TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN - NGUYỄN THỊ NA NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC NEOMYCIN CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN TỪ MƠI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người động vật HÀ NỘI, 2017 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN - NGUYỄN THỊ NA NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC NEOMYCIN CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN TỪ MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người động vật Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THỊ HỒNG HẠNH HÀ NỘI, 2017 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Hồng Hạnh, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, người tận tình hướng dẫn, bảo, động viên tơi suốt trình học tập, nghiên cứu thực hồn thành khóa luận Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy cô Viện NCKH&ƯD Trường ĐHSP Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành khóa luận Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN, Trường ĐHSP Hà Nội Đặc biệt gia đình bạn bè bên cạnh động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thời gian tơi thực khóa luận Mặc dù có nhiều cố gắng để hồn thành khóa luận cách tốt Tuy nhiên buổi đầu làm quen với công việc nghiên cứu khoa học hạn chế kiến thức kinh nghiệm nên khơng thể tránh khỏi thiếu sót, tơi mong nhận góp ý q thầy, giáo để khóa luận hồn chỉnh Hà Nội, ngày 28 tháng năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Na LỜI CAM ĐOAN Để đảm bảo tính trung thực khóa luận, tơi xin cam đoan: Khóa luận “Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc neomycin màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo’’ công trình nghiên cứu cá nhân tơi, thực hướng dẫn TS Nguyễn Thị Hồng Hạnh Các kết trình bày khóa luận trung thực, khách quan chưa công bố cơng trình trước Nếu có sai sót, tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm Hà Nội, ngày 28 tháng năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Na MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn NỘI DUNG CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một vài đặc điểm CVK 1.1.1 Vi khuẩn sản sinh CVK 1.1.2 Môi trường nuôi cấy A xylinum 1.1.3 Cấu trúc màng CVK 1.1.4 Một số đặc tính màng CVK 1.1.5 Sinh tổng hợp CVK 1.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình tạo màng CVK 1.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng màng CVK làm vật liệu hấp thụ thuốc 1.2.1 Trên giới 1.2.2 Tại Việt Nam 1.3 Tổng quan neomycin 10 1.3.1 Công thức 10 1.3.2 Tính chất lí hóa 10 1.3.3 Dược lí dược động học 11 1.3.4 Chỉ định chống định 11 1.4 Tình hình nghiên cứu neomycin 12 1.4.1 Trên giới 12 1.4.2 Tại Việt Nam 12 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Vật liệu nghiên cứu 13 2.2 Phương pháp nghiên cứu 13 2.2.1 Phương pháp tạo màng xử lý màng CVK 13 2.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng neomycin 15 2.2.3 Chế tạo màng CVK hấp thụ neomycin 16 2.2.4 Phương pháp xử lí thống kê 18 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 3.1 Tạo màng CVK A xylinum môi trường nước vo gạo 19 3.2 Thu màng CVK thô từ môi trường 20 3.3 Tinh chế màng CVK 22 3.4 Phương trình đường chuẩn neomycin PBS ( pH = 7,4 ) 23 3.5 Tỉ lệ neomycin hấp thụ vào màng CVK 24 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT A.xylinum: Acetobacter xylinum CVK: Cellulose vi khuẩn Cs: Cộng ĐHSP: Đại học sư phạm KTNN: Kỹ thuật nông nghiệp PBS: Phosphate buffered saline NCKH&CGCN: Nghiên cứu Khoa học ứng dụng Nxb: Nhà xuất mht: Khối lượng thuốc hấp thụ DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học CVK Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo neomycin [1] 10 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình tinh chế màng CVK 15 Hình 3.1 Màng CVK ni cấy tĩnh ngày thứ 19 Hình 3.2 Màng CVK với thời gian nuôi cấy khác 