Đang tải... (xem toàn văn)
Mục tiêu của luận án: Nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học chính của hai loài G. glomerulatum, G. hirsutum tại Việt Nam. Đánh giá các tế bào hoạt động độc hại của các hợp chất biệt lập để tìm kiếm các hợp chất hoạt tính sinh học, làm cơ sở khoa học để nghiên cứu thêm nhằm tạo ra các sản phẩm chăm sóc sức khỏe cho cộng đồng và góp phần giải thích tác dụng chữa bệnh của các loài này.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN VĂN THẮNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA LỒI SĨC CHỤM (GLOCHIDION GLOMERULATUM) VÀ LỒI SĨC LƠNG (GLOCHIDION HIRSUTUM) Ở VIỆT NAM Chun ngành: Hóa Hữu Mã số : 9.44.01.14 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2018 Cơng trình hồn thành tại: Học Viện Khoa học Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS TS Phan Văn Kiệm Người hướng dẫn khoa học 2: TS Vũ Kim Thư Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học Viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi , ngày Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học Viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Hà Nội tháng năm 2018 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Theo Tổ chức Y tế Thế giới, có khoảng 80% dân số sử dụng y học cổ truyền, đặc biệt dược liệu chăm sóc sức khỏe ban đầu Trong trình nghiên cứu phát triển thuốc, kinh nghiệm sử dụng thuốc dân gian yếu tố quan trọng làm tăng tỷ lệ thành cơng tìm kiếm hợp chất dẫn đường để tổng hợp thuốc thông qua việc giảm thời gian, tiết kiệm chi phí độc hại với thể sống Do đó, dược liệu đối tượng thu hút mạnh mẽ quan tâm nhà khoa học giới nghiên cứu tìm kiếm hoạt chất Theo Từ điển thuốc Việt Nam, chi Bọt ếch (Glochidion) Việt Nam có nhiều lồi sử dụng làm thuốc dược liệu chữa bệnh như: Sóc Dalton chữa lỵ trực trùng; Bòn bọt chữa viêm ruột lỵ, viêm da tiếp xúc, ngứa, viêm da tróc vảy, mày đay, eczema; Viện Dược liệu, Sóc mốc dùng làm thuốc mạnh gân xương hàn vết thương; Sóc lơng thường dùng chữa ỉa chảy, ăn uống không tiêu, sôi bụng, dùng trị rắn cắn, Các nghiên cứu thành phần hóa học cho thấy chi Glochidion chứa nhiều lớp chất đáng quan tâm terpenoid, steroid, megastigmane, flavonoid, lignanoid số dạng phenolic khác Các nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học cho thấy dịch chiết hợp chất phân lập từ lồi thuộc chi có hoạt tính đáng quan tâm như: gây độc tế bào ung thư, kháng nấm, kháng khuẩn, chống oxi hóa, Do đó, chúng tơi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính gây độc tế bào lồi Sóc chụm (Glochidion glomerulatum) lồi Sóc lơng (Glochidion hirsutum) Việt Nam” Mục tiêu nghiên cứu luận án Nghiên cứu thành phần hóa học hai loài G glomerulatum G hirsutum Việt Nam Đánh giá hoạt tính sinh học hợp chất phân lập để tìm kiếm hoạt chất tiềm Các nội dung nghiên cứu luận án: Phân lập hợp