Đang tải... (xem toàn văn)
Mục đích cơ bản của luận án này là xác định được một số đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn P. damselae phân lập từ cá biển Việt Nam. Tạo được chủng đột biến giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc xin phòng bệnh Photobacteriosis ở cá biển nuôi lồng.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - LÊ MINH HẢI NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN Photobacterium damselae GÂY BỆNH TRÊN MỘT SỐ LỒI CÁ BIỂN NI LỒNG TẠI VIỆT NAM VÀ TẠO CHỦNG ĐỘT BIẾN GIẢM ĐỘC LỰC PHỤC VỤ SẢN XUẤT VẮC XIN PHỊNG BỆNH TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Hà Nội, năm 2018 Cơng trình hồn thành tại: VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Thị Tâm PGS.TS Tô Long Thành Phản biện Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ họp Viện Khoa học Nơng Nghiệp Việt Nam Có thể tìm kiếm luận án thư việdn: Thư Viện Quốc Gia Việt Nam Thư viện Viện Khoa học Nông Nghiệp Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Việt Nam có tiềm lớn ni trồng thủy sản biển, diện tích có khả sử dụng phát triển nuôi cá biển bao gồm vùng vịnh kín, bãi triều ven biển phần hải đảo, vùng biển hở Biển Việt Nam có nhiều lồi cá phân bố tự nhiên đưa vào ni biển nhóm cá mú, cá hồng, cá cam, cá tráp, cá giò, cá vược Trong chương trình ni, đến năm 2020 Việt Nam dự kiến đạt sản lượng 200.000 cá biển ni 50.000 nuôi theo quy mô lớn [16] Hiện tại, mơ hình ni cá lồng bè có giá trị kinh tế cao biển áp dụng phổ biến nhiều vùng ven biển nước ta Tuy nhiên, việc phát triển mơ hình ni nhanh số lượng mức độ thâm canh ngày cao, tình hình dịch bệnh gây chết cá hàng loạt ghi nhận ngày nhiều với tỉ lệ hao hụt cao Vi khuẩn ưa mặn Photobacterium damselae gây bệnh Photobacteriosis hay Pasteurellosis gọi xuất huyết nhiễm trùng, bệnh đốm trắng thận cá biển [5] Vi khuẩn P damselae cơng gây bệnh cá biển nuôi tất giai đoạn phát triển cá từ giai đoạn ấu trùng, cá giống đến cá nuôi thương phẩm Khi bị bệnh cá biểu dạng mãn tính cấp tính, biểu bệnh Photobacteriosis như: gây loét da, xuất nốt kem trắng u hạt tubercules màu trắng số quan nội tạng, gây hoại tử nội tạng, hoại tử tập trung thận lách, gây nhiễm trùng hoại tử rộng rải [146], [41] Cá bệnh chết sau 5-10 ngày với tỷ lệ chết cao từ 80-100% gây thiệt hại kinh tế nước như: Nhât, Mỹ, Pháp, Tây Ban Nha, Hy Lạp, Thổ Nhĩ Kỳ, Ở Việt Nam, theo báo tác giả Đỗ Thị Hòa cs năm 2008, cho thấy lồi cá biển ni Khánh Hòa, Kiên Giang tỉnh phí Bắc bị bệnh vi khuẩn P damselae gây thiệt hại lớn cho người nuôi Hiện nay, người nuôi cá biển sử dụng vắc xin để phòng bệnh nghiên cứu sản xuất hạn chế, thị trường khan vắc xin thương mại Vắc xin phòng bệnh vi khuẩn P.damselae chủ yếu dạng vô hoạt, sử dụng cách tiêm cho cá, giá thành cao, khó sử dụng cho cá giống kích thước bé Người nuôi cá biển, chủ yếu sử dụng kháng sinh để trị bệnh vi khuẩn P damselae dẫn đến kháng thuốc, tồn dư kháng sinh sản phẩm Nhằm giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh, nghiên cứu tạo vắc xin phòng bệnh cần thiết Hiện tại, có nhiều phương pháp để tạo vắc xin, phương pháp tạo vắc xin nhược độc từ chủng vi khuẩn nhược độc kỹ thuật gây đột biến thực nghiệm phương pháp