21 Hình 3.3 Màng CVK tinh chế 22 Hình 3.4 Phương trình đường chuẩn neomycin môi trường dung dịch đệm PBS (pH = 7,4) 24 Hình 3.5 Màng CVK hấp thụ thuốc neomycin 25 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng nước vo gạo Bảng 1.2 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến suất sản xuất màng CVK Bảng 2.1 Thành phần môi trường lên men tạo màng CVK 14 Bảng 2.2 Môi trường đệm PBS với pH = 7,4 16 Bảng 2.3 Môi trường thử nghiệm cho màng CVK hấp thụ thuốc 17 Bảng 3.1 Bảng nồng độ neomycin giá trị OD277 nm (n = 3) 23 Bảng 3.2 Giá trị OD hấp thụ thuốc neomycin màng CVK (n = 3) 25 Bảng 3.3 Khối lượng neomycin hấp thụ, tỷ lệ hấp thụ cường độ hấp thụ neomycin màng CVK (n =3) 26 MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Hiện nay, Cellulose vi khuẩn (CVK) đối tượng nhiều nghiên cứu ứng dụng nhà khoa học nước nước Đây loại nguyên liệu mới, ứng dụng nhiều lĩnh vực thực phẩm, y học, mỹ phẩm, Theo kết nghiên cứu cho thấy màng CVK tạo nên từ nguyên liệu dẻ tiền, dễ kiếm nước vo gạo, nước dừa già ,và sản xuất quy mơ cơng nghiệp Về mặt tính chất CVK có độ tinh lớn nhiều so với loại cellulose khác, phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hồn tồn Ngồi CVK có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn định kích thước hướng CVK mạng polymer sinh học có khả giữ nước lớn, có tính xốp, ẩm độ cao, chịu thể tích đáng kể bề mặt (lực bền học cao) Ngày nay, môi trường ngày bị nhiễm vấn đề da xuất nhiều hơn, bệnh viêm da dị ứng hay viêm da nhiễm trùng Để điều trị bệnh thường có nhiều loại thuốc khác có Neomycin Neomycin tác nhân kháng khuẩn hữu ích để điều trị vết thương Tuy nhiên, phát gần cho thấy kem Neomycin thơng thường có số nhược điểm phương pháp điều trị khả thẩm thấu qua da không cao đạt 45%, nhanh bị khô bề mặt da,…[1] Để tăng hấp thụ thuốc đồng thời giảm tác dụng không mong muốn thuốc, định chọn đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc Neomycin màng cellulose vi khuẩn từ mơi trường nước vo gạo” Mục đích nghiên cứu - Nghiên cứu: khả hấp thụ thuốc màng CVK, tìm điều kiện để màng hấp thụ thuốc nhiều 3.3 Tinh chế màng CVK Tinh chế màng CVK để loại bỏ tạp chất có mơi trường ni cấy, đồng thời phá hủy trung hòa độc tố củavi khuẩn Đây trình quan trọng trước màng sử dụng để nạp thuốc giúp màng sử dụng lượng thuốc tối đa Màng CVK sau tách từ môi trường nuôi cấy rửa với nước ngâm vào dung dịch NaOH 3%, sau 48 ngâm dung dịch có màu nâu, màng CVK lấy rửa với nước sau ngâm HCl 3%, sau 48 lấy màng rửa với nước, thu màng CVK tinh chế có màu trắng sáng hình 3.3 Hình 3.3 Màng CVK tinh chế 3.4 Phương trình đường chuẩn neomycin PBS ( pH = 7,4 ) Kết trung bình quang neomycin bước sóng 277nm trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Bảng nồng độ neomycin giá trị OD277 nm (n = 3) Nồng độ 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,005± 0,012± 0,02± 0,028± 0,036± 0,045± 0,0001 0,0011 0,0016 0,0018 0,002 0,0022 (mg/ml) OD Đo mật độ quang nồng độ neomycin khác máy quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản) phòng thí nghiệm Viện NCKH& ƯD trường ĐHSP Hà Nội 2, sau xử lí phần mềm Excel cho kết phương trình đường chuẩn neomycin là: Phương trình đường chuẩn: y = 6,2426x + 0,0231 (R2= 0,9988) Trong đó: y: nồng độ neomycin (mg/ml) x: mật độ hấp thụ thuốc OD 277nm R2: hệ số tương quan bình phương Nồng độ thuốc neomycin (mg/ml) OD 277nm 0.35 y = 6,2426x + 0,0231 R² = 0,9988 0.30 0.25 0.20 0.15 OD 277nm 0.10 Linear (OD 277nm) 0.05 0.00 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 Mật độ hấp thụ OD 277nm Hình 3.4 Phương trình đường chuẩn neomycin môi trường dung dịch đệm PBS (pH = 7,4) 3.5 Tỉ lệ neomycin hấp thụ vào màng CVK Màng tinh khiết sau tinh chế loại bỏ bớt nước sau cho màng vào bình chứa 100 ml dung dịch đệm PBS chứa thuốc neomycin nồng độ 2mg/ml tá dược glycerol 0,5% rung động 100 vòng 300C giờ, đảm bảo cho màng hấp