chất từ cành hai loài G glomerulatum G hirsutum Việt Nam phương pháp sắc ký; Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập phương pháp vật lý, hóa học; Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN Phần trình bày tổng quan nghiên cứu nước quốc tế thành phần hóa học hoạt tính sinh học chi Glochidion CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Cành lồi Sóc chụm (Glochidion glomerulatum) thu Phúc Yên, Vĩnh Phúc, Việt Nam vào tháng 9/2012 Cành lồi Sóc lơng (Glochidion hirsutum) thu Sơn Động, Bắc Giang, Việt Nam vào tháng 12/2012 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân lập hợp chất Phối hợp phương pháp sắc ký bao gồm: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp mỏng điều chế sắc ký cột (CC), sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học hợp chất Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học hợp chất kết hợp thông số vật lý với phương pháp phổ đại bao gồm: phổ khối (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS), độ quay cực ([]D), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học Hoạt tính gây độc tế bào hợp chất xác định theo phương pháp MTT SRB 2.3 Phân lập hợp chất 2.3.1 Phân lập hợp chất từ loài G glomerulatum Phần trình bày trình phân lập 10 hợp chất từ lồi G glomerulatum Hình 2.1 Sơ đồ phân lập hợp chất từ loài G glomerulatum 2.3.2 Phân lập hợp chất từ loài G hirsutum Phần trình bày trình phân lập hợp chất từ lồi G hirsutum Hình 2.2 Sơ đồ phân lập hợp chất từ loài G hirsutum 2.4 Thông số vật lý kiện phổ hợp chất 2.4.1 Thông số vật lý kiện phổ hợp chất phân lập từ loài G glomerulatum Phần trình bày thơng số vật lý kiện phổ 10 hợp chất phân lập từ lồi G glomerulatum 2.4.2 Thơng số vật lý kiện phổ hợp chất phân lập từ lồi G hirsutum Phần trình bày thông số vật lý kiện phổ hợp chất phân lập từ loài G hirsutum 2.5 Kết thử hoạt tính hợp chất phân lập đƣợc 2.5.1 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất phân lập từ loài G glomerulatum - 10 hợp chất (GG1-GG10) đánh giá hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư A-549, MCF-7, OVCAR, HT-29 theo phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào MTT Bảng 2.1 % ức chế dòng tế bào hợp chất GG1-GG10 nồng độ 100 µM Hợp chất GG1 GG2 GG3 GG4 GG5 GG6 GG7 GG8 GG9 GG10 A-549 97,54 ± 2,06 94,66 ± 1,22 71,24 ± 0,52 94,67 ± 1,62 96,21 ± 0,72 72,89 ± 0,56 97,43 ± 1,02 54,68 ± 0,21 69,54 ± 1,08 75,11 ± 0,96 MCF-7 82,28 ± 1,42 79,69 ± 1,30 83,25 ± 1,26 79,86 ± 2,34 80,34 ± 2,80 72,15 ± 0,38 74,38 ± 4,60 54,89 ± 0,30 71,02 ± 1,24 61,34 ± 4,20 OVCAR 90,64 ± 1,28 88,18 ± 0,84 97,12 ± 2,04 83,89 ± 2,06 91,56 ± 1,16 78,03 ± 1,86 92,08 ± 3,46 80,11 ± 2,82 82,13 ± 0,92 85,67 ± 1,04 HT-29 95,22 ± 2,38 93,12 ± 2,92 92,34 ± 0,20 91,98 ± 0,53 96,89 ± 3,20 77,21 ± 0,12 99,32 ± 4,44 81,11 ± 3,96 87,23 ± 1,36 79,52 ± 1,76 Bảng 2.2 