TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN ====== PHẠM THỊ MAI NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC CIMETIDIN CỦA MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN TỪ MƠI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người động vật Người hướng dẫn khoa học ThS PHẠM THỊ KIM DUNG HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Với lòng trân trọng biết ơn sâu sắc, tơi xin chân thành cảm ơn ThS Phạm Thị Kim Dung, người tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình thực khóa luận Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn tới thầy cô khoa Sinh - KTNN thầy cô Trung tâm Nghiên cứu khoa học Chuyển giao công nghệ trường Đại học Sư phạm Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn tới người thân, bạn bè bên động viên, giúp đỡ khích lệ tơi hồn thành khóa luận Tơi mong góp ý q thầy để khóa luận hồn chỉnh Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 04 năm 2017 Sinh viên Phạm Thị Mai LỜI CAM ĐOAN Tơi xin khẳng định kết khóa luận “Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc cimetidin màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo” kết nghiên cứu cá nhân hướng dẫn trực tiếp ThS Phạm Thị Kim Dung, giảng viên khoa Sinh - KTNN trường Đại học Sư phạm Hà Nội Đề tài chưa cơng bố đâu hồn tồn khơng trùng với cơng trình nghiên cứu tác giả khác Hà Nội, tháng 04 năm 2017 Sinh viên Phạm Thị Mai MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn NỘI DUNG CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan đối tượng lĩnh vực nghiên cứu 1.1.1 Tổng quan màng CVK 1.1.1.1 Vi khuẩn sản sinh CVK 1.1.1.2 Cấu trúc màng CVK tạo A xilynum 1.1.1.3 Đặc tính màng CVK tạo A xylinum 1.1.1.4 Chức sinh lý CVK tạo A xylinum 1.1.1.5 Môi trường nuôi cấy A xylinum nhằm thu màng CVK 1.1.2 Tổng quan thuốc cimetidin 1.1.2.1 Công thức 1.1.2.2 Tính chất lý hóa 1.1.2.3 Tác dụng cimetidin 1.1.2.4 Đặc điểm dược động học 1.1.2.5 Dược lực học cimetidin 1.1.2.6 Tác dụng phụ cimetidin 10 1.2 Giới thiệu tổng quan tình hình nghiên cứu Việt Nam giới 11 1.2.1 Tình hình nghiên cứu màng CVK 11 1.2.1.1 Tình hình nghiên màng CVK giới 11 1.2.1.2 Tình hình nghiên cứu màng CVK Việt Nam 11 1.2.2 Tình hình nghiên cứu cimetidin 12 1.2.1.1 Tình hình nghiên cứu giới cimetidin 12 1.2.2.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam cimetidin 12 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Vật liệu nghiên cứu 13 2.1.1 Giống vi khuẩn 13 2.1.2 Nguyên liệu hóa chất 13 2.2 Thiết bị dụng cụ 13 2.2.1 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 13 2.2.2 Dụng cụ sử dụng nghiên cứu 14 2.3 Phương pháp nghiên cứu 14 2.3.1 Phương pháp lên men thu màng CVK từ môi trường nước vo gạo 14 2.3.2 Phương pháp xử lý màng CVK trước hấp thụ thuốc 15 2.3.3 Phương pháp đánh giá độ tinh khiết màng CVK 16 2.3.4 Đo bề dày màng CVK 16 2.3.5 Xây dựng đường chuẩn CM HCl 0,1N 17 2.3.6 Phương pháp xác định lượng thuốc hấp thu vào màng CVK 18 2.3.7 Phương pháp xử lý thống kê 19 