thụ tối đa Màng CV hấp thụ thuốc thể hình 3.4 Hình 3.5 Màng CVK hấp thụ thuốc neomycin Sau ngâm màng CVK dung dịch neomycin khoảng thời gian 30 phút, 1giờ, 2giờ lấy dung dịch đo quang phổ UV -2450 để xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng Kết đo quang phổ CVK trình bày bảng 3.2 Bảng 3.2 Giá trị OD hấp thụ thuốc neomycin màng CVK (n = 3) Độ dày 0,3 0,5 1,0 màng CVK (cm) OD 0,033±0.001 0,035±0.0016 0,041±0,0013 Từ kết tnh bảng 3.2 ta thấy sau ngâm màng giá trị OD đo gần không giảm chứng tỏ lượng thuốc hấp thụ vào màng đạt cực đại Lấy giá trị OD thu bảng 3.2 thay vào phương trình đường chuẩn neomycin ta tìm khối lượng neomycin có dung dịch (m2) , lấy khối lượng neomycin có dung dịch thay vào công thức (1) ta khối lượng neomycin hấp thụ vào màng CVK (mht), tiếp tục lấy khối lượng neomycin hấp thụ vào màng CVK thay vào công thức (2) ta thu tỷ lệ thuốc neomycin hấp thụ vào màng CVK Khối lượng thuốc hấp thụ vào màng CVK, tỷ lệ hấp thụ cường độ hấp thụ thuốc màng CVK trình bày bảng 3.3 Bảng 3.3 Khối lượng neomycin hấp thụ, tỷ lệ hấp thụ cường độ hấp thụ neomycin màng CVK (n =3) STT Thời Độ Đường Thể Khối m2 mht gian dày kính tích lượng (mg) (mg/cm3) ni màng màng (cm3) màng cấy thu ( cm ) (ngày) (cm) 0,3 12 0,5 1,0 3 EE (%) ( gam) 2,12 3,53 7,07 2,89 ± 0,229± 1,771± 88,53± 0,058 0,0084 0,0084 0,042 5,26± 0,246± 1,754± 87,72± 0,053 0,0096 0,0096 0,048 6,27± 0,279± 1,721± 86,03± 0,027 0,0084 0,0084 0,042 Nhận xét: Từ kết tính bảng 3.3 ta thấy, lượng thuốc neomycin hấp thụ vào màng CVK tương đối lớn 26 Từng loại màng , có độ dày khác , hấp thụ thuốc thời gian màng có độ dày 0,3cm hấp thu thuốc neomycin tốt so với màng có độ dày 27 0,5cm 1,0cm màng dày đường thuốc vào màng dài khoảng thời gian hấp thu 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN: Tạo màng CVK từ vi khuẩn A xylinum môi trường nước vo gạo Màng CVK 0,3 cm có khả hấp thụ neomycin tốt màng CVK 0,5cm 1,0cm Tỉ lệ thuốc Neomycin hấp thụ vào màng CVK độ dày 0,3cm; 0,5cm; 1,0cm là: 88,53%; 87,72%; 86,03% KIẾN NGHỊ: Tiếp tục nghiên cứu khả hấp thụ thuốc neomycin màng CVK từ chủng A xylinum, thay môi trường nước vo gạo môi trường khác nước dừa già, nước hoa quả, rỉ đường,… Tiếp tục nghiên cứu khả hấp thụ loại thuốc khác màng CVK nhằm tăng tác dụng loại thuốc 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Bộ Y tế (2007), Dược thư quốc gia Việt Nam, Nxb Y học Nguyễn Văn Thanh (2006), Nghiên cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Acetobacter xylium, Đề tài cấp bộ, Bộ Y tế Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh Nghiên cứu đặc tnh màng cellulose vi khuẩn từ acetobacter xylinum sử dụng làm màng trị bỏng Tạp chí dược học số 361/2006, trang 1820 Nguyễn Thu Hương, “Chọn lọc dòng Acetobacter xylinum thích hợp cho loại mơi trường dùng sản xuất cellulose” Tạp chí Di truyền học ứng dụng, số 3, 2003 Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong (2013) Phương pháp nghiên cứu sinh lý học thực vật Nguyễn Thị Nguyệt Nghiên cứu vi khuẩn Acetobacter xylinum cho màng Bacterial cellulose làm mặt nạ dưỡng da Luận án thạc sỹ sinh học ĐHSP Hà Nội, 2008 Đinh Thị Kim Nhung (2012), “Nghiên cứu vi khuẩn A xylinum tạo màng bacterial cellulose ứng dụng điều trị bỏng”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 50 (4), 453 - 462 Đinh Thị Kim Nhung (2012), Nghiên cứu thu nhận màng cellulose từ vi khuẩn Acetobacter, ứng dụng trị bỏng, đề tài trọng điểm cấp Bộ giai đoạn 2010 – 2012 Nguyễn Thị Thùy Vân (2009), Nghiên cứu đặc tính sinh học khả tạo màng bacterial cellulose vi khuẩn A xylinum phân lập từ số nguồn 30 nguyên liệu Việt Nam, Luận văn thạc sĩ sinh học, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 31 Tài liệu Tiếng Anh 10 Amin MCIM, Ahmad N, et al (2012), “Bacterial cellulose film coatng as drug delivery system: physicochemical, thermal and drug release properties”, SainMalaysiana, 41, 