phổ biến hữu hiệu khắc phục hạn chế vắc xin vô hoạt Xuất phát từ lý luận thực tiễn trên, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc tính sinh học vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh số lồi cá biển ni lồng Việt Nam tạo chủng đột biến giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc xin phòng bệnh” làm sở ban đầu hướng đến việc sản xuất vắc xin phòng bệnh Photobacteriosis cá biển quy mơ công nghiệp Mục tiêu đề tài luận án - Xác định số đặc tính sinh học chủng vi khuẩn P damselae phân lập từ cá biển Việt Nam - Tạo chủng đột biến giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc xin phòng bệnh Photobacteriosis cá biển nuôi lồng Đối tượng phạm vi nghiên cứu - Đối tượng: Vi khuẩn P damselae, số lồi cá biển ni lồng (cá mú, cá hồng mỹ, cá bớp (cá giò) - Phạm vi nghiên cứu: Các vùng ven biển miền Bắc Việt Nam Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Ý nghĩa khoa học: - Các kết nghiên cứu luận án xác định đặc tính sinh học chủng vi khuẩn P damselae gây bệnh Photobacteriosis cá sở khoa học nghiên cứu dịch tễ xây dựng giải pháp phòng trị bệnh - Kết tạo vi khuẩn P damselae giảm độc lực kỹ thuật gây đột biến sở cho nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn đột biến phục vụ cho định hướng sản xuất vắc xin nhược độc phòng bệnh cho cá đạt hiệu cao Ý nghĩa thực tiễn: Đề tài tạo chủng vi khuẩn P damselae giảm độc lực, an tồn, có khả tạo đáp ứng miễn dịch bảo hộ làm nguyên liệu để sản xuất vắc xin phòng bệnh Photobacteriosis cho cá góp phần tăng sản lượng cá nuôi phát triển bền vững nghề nuôi cá biển nước ta Đóng góp đề tài luận án - Ở Việt Nam cơng trình nghiên cứu đầu tiên, tồn diện vi khuẩn P.damselae gây bệnh cá biển nuôi lồng, phân lập xác định 07 chủng vi khuẩn, xác định số đặc tính sinh học vi khuẩn gây bệnh - Luận án cơng trình Việt Nam nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn P.damselae giảm độc lực làm nguyên liệu sản xuất vắc xin phòng bệnh Photobacteriosis cá biển Thành cơng nghiên cứu góp phần giải vấn đề cách đáng kể việc sử dụng kháng sinh dẫn đến tượng nhờn thuốc giảm tồn dư kháng sinh sản phẩm, nâng giá trị sản phẩm cá biển, tăng xuất cá biển nuôi lồng Cấu trúc luận án: Luận án gồm 111 trang với 16 bảng số liệu 27 hình Luận án gồm phần: Mở đầu (3 trang); Tổng quan tài liệu (38 trang); Vật liệu, nội dung phương pháp nghiên cứu (12 trang); Kết thảo luận (56 trang); Kết luận kiến nghị (1 trang) Luận án tham khảo 183 tài liệu 22 tài liệu tiếng Việt 161 tài liệu tiếng Anh CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trong chương luận án trình bày tình hình ni cá biển giới Việt Nam; số bệnh thường gặp cá biển nuôi, vi khuẩn P damselae bệnh vi khuẩn P damselae gây cá biển: phân loại, đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hố, đặc điểm nuôi cấy, khả kháng kháng sinh vi khuẩn P damselae, đặc điểm dịch tễ, gen độc tố yếu tố gây bệnh, dấu hiệu bệnh lý, phương pháp phát P damselae, phòng điều trị bệnh; Tổng quan tạo chủng vi khuẩn nhược độc, phương pháp làm giảm độc vi khuẩn: phương pháp vật lý, phương pháp vi sinh vật học , đột biến kháng sinh rifampicin, giảm độc kỹ thuật gen; Đáp ứng miễn dịch cá vắc-xin phòng bệnh: đáp