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 Kết tạo màng xử lý màng CVK từ môi trường nước vo gạo 20 3.1.1 Thu màng CVK từ môi trường lên men 20 3.1.2 Quá trính xử lý màng CVK trước hấp thụ thuốc 20 3.1.3 Xác định điều kiện ni cấy để có độ dày màng CVK thích hợp 21 3.1.4 Đo bề dày màng CVK 22 3.1.5 Kiểm tra độ tinh khiết màng CVK 23 3.2 Khảo sát khả hấp thụ thuốc màng CVK 24 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT A xylinum Acetobacter xylinum CVK Cellulose vi khuẩn CM Cimetidin cs cộng ĐHSP Đại học Sư phạm FDA Cục quản lý thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ OD Mật độ quang phổ Nxb Nhà xuất DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng nước vo gạo Bảng 2.1 Môi trường lên men tạo màng CVK .14 Bảng 2.2 Cách bố trí thí nghiệm đo bề dày màng 17 Bảng 2.3 Giá trị mật độ quang (OD) dung dịch CM nồng độ (mg/ml) khác (n = 3) 17 Bảng 3.1 Kết thu màng CVK tươi từ môi trường nước vo gạo độ dày khác 22 Bảng 3.2 Giá trị đo độ dày màng gạo .23 Bảng 3.3 Giá trị OD (y) trung bình thuốc CM sau hấp thụ thuốc khoảng thời gian khác (n = 3) 26 Bảng 3.4 Khối lượng tỉ lệ thuốc CM hấp thụ vào màng CVK sau (n = 3) 27 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học CVK Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo thuốc cimetidin Hình 2.1 Sơ đồ quy trình ni cấy thu nhận CVK 15 Hình 2.2 Phương trình đường chuẩn cimetidin 18 Hình 3.1 Hình ảnh màng CVK lên men từ mơi trường nước vo gạo 20 Hình 3.2 Các quy trình xử lý màng CVK 21 Hình 3.3 Kiểm tra độ tinh khiết màng CVK 24 Hình 3.4 Màng CVK cho vào 100 ml dung dịch thuốc CM 20% 24 Hình 3.5 Lắc màng CVK dung dịch thuốc CM 20% 25 Hình 3.6 Chuẩn bị dịch đo quang phổ 25 Hình 3.7 Biểu đồ so sánh hiệu suất hấp thụ thuốc CM 20% thao tác màng CVK có độ dày 0,3 cm 0,5 cm 28 Hình 3.8 Biểu đồ hiệu suất hấp thụ thuốc CM màng 0,3 cm 28 Hình 3.9 Biểu đồ hiệu suất hấp thụ thuốc CM màng 0,5 cm 29 MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Thuốc cimetidin chất đối kháng receptor histamin H2, thuốc khám phá cách tiếp cận phương pháp nghiên cứu thuốc hợp lí Tác dụng chủ yếu thuốc ức chế tế bào thành dày tiết acid [8] Cimetidin sau trải qua hàng loạt nghiên cứu thử nghiệm báo cáo chất ức chế phát triển khối u tuyến nội tiết, ung thư đại trực tràng, điều trị tổn thương dày cấp tính… thành công thị trường với tên Tagamet, sinh khả dụng thuốc thấp khoảng 35% làm ngăn cản ứng dụng điều trị khoảng thời gian dài [8] Tuy nhiên trình dùng thuốc, người bệnh gặp tác dụng phụ khơng mong muốn như: tiêu chảy, đau đầu, chóng mặt, ngủ gà, lú lẫn, trầm cảm, rối loạn chức gan, viêm tụy xảy Các phản ứng khỏi ngừng thuốc Cellulose vi khuẩn (CVK) sản phẩm loài vi khuẩn, đặc biệt chủng Acetobacter xylinum Màng sinh học (CVK) có cấu trúc đặc tính giống với cellulose thực vật (gồm phân tử glucose liên kết với liên kết β - 1,4 glucorit), cellulose vi khuẩn khác với cellulose thực vật chỗ: không chứa hợp chất cao phân tử ligin, hemicellulose, peptin sáp nến chúng có đặc tính