Kết đánh giá hoạt tính gây độc dòng tế bào theo nồng độ hợp chất GG1-GG10 IC50 (µM) A-549 MCF-7 OVCAR 9,3± 1,4 50,1± 3,2 8,9± 2,2 GG1 10,2± 2,3 56,1± 4,3 10,6± 3,3 GG2 41,0 ± 3,5 58,4 ± 3,7 6,6 ± 0,7 GG3 9,7 ± 1,2 60,7 ± 5,2 41,5 ± 3,1 GG4 7,9 ± 0,8 42,8 ± 5,2 9,8 ± 2,1 GG5 58,2 ± 2,4 69,3 ± 5,2 59,4 ± 6,8 GG6 8,2 ± 1,0 63,5 ± 3,6 8,6 ± 3,1 GG7 94,9 ± 4,1 86,3 ± 5,2 34,1 ± 3,4 GG8 58,1 ± 4,6 67,5 ± 4,8 45,8 ± 2,5 GG9 51,7 ± 3,1 77,2 ± 5,5 27,7 ± 4,6 GG10 7,2 ± 0,5 10,3 ± 1,2 8,4 ± 0,9 ĐC* *ĐC: Mitoxantrone sử dụng chất đối chứng dương Hợp chất HT-29 7,8± 1,2 9,5± 1,6 7,3 ± 1,4 7,5 ± 1,7 5,9 ± 0,5 49,3 ± 3,1 5,9 ± 0,7 45,0 ± 2,4 49,1 ± 4,1 58,7 ± 3,9 3,1 ± 0,3 2.5.2 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất phân lập từ loài G hirsutum - hợp chất (GH1-GH5) đánh giá hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư A-549, MCF-7, SW-626, HepG2 theo phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào SRB Bảng 2.3 % ức chế dòng tế bào hợp chất GH1-GH5 nồng độ 100 µM Hợp chất GH1 GH2 GH3 GH4 GH5 A-549 90,10 ± 2,80 98,60 ± 1,64 97,44 ± 4,28 98,69 ± 2,32 96,06 ± 2,24 MCF-7 91,33 ± 1,12 98,28 ± 2,14 99,49 ± 0,98 96,86 ± 1,28 96,74 ± 3,12 SW-626 90,22 ± 3,14 98,21 ± 3,72 96,98 ± 3,34 94,14 ± 2,66 95,18 ± 1,80 HepG2 92,17 ± 1,38 99,09 ± 1,76 99,83 ± 2,38 99,39 ± 3,64 96,77 ± 4,90 Bảng 2.4 Kết đánh giá hoạt tính gây độc dòng tế bào theo nồng độ hợp chất GH1-GH5 Hợp chất GH1 GH2 GH3 GH4 GH5 ĐC* A-549 9,3 ± 0,3 4,4 ± 0,7 49,3 ± 4,1 8,0 ± 2,2 8,6 ± 1,3 1,8 ± 0,3 IC50 (µM) MCF-7 9,2 ± 0,5 4,7 ± 0,6 51,9 ± 3,7 8,8 ± 1,3 10,2 ± 2,4 2,0 ± 0,3 SW-626 8,5 ± 1,3 6,6 ± 1,0 54,4 ± 1,5 9,1 ± 1,1 10,1 ± 1,9 2,1 ± 0,3 HepG2 8,2 ± 1,3 3,4 ± 0,3 47,0 ± 5,6 7,6 ± 0,8 9,9 ± 3,1 1,4 ± 0,2 *ĐC: Ellipticine sử dụng chất đối chứng dương CHƢƠNG THẢO LUẬN KẾT QUẢ 3.1 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ loài G glomerulatum Phần trình bày chi tiết kết phân tích phổ xác định cấu trúc 10 hợp chất phân lập từ loài G glomerulatum: Glomeruloside I-II (GG1-GG2), Glomeruloside A-H (GG3-GG10) Mười hợp chất hợp chất saponin khung olean-12-ene Hình 3.1 Cấu trúc hóa học 10 hợp chất phân lập từ lồi G glomerulatum Dưới trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc hợp chất GG1 3.1.1 Hợp chất GG1 : Glomeruloside I Hợp chất GG1 phân lập dạng chất rắn dạng bột vơ định hình màu trắng Cơng thức phân tử GG1 xác định C55H84O20 xuất pic ion giả phân tử [M + Cl]- m/z: 1099,5260 phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS (tính tốn lý thuyết cho anion [C55H84O20Cl]- 1099,5250 đvC) Phổ 1H-NMR hợp chất GG1 cho thấy tín hiệu proton bảy nhóm methyl dạng singlet H 0,89 (3H, s), 0,93 (3H, s), 0,99 (3H, s), 1,04 (3H, s), 1,07 (3H, s), 1,10 (3H, s) 1,30 (3H, s); proton olefin H 5,35 (1H, br s); năm proton thơm H 8,05 (2H, d, J = 7,6 Hz), 7,49 (2H, t, J = 7,6 Hz) 7,60 (1H, t, J = 7,6 Hz) gợi ý tồn nhóm phenyl; proton anome H 4,46 (1H, d, 8,0 Hz), 4,62 (1H, d, 7,6 Hz), 4,86 (1H) gợi ý hợp chất có ba đơn vị đường Các tín hiệu proton phần đường, tín hiệu proton dạng singlet bảy nhóm methyl thuộc phần aglycone xuất số lượng lớn tín hiệu proton vùng trường cao (δH 0,81 ~ 2,46) cho phép dự đoán hợp chất saponin khung oleane Hình 3.2 Cấu trúc hóa học hợp chất GG1 hợp chất tham khảo GG1A Hình 3.3 Phổ HR-ESI-MS hợp chất GG1 Hình 3.4 Phổ 1H-NMR hợp chất GG1 Phổ C-NMR hợp chất GG1 xuất tín hiệu 55 carbon phân loại phổ DEPT thành: carbon carbonyl (C 167,18), 13 11 khẳng định tương tác HMBC H-16 (δH 4,32), H-18 (δH 2,46) H-22 (δH 5,91) tới C-17 Hình 3.1 Kết phân tích GC đường chuẩn hỗn hợp đường hợp chất GG1 sau thủy phân a) Kết phân tích GC L – glucose c) Kết phân tích GC D – glucose b) Kết phân tích GC L – galactose d) Kết phân tích GC D – galactose e) Kết phân tích GC hỗn hợp đường hợp chất GG1 sau thủy phân Tiếp đó, số liệu phổ đơn vị đường hợp chất GG1 qui kết dựa liệu phổ 13C-NMR, phân tích phổ hai chiều COSY, HSQC, HMBC kết phân tích GC sau thủy phân đường GG1 Kết thủy phân đường phân tích GC cho thấy hợp chất GG1 có chứa hai loại đơn vị đường với thời gian lưu tR1 = 14,098 phút tR2 = 18,713 phút (hình 3.9e) So sánh với kết phân tích GC đường chuẩn, quan sát thấy thời gian lưu tR1 = 14,098 phút tương tự với thời gian lưu đường D-glucose (tR = 14,106 phút, hình 3.9b) thời gian lưu tR2 = 18,713 phút tương tự với thời gian lưu đường D-galactose (tR = 18,706 phút, hình 3.9d), điều khẳng định phần đường GG1 có đường D-glucose đường D-galactose Tương tác HMBC Gal H-1 (δH 4,46, d, J = 8,0 Hz) với aglyone C-3 (δC 12 91,90), chuỗi tương tác quan sát phổ COSY gồm Gal H-1/ Gal H-2/ Gal H-3/ Gal H-4/ Gal H-5 với tương tác trực tiếp phổ HSQC proton cho phép quy kết giá trị phổ đơn vị đường galactose liên kết O-glycoside đường với aglycone C-3 Tương tác HMBC Glc I H-1 (δH 4,86) Gal C-2 (δC 76,40), với chuỗi tương tác COSY Glc I H-1/Glc I H-2/Glc I H-3/ Glc I H-4/ Glc I H-5/ Glc I H-6 cho phép qui kết giá trị phổ đơn vị đường Glc I liên kết (1→2) Glc I với Gal Các số liệu phổ carbon Glc II (δC 105,24, 75,28, 77,32, 71,17, 78,07, 62,40) tương tác HMBC Glc II H-1 (δH 4,62) với Gal C-3 (δC 85,25) cho thấy Glc II đơn vị đường glucose tự gắn với Gal liên kết (1→3) O-glycoside Những phân tích cho phép xác nhận cấu trúc chuỗi mạch trisaccharide liên kết với C-3 O-β-D-glucopyranosyl (1→3)-[β-D-glucopyranosyl (1→2)]-β-D-galactopyranoside Hình 3.2 Các tương tác COSY, HMBC ROESY hợp chất GG1 Hóa lập thể khung aglycone hợp chất GG1 tiếp minh chứng dựa phân tích phổ tương tác không gian ROESY Các tương tác ROESY H-25/H-26, H-18/H-30 cho thấy proton gần không gian định hướng beta sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp khung oleane Tương tự vậy, tương tác ROESY H-5/H-9/H-27 minh chứng cho định hướng alpha proton Trên phổ ROESY GG1 quan sát thấy tương tác 13 H-3 (δH 3,22) H-5 (δH 0,81) cho phép xác định proton H-3 định hướng alpha giống H-5, hay nhóm oxygen C-3 định hướng beta Ngoài ra, quan sát thấy tương tác ROESY H-22 (δH 5,91)/H-16 (δH 4,32) không quan sát thấy tương tác ROESY H-18 (δH 2,46) với H-22 (δH 5,91)/H-16 (δH 4,32), điều cho phép xác định proton H16 H-22 định hướng alpha, hay nhóm oxygen C-22 định hướng beta Từ phân tích nêu trên, cấu trúc hóa học hợp chất GG1 xác định 22β-benzoyloxy-3β,16β,28-trihydroxyolean-12ene 3-O-β-D-glucopyranosyl (1→3)-[β-D-glucopyranosyl (1→2)]-β-Dgalactopyranoside Đây hợp chất theo sở liệu Scifinder 2015, hợp chất GG1 đặt tên Glomeruloside I Số liệu phổ 1H- 13 C-NMR GG1 tổng hợp bảng 3.1 Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR hợp chất GG1 hợp chất tham khảo C 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Ca,b 40,08 27,20 90,50 40,40 57,08 19,44 33,77 41,36 48,31 37,87 24,83 124,41 143,61 44,38 37,72 69,60 44,97 43,59 47,31 31,15 38,49 72,20 # Ca,c 39,94 27,09 91,90 40,54 56,87 19,28 33,61 41,18 48,10 37,66 24,67 124,23 143,40 44,20 37,55 69,44 44,80 43,41 47,13 30,98 38,33 72,04 DEPT CH2 CH2 CH C CH CH2 CH2 C CH C CH2 CH C C CH2 CH C CH CH2 C CH2 CH Ha,d (độ bội, J, Hz) 1,02 (m)/1,65 (m) 1,76 (m)/1,96 (m) 3,22 (br d, 11,2) 0,81 (d, 11,2) 1,47 (m)/1,62 (m) 1,41 (m)/1,63 (m) 1,60 (m) 1,95 (m) 5,35 (br s) 1,52 (m)/1,98 (m) 4,32 (br d, 10,0) 2,46 (d, 12,4) 1,22 (m)/1,90 (m) 1,78 (m) 5,91 (br s) 14 C 23 24 25 26 27 28 # Ca,b 28,64 17,14 16,31 17,44 28,08 64,86 Ca,c 28,32 16,80 16,12 17,29 27,49 64,69 DEPT CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH2 29 30 22-O-Bz 1 2, 6 3, 5 4 7 3-O1 2 3 4 5 6 2-O-Glc 1 2 3 4 5 6 3-O-Glc 1 2 3 4 5 6 34,48 27,65 34,32 27,49 CH3 CH3 Ha,d (độ bội, J, Hz) 1,10 (s) 0,89 (s) 0,99 (s) 1,07 (s) 1,30 (s) 3,68 (d, 10,8)/ 4,02 (d 10,8) 0,93 (s) 1,04 (s) 132,31 130,61 129,79 134,24 167,33 Ara 107,25 72,24 84,00 69,66 66,81 132,10 130,43 129,62 134,09 167,18 Glc 105,83 76,40 85,25 69,97 75,92 63,76 C CH CH CH C 8,05 (d, 7,6) 7,49 (t, 7,6) 7,60 (t, 7,6) - CH CH CH CH CH CH2 4,46 (d, 8,0) 4,00 (m) 3,81 (m) 4,12 (br s) 3,55 (m) 3,54 (m)/3,83 (m) 103,51 76,05 78,32 72,53 77,86 62,34 CH CH CH CH CH CH2 4,86(m) 3,14 (t, 8,0) 3,33 (m) 3,08 (t, 8,0) 3,32 (m) 3,70 (m)/3,84 (m) 105,24 75,28 78,32 71,17 78,07 62,40 CH CH CH CH CH CH2 4,62 (d, 7,6) 3,32 (m) 3,32 (m) 3,30 (m) 3,33 (m) 3,73 (m)/3,84 (m) 105,53 75,47 77,80 71,33 78,04 62,52 a CD3OD, b 200 MHz, c 100 MHz, d 400 MHz # C GG1A (Glochierioside A [14]) 15 Hình 3.11 Phổ ROESY hợp chất GG1 3.2 Xác định cấu trúc hợp chất phân lập từ loài G hirsutum Phần trình bày chi tiết kết phân tích phổ xác định cấu trúc hợp chất phân lập từ loài G hirsutum: Hirsutoside A-E (GH1-GH5) Năm hợp