ứng miễn dịch cá,vắc xin phòng bệnh cho cá (tình hình nghiên cứu giới, tình hình nghiên cứu nước) Vi khuẩn P damselae cơng gây bệnh cá biển nuôi tất giai đoạn phát triển cá từ giai đoạn ấu trùng, cá giống đến cá nuôi thương phẩm Hiện nay, người nuôi cá biển chủ yếu sử dụng kháng sinh để trị bệnh, nhằm giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh, việc nghiên cứu tạo vắc xin cần thiết Trong phương pháp tạo vắc xin, phương pháp tạo chủng vi khuẩn nhược độc kỹ thuật gây đột biến thực nghiệm tạo vắc xin nhược độc phương pháp phổ biến hữu hiệu CHƯƠNG VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu: Vi khuẩn P damselae gây bệnh xuất huyết nhiễm trùng cá biển nuôi lồng vùng biển Việt Nam 2.2 Vật liệu nghiên cứu - Động vật thí nghiệm: Cá mú, cá bớp, cá chẽm, cá hồng nghi mắc bệnh xuất huyết nhiễm trùng thu số khu vực nuôi cá lồng vùng biển Việt Nam Cá gây nhiễm: cá mú kiểm tra loại bệnh, có khối lượng 60 - 80g, màu sắc tươi sáng, đầy đủ phận bơi lội bình thường - Hóa chất: Các cặp mồi nhân gen 16S RNA, ureC, , hlyA chủng vi khuẩn P.damselae; Bộ Kit dùng tách chiết DNA, thang DNA chuẩn; Cột Nikel chelating Resin (Invitrogen); Hóa chất dùng cho ni cấy vi khuẩn; Hóa chất tách chiết DNA; Hóa chất cho phản ứng PCR; Hóa chất thực phản ứng ELISA; Hóa chất điện di Các cặp mồi nhân gen 16s RNA, ureC, , hlyA chủng vi khuẩn P.damselae - Môi trường dung dịch nuôi cấy vi khuẩn: BHI, TCBS, KIA, peptone kiềm, Marine Agar Mơi trường dùng để pha lỗng vi khuẩn: Peptone đệm, nước muối sinh lý Môi trường dùng cho phản ứng sinh hóa: KIA, Indol, mơi trường Muller Hinton, LB lỏng, BHI 2.3 Nội dung nghiên cứu - Phân lập số chủng vi khuẩn P.damselae từ mẫu cá nước mặn cá mú, cá chẽm, cá hồng cá bớp số vùng biển miền Bắc Việt Nam - Nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn phân lập - Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn P damselae đột biến giảm độc lực 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp thu mẫu cá bệnh Phương pháp thu thập, lấy mẫu áp dụng theo TCVN 5276:1990 (Quyết định số 2920 ngày 30/12/2008 Bộ trưởng Bộ KHCN việc công bố tiêu chuẩn Quốc gia) 2.4.2 Phương pháp mổ cá để lấy nội tạng (Đỗ Thị Hòa cộng sự, 2008; Bùi Quang Tề, 1998) 2.4.3 Phương pháp phân lập vi khuẩn Photobacterium damselae (Wang et al 2007) 2.4.4 Phương pháp giữ giống chủng vi khuẩn tuyển chọn (Đỗ Thị Hòa cs, 2008; Nguyễn Lân Dũng cs, 2012) 2.4.5 Phương pháp xác định đặc tính sinh hóa chủng vi khuẩn tuyển chọn (Bakopoulos et al., 1995) 2.4.6 Phương pháp xác định ảnh hưởng điều kiện môi trường đến khả nhân lên sinh độc tố gây dung huyết vi khuẩn (Phạm Công Hoạt, 2012) 2.4.6.1 Phương pháp xác định ảnh hưởng nhiệt độ 2.4.6.2 Phương pháp xác định ảnh hưởng pH 2.4.6.3 Phương pháp xác định ảnh hưởng độ mặn 2.4.7 Phương pháp nghiên cứu đặc tính gây bệnh xuất huyết nhiễm trùng cá biển vi khuẩn P damselae (Phạm Công Hoạt, 2012) 2.4.8 Phương pháp gây nhiễm động vật thí nghiệm xác định LD50 (Reed Muench, 1938) 2.4.9 Phương pháp tách chiết DNA (Lawson et al., 1989) 2.4.10 Phương pháp Multiplex PCR phát phân biệt P damselae subsp Damselae P damselae subsp piscicida (Osorio et al., 2000) 2.4.11 Phương pháp PCR phát gen hlyA 