vượt trội với độ dẻo dai, bền [2] Trên giới, màng CVK ứng dụng nhiều lĩnh vực công nghệ khác nhau: dùng màng CVK làm mơi trường phân tách cho q trình xử lí nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho pin lượng cho tế bào, làm môi trường chất sinh học, thực phẩm hay thay thực phẩm, thiết kế hệ thống vận tải phân phối thuốc nhiều ứng dụng khác Trong lĩnh vực y học, màng CVK ứng dụng làm da tạm thời thay da trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo, điều trị bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da cho người [6] Amin et al báo cáo việc sử dụng màng CVK làm màng bọc cho paracetamol cách sử dụng kĩ thuật phun phủ Kết cho thấy màng CVK có khả giữ thuốc giải phóng thuốc chậm lại, làm tăng hiệu sử dụng thuốc Ở Việt Nam việc nghiên cứu ứng dụng màng CVK quan tâm gần đạt kết bước đầu Ở Việt Nam gạo sản phẩm lương thực thiếu bữa ăn hàng ngày nhiên người biết nước vo gạo chứa lượng giá trị dinh dưỡng cao thường hay bị bỏ lãng phí Để tận dụng tiết kiệm chi phí cho việc lên men màng CVK nghĩ đến việc sử dụng môi trường nước vo gạo để lên men màng Cellulose vi khuẩn Để khắc phục tác dụng phụ không mong muốn từ thuốc cimetidin giảm chi phí cho q trình thí nghiệm sản xuất, nên định chọn đề tài: “Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc cimetidin màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo” Mục đích nghiên cứu - Nghiên cứu chế tạo màng CVK từ chủng Acetobacter Xylinum môi trường nước vo gạo - Làm để lượng thuốc cimetidin hấp thụ vào màng CVK nhiều Phạm vi nghiên cứu - Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu thực quy mơ phòng thí nghiệm - Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm sinh lý học người động vật khoa Sinh - KTNN trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu khoa học Chuyển giao công nghệ, trường Đại học Sư phạm Hà CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết tạo màng xử lý màng CVK từ môi trường nước vo gạo 3.1.1 Thu màng CVK từ môi trường lên men Kết tạo màng CVK từ mơi trường thể qua hình 3.1 a b c Hình 3.1 Hình ảnh màng CVK lên men từ môi trường nước vo gạo a Lên men ngày b Lên men ngày c Lên men 12 ngày 3.1.2 Quá trính xử lý màng CVK trước hấp thụ thuốc Màng CVK sau thu chứa lượng lớn môi trường lên men sản phẩm trình trao đổi chất, acid acetc Vì vậy, trước hấp thụ thuốc cần phải xử lý màng để thu màng CVK tinh chế Quy trình xử lý màng CVK thể qua hình 3.2 (1) (2) (4) (5) (3) (6) Hình 3.2 Các quy trình xử lý màng CVK (1) Màng CVK thơ (2) Màng CVK ngâm NaOH 3% (48h) (3) Màng CVK rửa nước cất (4) Màng CVK ngâm HCl 3% (48h) (5) Màng CVK ngâm nước cất lần (48h) (6) Màng CVK tinh chế 3.1.3 Xác định điều kiện ni cấy để có độ dày màng CVK thích hợp Mục đích: Thu màng CVK độ dày khác sử dụng màng cho thí nghiệm giai đoạn sau Nguyên tắc: Vi khuẩn A xylinum cho vào môi trường sử dụng chất dinh dưỡng môi trường để tổng hợp nên cellulose Màng cellulose dày lên dần ngưng lại thời điểm định, môi trường hết chất dinh dưỡng