mc Manus D P., 2001: Tập san Sinh häc - Héi nghÞ qc tÕ vỊ sinh häc Hµ Néi 2-4/7/2001: 101-108 molecular identification of paragonimus heterotremus Chen et Hsia, 1964 in vietnam Le Thanh Hoa, nguyen bich nga, Nguyen Van De, le dinh cong, §ang Tat The summary A region of 376 nucleotides of the mitochondrial-encoded cox1 gene from samples of Paragonimus sp collected in the Laichau and Sonla provinces was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and comparatively aligned with the known corresponding sequences of Paragonimus heterotremus (geographical origin of China and Thailand) and representative species of the Paragonimus genus (GenBank and published data) Molecular-based analysis revealed that Paragonimus sp of Vietnam is Paragonimus heterotremus Chen et Hsia, 1964, showing high nucleotide similarity to that of China and Thailand strains (over 99%) Phylogenetic analysis uniquely groups the Paragonimus sp of Vietnam with the Paragonimus heterotremus of China and Thailand Ngµy nhËn bµi: 16-11-2001 44 ... so sánh phân tích trình tự xếp phả hệ III Kết luận Sơ bé xem xÐt quan hƯ loµi cđa P heterotremus cđa Việt Nam Giám định sinh học phân tử thøc cho thÊy c¸c mÉu s¸n l¸ phỉi Paragonimus sp Việt Nam. .. La) Paragonimus heterotremus Chen et Hsia, 1964 Hình biểu thị sơ phả hệ phân nhóm loài chủng giống Paragonimus Các loài chọn lọc để phân tích phả hệ bao gồm loài châu nhiều Paragonimus heterotremus. .. hành giám định Công việc giám định phân tử giải trình tự đợc tiến hành phòng thí nghiệm Ký sinh trùng học phân tử thuộc Viện nghiên cứu Y học Queensland, ôxtrâylia II Kết thảo luận Đối chiếu phân