2.4.12 Phương pháp điện di agarose (Sambrook Russell, 2001) 2.4.13 Phương pháp tạo chủng nhược độc kỹ thuật gây đột biến thực nghiệm 2.4.13.1 Phương pháp gây giảm độc lực tia cực tím (Preecha et al., 2010) 2.4.13.2 Phương pháp gây giảm độc lực vi khuẩn kháng sinh rifampicin (Gliniewicz et al., 2015) 2.4.14 Đánh giá khả gây dung huyết dòng vi khuẩn đột biến giảm độc lực (Vaca et al., 2009) 2.4.15 Phương pháp mô bệnh học (Mitchell et al., 2004) 2.4.16 Giải trình tự DNA, xử lý phân tích số liệu trình tự gen - Giải trình tự DNA Sau PCR nhân gen quan tâm trình tự gen gửi đến địa Jalan SP 2/7, Taman Serdang Perdana, Seksyen 2, Seri Kembangan 43300, Selangor, Malaysia để giải trình tự - Xử lý phân tích số liệu trình tự gen Sử dụng cơng cụ Clustal omega phần mềm trực tuyến EMBL-EBI để đánh giá: Sự sai khác di truyền gen , hlyA dòng P.damseale giảm độc lực chủng gốc sai khác trình tự protein suy diễn từ gen dòng giảm độc lực 2.4.17 Phương pháp xác định khả tạo đáp ứng miễn dịch bảo hộ cá dòng vi khuẩn đột biến giảm độc lực 2.4.18 Phương pháp ELISA xác định kháng thể đặc hiệu (Yoshihito, 2002) Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết phân lập vi khuẩn P damselae 3.1.1 Đặc điểm mẫu cá bệnh Trong thời gian từ cuối tháng đến tháng năm 2015 số trang trại nuôi cá biển tỉnh miền Bắc (Hải Phòng;Nam Định; Quảng Ninh), 20 mẫu cá biển (cá mú mẫu, cá bớp 9, cá vược mẫu, cá hồng mẫu) có dấu hiệu bệnh Photobacteriosis (được gọi xuất huyết nhiễm trùng, bệnh đốm trắng thận cá biển) như: cá bơi gần mặt nước bơi sát lưới, chết rải rác, loét da, da tối màu, mang hoại tử, bụng chướng có dấu hiệu bị bệnh (hình 3.1) a b c Hình 3.1 (a), (b) Mẫu cá mú nghi mắc bệnh Photobacteriosis, thu Hải Phòng (c) Mẫu cá mú không bị bệnh Trong 20 cá bệnh thu với biểu bệnh lý bên khác nhau, tiến hành giải phẫu cá, thu 60 mẫu từ quan gan, thận, lách, tim, não với dấu hiệu bị tụ huyết trùng, xuất nốt kem trắng u hạt màu trắng quan nội tạng, hoại tử nội tạng Hình 3.2 Hình ảnh quan nội tạng cá bị bệnh Photobacteriosis (1) Gan sưng to có đốm nhỏ bề mặt (2) Niêm mạc dày bị viêm nhiễm (3) Lách sưng có đốm trắng (4) Thận sưng có đốm trắng 3.1.2 Kết phân lập vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh cá biển nuôi lồng Bảng 3.2 Kết phân lập vi khuẩn P damsalae từ mẫu cá biển nghi mắc Photobacteriosis (xuất huyết nhiễm trùng) Các phản ứng sinh hóa Nguồn Tên TT gốc phân chủng lập T1.7 Cá mú (Thận) T1.8 Cá bớp (Gan) T4.2 Cá hồng (Thận) T4.3 T4.4 Cá mú (Thận) Cá bớp (Thận) B5.22 B10.25 Cá vược (Lách) Cá mú ( Gan) Đặc điểm vi khuẩn Catalase Indole KIA Khả dung huyết β Trực khuẩn, lưỡng cực, gram (-) Trực khuẩn, lưỡng cực, gram (-) Trực khuẩn, gram (-) Trực khuẩn gram (-) Trực khuẩn gram (-) + - Tùy tiện, lên men glucose, sinh khí + - Tùy tiện, lên men glucose, sinh khí + + Không thực + - β + - Tùy tiện, lên men glucose, sinh khí Tùy tiện, lên men glucose, sinh khí Trực khuẩn, lưỡng cực, gram (-) Trực khuẩn gram (-) + - Tùy tiện, lên men glucose, sinh khí β + - Tùy tiện, lên men glucose, sinh khí α β β Từ 20 mẫu bệnh phẩm ban đầu, phân lập 07 chủng vi khuẩn P damsalae với đặc điểm hình thái: khuẩn lạc màu trắng đục, vàng sậm nâu đỏ, tròn đều, trơn, bóng