Độ dày màng tùy thuộc lượng môi trường thời gian nuôi cấy Thực hiện: Môi trường nước vo gạo cho vào bình ni cấy với thể tích mơi trường khác Cách tiến hành: Môi trường nước vo gạo cho vào bình ni cấy với thể tích mơi trường 150 ml Sau khoảng - ngày tến hành thu màng lần 1, lúc màng có độ dày khoảng 0,25 - 0,3 cm Tiếp tục ni cấy tĩnh bình lại đến - ngày thu màng, lúc màng có độ dày 0,45 - 0,5 cm Kết thu màng CVK tươi độ dày khác dày khác thể qua bảng 3.1 Bảng 3.1 Kết thu màng CVK thô từ môi trường nước vo gạo độ dày khác Thời gian nuôi cấy (ngày) 3-5 7-9 Thể tích mơi trường ni cấy (ml) 150 Độ dày màng thu (cm) 0,3 0,5 3.1.4 Đo bề dày màng CVK Màng CVK đo thước điểm khác nhau, d1, d2, d3, d4 bề dày màng tnh trung bình với kích thước dtb Màng khảo sát thể tích mơi trường ni cấy 150ml tương ứng với mẫu màng gạo Bảng 3.2 Giá trị đo độ dày màng gạo Độ dày màng D1(cm) D2(cm) D3(cm) D4(cm) Dtb(cm) 0,28 0,28 0,27 0,29 0,28 ± 0,0082 0,31 0,28 0,28 0,33 0,30 ± 0,0245 0,5 0,47 0,48 0,47 0,48 ± 0,0141 0,52 0,49 0,48 0,51 0,50 ± 0,0183 (cm) 0,3 0,5 Trong muốn thu màng CVK có độ dày 0,3 cm thu thời điểm - ngày, muốn thu màng CVK có độ dày 0,5 cm thu thời điểm 79 ngày 3.1.5 Kiểm tra độ tinh khiết màng CVK Mục đích: Kiểm tra diện đường glucose nồng độ cao trongmôi trường nuôi cấy Nguyên tắc: Dùng thuốc thử Fehling pha để phát diện đường D- glucose, có xuất kết tủa màu nâu đỏ Tiến hành: - Mẫu thử: Dịch thử màng CVK loại sau xử lý hóa học - Mẫu chứng: Là H2O cất dung dịch D- glucose - Cho vào ống nghiệm chứa mẫu thử ống nghiệm 1ml thuốc thử Fehling Đun cách thủy 10 phút - Quan sát tủa xuất ống nghiệm - Kết quả: Không phát glucose diện màng Hình 3.3 Kiểm tra độ tinh khiết màng CVK Mẫu thử 1: Màng 0,5 cm Mẫu thử 2: Màng 0,3 cm 3.2 Khảo sát khả hấp thụ thuốc màng CVK Cho mẫu màng vào bình có chứa 100 ml dung dịch thuốc CM 20% thể hình 3.3 (1) (2) Hình 3.4 Màng CVK cho vào 100 ml dung dịch thuốc CM 20% (1) 100 ml dung dịch thuốc CM 20% (2) Màng CVK cho vào 100 ml dung dịch thuốc CM 20% Sử dụng máy lắc với tốc độ180 vòng/phút 30 phút, giờ, 1.5 giờ, hình 3.4 Hình 3.5 Lắc màng CVK dung dịch thuốc CM 20% Khi lắc màng CVK dung dịch thuốc CM 20% sau 30 phút, giờ, 1.5 giờ, rút dịch đo quang phổ hình 3.5 Hình 3.6 Chuẩn bị dịch đo quang phổ Lặp lại thí nghiệm lần, xác định giá trị OD (y) trung bình thuốc CM bảng 3.3 Bảng 3.3 Giá trị OD (y) trung bình thuốc CM sau hấp thụ thuốc khoảng thời gian khác (n = 3) Độ dày màng Giá trị OD (y) Thao tác (cm) Không sấy 0,3 Sấy 50% Sấy đến khối lượng không đổi Không sấy 0,5 Sấy 50% Sấy đến khối lượng không đổi 30 phút 1.5 giờ 0,369 ± 0,358 ± 0,347 ± 0,332 ± 0,001 0,0017 0,0026 0,002 0,337 ± 0,322 ± 0,312 ± 0,301 ± 0,0015 0,0026 0,0036 0,003 0,305 ± 0,292 ± 0,286 ± 0,273 ± 0,0044 0,0035 0,0026 0,0053 0,396 ± 0,385 ± 0,367 ± 0,351 ± 0,0036 0,0021 0,001 0,0026 0,374 ± 0,352 ± 0,341 ± 0,334 ± 0,0006 0,0025 0,0045 0,0032 0,357 ± 0,335 ± 0,324 ± 0,311 ± 0,0031 0,0026 0,0049 0,0015 Qua bảng 3.3 thấy: Khi màng CVK hấp thụ thuốc, giá trị OD (y) trung bình thuốc giảm dần sau khơng đổi độ dày màng Có thể sau khoảng thời gian 30 phút, giờ, 1.5 giờ, lượng thuốc CM hấp thụ vào màng CVK tăng dần đạt cực đại Sau lượng thuốc màng giảm màng có tượng giải phóng thuốc Theo cơng thức (1), công thức (2) công thức (3) ta tính khối lượng tỉ lệ (%) thuốc CM hấp thụ vào màng CVK bảng 3.4 Bảng 3.4 Khối lượng tỉ lệ thuốc CM hấp thụ vào màng CVK sau (n = 3) Độ Mtr Thể dày (mg) tch màng Thao tác (cm) Ms (mg) Mht (mg) sấy Sấy 50% 20 20 màng 20%) Không 0,3 (CM (cm ) 12,52 ± 7,48 ± 0,02 0,02 11,29 ± 8,71 ± 0,015 0,015 10,18 ± 9,82 ± 0,06 0,06 13,27 ± 6,73 ± 0,036 0,036 12,60 ± 7,40 ± 0,012 0,012 11,69 ± 8,31 ± 0,01 0,01 1,875 1,875 Cường độ hấp thụ EE (%) (mg/cm3) 4,18 37,4 ± ±0,006 0,06 4,65 ± 43,5 ± 0,0015 0,15 5,23 ± 49,1 ± 0,0045 0,024 2,15 ± 33,6 ± 0,0025 0,018 2,37 ± 37,02 ± 0,0014 0,045 2,66 ± 41,6 ± 0,0018 0,049 Sấy đến khối lượng 20 1,875 không đổi Không sấy 0,5 Sấy 50% 20 20 3,125 3,125 Sấy đến khối lượng 20 không đổi Qua bảng 3.4 ta có biểu đồ sau: 3,125 60 49.1 50 43.5 37.4 40 33.6 41.6 37.02 Màng 0,3 cm Màng 0,5 cm 30 20 10 Không sấy Sấy 50% Sấy đến khối lượng khơng đổi Hình 3.7 Biểu đồ so sánh hiệu suất hấp thụ thuốc CM 20% thao tác màng CVK có độ dày 0,3 cm 0,5 cm Trong độ dày màng với thao tác không sấy, sấy 50%, sấy đến khối lượng khơng đổi hiệu suất hấp thụ thuốc CM 20% thể qua hình 3.8 hình 3.9 sau 60 49.1 50 40 43.5 37.4 Màng 0,3 cm 30 20 10 Không sấy Sấy 50% Sấy đến khối lượng khơng đổi Hình 3.8 Biểu đồ hiệu suất hấp thụ thuốc CM màng 0,3 cm 45 40 35 30 25 20 15 10 33.6 37.02 41.6 Màng 0,5 cm Không sấy Sấy 50% Sấy đến khối lượng khơng đổi Hình 3.9 Biểu đồ hiệu suất hấp thụ thuốc CM màng 0,5 cm Qua bảng 3.4 hình 3.7, 3.8, 3.9 ta thấy: Sau màng CVK có độ dày 0,3 cm khơng sấy có hiệu suất hấp thụ thuốc CM trung bình 37.4%, màng CVKcó độ dày 0,5 cm khơng sấy có hiệu suất hấp thụ thuốc CM trung bình 33.6% thấy màng 0,3 cm khơng sấy hấp thụ thuốc CM cao màng 0,5cm không sấy Sau màng CVK có độ dày 0,3 cm sấy 50% có hiệu suất hấp thụ thuốc CM trung bình 43.5%, màng CVK có độ dày 0,5 cm sấy 50% có hiệu suất hấp thụ thuốc CM trung bình 37.02% , thấy màng CVK có độ dày 0,3 cm sấy 50% hấp thụ thuốc cao màng CVK có độ dày 0,5 cm sấy 50% Sau màng CVK có độ dày 0,3 cm sấy đến khối lượng khơng đổi có hiệu suất hấp thụ thuốc CM trung bình 49.1%, màng CVK có độ dày 0,5 cm sấy đến khối lượng khơng đổi có hiệu suất hấp thụ thuốc CM trung bình 41.6%, thấy màng CVK có độ dày 0,3 cm sấy đến khối lượng không đổi hấp thụ cao màng CVK có độ dày 0,5 cm sấy đến khối lượng không đổi Mặt khác với thao tác: Không sấy, sấy 50%, sấy đến khối lượng không đổi loại màng CVK dày 0,3 cm 0,5 cm cho thấy lượng thuốc hấp thụ vào màng tăng dần từ màng không sấy đến màng sấy 50% đạt cực đại màng sấy đến khối lượng không đổi So sánh giá trị trung bình cường độ hấp thụ thuốc việc sử dụng hàm t - Test: Two Sample Assuming Unequal Variances, kết có khác biệt khả hấp thụ độ dày màng P = 0,006 (T