561 - 568 11 Alguacil J et al (2015), “Binding thermodynamics of paromomycin, neomycin, neomycin – dinucleotide and diPNA conjugates to bacterial and human rRNA”, J Mol Recognit 12 Almeida I.F et al (2014), “Bacterial cellulose membranes as drug delivery systems: An in vivo skin compatibility study”, European Journal of Pharmaceutcs and Biopharmaceutics, 86(3), 332 – 336 13 Bhavana V et al (2016), “Study on the drug loading and release potential of bacterial cellulose”, Cellulose Chem Technol, 50(2), 219 –223 14 Blanchard C et al (2015), “Neomycin sulfate improves the antmicrobial activity of mupirocin based antibacterial ointments”, Antimicrob Agents Chemother, pii: AAC, – 15 15 Brown R M (1999), “Pure Appl”, Chem, 71 (5) 16 Choi Y et al (2004), “Preparation and characterizaton of acrylic acid treated bacterial cellulose cation exchange membrane”, J Chem Technol.Biotechnol, 79,79 – 84 17 Czaja W., Romanovicz D., Brown R.M (2004),“ Structural investigations of microbial cellulose produced in statonary and agitated culture”, Cellulose, 11, 403 – 411 18 Klemm D et al (2009), “Nanocellulose materials – different cellulose, different functonality”, Macromol Symp, 280, 60–71 19 Lin Huang, Xiuli Chen, Thanh Nguyen Xuan, Huiru Tang, Liming Zhang and Guang Yang Nano-cellulose 3D-networks as controlled-release drug carriers năm 30 2013 31 20 Lina Fu, Yue Zhang, Chao Li, Zhihong Wu, Qi Zhuo, Xia Huang, Guixing Qiu, Ping Zhou and Guang Yang skin tissue repair materials from bacterial cellulose by a multilayer fermantation method năm 2012 21 Luan J et al (2012), “Impregnaton of silver sulfadiazine into bacterial cellulose Mater, for antimicrobial and biocompatble wound dressing”,Biomed 7, 65 – 69 22 Silva NHCS et al (2014), “Topical cafeine delivery using biocellulose membranes: Cellulose, a potential innovatve system for cellulite treatment”, 2, 665 - 674 23 Srivastava, K C.; Bordia A.; Verma S K (tháng - 1995) “Curcumin, a major component of the food spice turmeric (Curcuma longa), inhibits aggregation and alters eicosanoid metabolism in human blood platelets” Prostaglandins LeukotEssent Faty Acids 24 Nguyen TX et al (2014), “Chitosan - coated nano - liposomes for the oral delivery of berberine hydrochloride”, J Mater Chem B, 2, 7149 -7159 25 Patel, U.D & Suresh, S 2008 Complete dechlorination of pentachchlorophenol using palladized bacterial cellulose in a rotatngcatalyst contact reactor Journal of Colloid and Interface Science 319 (2):462 - 469 26 Trovatti E et al (2011), “Bacterial cellulose membranes applied in topical and transdermaldelivery of lidocaine hydrochloride and ibuprofen: in vitro diffusion studies”, Int J Pharm, 435, 83 - 87 27 Wei B.et al (2011), “Preparaton and evaluation of a kind of bacterial cellulose dry flms with antibacterial properties”, Carbohydr Polym, 84, 533 - 538 28 Wippermann, J., Schumann, D., Klemm, D., Kosmehl, H., Salehi - Gelani, S., 31 & Wahlers, T 2009 Preliminary Results of Small Arterial Substitute Performed with a New Cylindrical Biomaterial Composed of Bacterial Cellulose European Journal of Vascular and Endovascular Surgery 37(5): 592 - 596 32 ... nghiên cứu: Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc Neomycin màng cellulose vi khuẩn từ môi trường nước vo gạo Mục đích nghiên cứu - Nghiên cứu: khả hấp thụ thuốc màng CVK, tìm điều kiện để màng hấp thụ. .. hấp thụ thuốc nhiều Đối tượng phạm vi nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: khả hấp thụ thuốc neomycin màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo - Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu thực...TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN - NGUYỄN THỊ NA NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC NEOMYCIN CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN TỪ MƠI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO KHĨA