chất hợp chất saponin khung olean-12-ene Hình 3.12 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ loài G hirsutum Dưới trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc hợp chất GH1 16 3.2.1 Hợp chất GH1 : Hirsutoside A Hợp chất GH1 phân lập dạng chất bột, vơ định hình màu trắng Công thức phân tử GH1 xác định C43H64O11 xuất pic ion giả phân tử [M + Na]+ m/z: 779,4370 phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS (tính tốn lý thuyết cho công thức [C43H64O11Na]+: 779,4346 đvC) Phổ 1H-NMR hợp chất GH1 cho thấy tín hiệu proton sáu nhóm methyl dạng singlet H 0,75 (3H, s), 0,96 (3H, s), 1,04 (3H, s), 1,06 (3H, s), 1,17 (3H, s) 1,34 (3H, s); proton olefin H 5,37 (1H, t, J = 3,0 Hz); năm proton thơm H 8,04 (2H, d, J = 8,0 Hz), 7,51 (2H, dd, J = 8,0 8,0 Hz) 7,62 (1H, t, J = 8,0 Hz) gợi ý có mặt nhóm phenyl; proton anome H 4,43 (1H, d, J = 8,0 Hz) gợi ý hợp chất có đơn vị đường Hình 3.13 Cấu trúc hóa học hợp chất GH1 hợp chất tham khảo GH1B Hình 3.14 Phổ HR-ESI-MS hợp chất GH1 Hình 3.15 Phổ 1H-NMR hợp chất GH1 Phổ 13C-NMR hợp chất GH1 xuất tín hiệu 43 carbon phân loại phổ DEPT thành: nhóm carboxyl (C 167,85), carbon khơng liên kết với hydro (C), 17 nhóm methine (CH), 11 nhóm methylene (CH2), nhóm methyl (CH3) Các tín hiệu giúp gợi ý cấu trúc khung olean-12-ene: sáu nhóm methyl C 13,39 (H 0,75, 3H, s), 16,60 17 (H 1,04, 3H, s), 17,45 (H 1,06, 3H, s), 18,85 (H 1,17, 3H, s), 27,41 (H 1,34, 3H, s) 29,43 (H 0,96, 3H, s); hai carbon olefin C 124,93 (H 5,37, 1H, t, 3,0 Hz) 142,99 Ngồi ra, tín hiệu cộng hưởng C 129,63; 130,43; 131,87; 134,23 167,85 xác nhận có mặt nhóm benzoyl Phân tích số liệu 1H- 13C-NMR GH1 nhận thấy tương đồng với hợp chất tham khảo 21β-benzoyloxy-3β,16β,23,28tetrahydroxyolean-12-ene (GH1B) cơng bố phần aglycone nhóm benzoyl [9], khác chỗ hợp chất GH1 có xuất thêm tín hiệu phần đường Vị trí nhóm quy kết giá trị phổ 1Hvà 13C-NMR hợp chất GH1 khẳng định lại phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều HSQC, HMBC, COSY Hình 3.16 Phổ 13C-NMR hợp chất GH1 Hình 3.17 Phổ HSQC hợp chất GH1 Các tương tác HMBC từ H-2 (δH 8,04)/ H-6 (δH 8,04) tới C-7 (δC 167,85), C-1 (δC 134,23) tương tác COSY H-2/H-3, H3/H-4, H-4/H-5, H-5/H-6 với tương tác trực tiếp phổ HSQC (H-2/C-2, H-3/C-3, H-4/C-4, H-5/C-5, H-6/C-6) cho phép quy kết giá trị phổ C-1, C-2, C-3, C-4, C-5, C-6, C-7 nhóm benzoyl Các tương tác HMBC H-29 (δH 0,96)/H-30 (δH 1,17) với C-19 (δC 47,95)/C-20 (δC 36,61)/C-21 (δC 78,17) với tương tác HMBC H-21 (δH 5,16) với C-7 (δC 167,85) nhóm benzoyloxy liên kết với aglycone C-21 Ngoài ra, tương tác HMBC từ H-24 (δH 0,75) tới C-3 (δC 83,33)/ C-4 (δC 43,89)/ C-5 (δC 48,11)/ C-23 (δC 64,82) giá trị độ chuyển dịch hóa học C-3 C-23 cho phép xác định liên kết C-O C-3 nhóm hydroxy tự C-23 18 Hình 3.18 Phổ HMBC hợp chất GH1 Hình 3.19 Phổ COSY hợp