với kích thước 1- mm (hình 3.3.a), tế bào dạng trực khuẩn, lượng cực, gram âm (hình 3.3.b) a b c d T1.7 Hình 3.3 Hình thái vi khuẩn P damselae (a): Hình thái khuẩn lạc mơi trường Marine agar; (b): Hình thái vi khuẩn P damselae nhuộm gram soi kính hiển vi quang học (100X); (c), (d): Hình thái khuẩn lạc ria môi trường TCBS sau 24 nuôi cấy Các chủng phát triển tốt, tạo khuẩn lạc màu xanh môi trường TCBS điều kiện 28ºC 24 – 32 (hình 3.3c) Đặc điểm tương tự với báo cáo Love et al (1981) Thyssen et al., (2000) TCBS, khuẩn lạc vi khuẩn P damselae có màu xanh, tròn, lồi, bóng [111], [166] Từ kết cho thấy vi khuẩn P damselae phân lập đối tượng: cá mú, cá hồng, cá vược, cá bớp miền BắcViệt Nam 3.1.3 Xác định phân loài P damselase gây bệnh cá biển nuôi lồng phương pháp sinh học phân tử Kết thực phản ứng multi- PCR khuếch đại gen 16S rRNA ureC cho thấy: có 05 chủng phát thấy đoạn gen có kích thước khoảng 267bp, 02 chủng phát thấy 02 đoạn gen có kích thước khoảng 267bp 448bp (Hình 3.5) So sánh với kết nghiên cứu Osorio et al (2000) [130] công bố tác giả năm 1999 [129], Magarinos et al (1996) [114] cho thấy 05 chủng T1.7, B5.22, T4.4, B10.25 T4.2 thuộc phân loài P damselae subsp Piscicida, 02 chủng T1.8 T4.3 thuộc phân loài P damselae subsp Damselae Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm multi-PCR khuếch đại gen ureC 16S rRNA vi khuẩn P damselase (M: thang chuẩn 100 bp, 1: T1.7, 2: B5.22, 3: T4.4, 4: B10.25, 5: T4.2, 6: T1.8, 7: T4.3) 3.1.4 Nghiên cứu độc lực chủng P damselae phân lập Độc lực vi khuẩn xác định liều gây chết 50% (LD50) Cá thí nghiệm gây nhiễm với 07 chủng vi khuẩn phân lập có mật độ 102-1012 CFU/ml Tỷ lệ chết cá gây nhiễm với chủng vi khuẩn có khác rõ rệt, xét tỷ lệ gây chết chủng nhận thấy tỉ lệ chết tỉ lệ thuận với mật độ vi khuẩn tiêm Áp dụng công thức Reed-Muynch, liều LD50 chủng T1.7 xác định sau: LD50 = 10(a + x) Trong đó: 10a độ pha lỗng canh khuẩn số lượng cá sống chết sau thí nghiệm 50%, tương ứng là: 103; x = (Pa- 50)/(Pa- Pu), x= (74,75-50)/ (74,75-45)= 0,83 Như vậy: LD50 chủng T1.7= 10(3 + 0,83) = 103,83 Tương tự vậy, liều gây LD50 chủng T4.3, T1.8, B5.22, T4.2, T4.4, B10.25 tương ứng 104,34, 104,76, 106,52, 106,61, 107,17, 109,28 Kết cho thấy, ba chủng T1.7, T4.3, T1.8 có độc lực cao chủng lại, số đó, hai chủng T1.8 T4.3 thuộc phân lồi P damselae subsp Damselae có độc lực cao nhất, chủng T1.7 thuộc loài P damselae subsp Piscicida có độc lực tương đương với chủng T1.8 Các chủng lại thuộc phân lồi P damselae subsp Piscicida có độc lực thấp đáng kể so với 03 chủng nói Labella et al (2010), nghiên cứu khả gây bệnh P damselae subsp Damselae xác định rằng: chủng có LD50 1x105 CFU chủng có độc lực mạnh, có khả gây chết cá chẽm đỏ sau đến gây nhiễm chủng khơng độc có LD 50 > 108 CFU không gây chết cá sau gây nhiễm [98] Như vậy, hai chủng P damselae subsp Damselae T1.8 T4.3 có LD50 104,76 104,34 phân lập chủng có độc lực cao Hình 3.8 Ảnh hưởng pH tới khả sinh trưởng P damselae Chủng P damselae T1.7 sinh trưởng tốt khoảng pH từ 8,0 – 8,5 chủng P damselae T4.3 thích nghi với pH thấp khoảng 7,5 – 8,0 Kết kiểm định LSD cho thấy độ pH thí nghiệm sinh trưởng P damselae, có sai khác ý nghĩa thống kê với p