chất GH1 Các số liệu phổ carbon phần đường (δC 105,72, 75,63, 77,72, 71,56, 78,32, 62,73) với tín hiệu proton anome H 4,43 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1) kết thủy phân đường, phân tích GC cho thấy đơn vị đường D-glucose Tương tác HMBC H-1 (δH 4,43) với aglycone C-3 (δC 83,33), chuỗi tương tác quan sát phổ COSY gồm H-1/ H-2/ H-3/ H-4/ H-5/ H-6 với tương tác trực tiếp phổ HSQC proton cho phép qui kết giá trị phổ đơn vị đường glucose liên kết O-glycoside đường với aglycone C-3 Trên phổ NOESY GH1 quan sát thấy tương tác H-3 (δH 3,67), H-5 (δH 1,66) H-23 (δH 3,31 3,67) cho phép xác định proton H-3, H-5 nhóm CH2OH định hướng alpha, hay nhóm oxygen C-3 định hướng beta Ngoài ra, quan sát thấy tương tác NOESY H-21 (δH 5,16)/Hα-19 (δH 2,10)/H-29 (δH 0,96) với tương tác NOESY H-16 (δH 4,36) với H-27 (δH 1,34)/Hα-19 (δH 2,10) cho phép xác định H-16, H-21 định hướng alpha, suy nhóm oxygen C-16, C-21 định hướng beta Từ phân tích nêu trên, cấu trúc hóa học hợp chất GH1 xác định 21β-benzoyloxy-3,16,23,28tetrahydroxyolean-12-ene 3-O- -D-glucopyranoside Đây hợp chất theo sở liệu Scifinder, hợp chất GH1 đặt tên 19 Hirsutoside A Số liệu phổ 1H 13C-NMR GH1 tổng hợp bảng 3.2 Hình 3.20 Các tương tác COSY, HMBC NOESY hợp chất GH1 Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR hợp chất GH1 hợp chất tham khảo C 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 # C 39,4 28,2 73,6 43,4 48,9 19,0 33,2 40,6 47,7 37,5 24,4 124,1 143,1 44,2 37,2 67,2 44,7 43,5 47,7 36,4 77,7 31,0 Ca,b 39,62 26,31 83,33 43,89 48,11 18,81 33,29 41,06 48,14 37,51 24,72 124,93 142,99 44,55 36,48 67,88 44,74 43,64 47,95 36,61 78,17 30,21 DEPT CH2 CH2 CH C CH CH2 CH2 C CH C CH2 CH C C CH2 CH C CH CH2 C CH CH2 23 68,1 64,82 CH2 Ha,c (độ bội, J, Hz) 1,00 (m)/1,66 (m) 1,73 (m)/1,98 (m) 3,67 (dd, 3,5, 13,0) 1,66 (m) 1,44 (m)/1,57 (m) 1,36 (m)/1,74 (m) 1,27 (m) 1,96 (m) 5,37 (t, 3,0) 1,44 (m)/1,82 (m) 4,36 (dd, 5,0, 12,0) 2,51 (dd, 4,5, 14,0) 1,33 (m)/2,10 (m) 5,16 (dd, 5,0, 12,0) 1,73 (dd, 12,0, 13,5) 2,39 (dd, 5,0, 13,5) 3,67 (d, 13,0)/ 20 C # C Ca,b DEPT 24 25 26 27 28 13,7 16,7 17,5 27,4 66,9 13,39 16,60 17,45 27,41 66,58 CH3 CH3 CH3 CH3 CH2 29 30 21-O-Bz 1 2, 6 3, 5 4 7 3-O-Glc 1 2 3 4 5 6 29,6 19,3 29,43 18,85 CH3 CH3 Ha,c (độ bội, J, Hz) 3,31 (d, 13,0) 0,75 (s) 1,04 (s) 1,06 (s) 1,34 (s) 3,42 (d, 11,0)/ 3,73 (d, 11,0) 0,96 (s) 1,17 (s) 132,0 130,4 129,4 133,7 166,7 134,23 130,43 129,63 131,87 167,85 C CH CH CH C 8,04 (d, 8,0) 7,51 (dd, 8,0, 8,0) 7,62 (t, 8,0) - 105,72 75,63 77,72 71,56 78,32 62,73 CH CH CH CH CH CH2 4,43 (d, 8,0) 3,20 (t, 8,0) 3,36 (m) 3,31 (m) 3,30 (m) 3,67 (dd, 4,5, 12,0) 1,86 (dd, 2,0, 12,0) a đo CD3OD, b 125MHz, c 500 MHz, # C GH1B (21β-benzoyloxy 3β,16β,23,28-tetrahydroxyolean-12-ene) đo pyridine-D5, 100MHz [9] Hình 3.21 Phổ NOESY hợp chất GH1 3.3 Hoạt tính sinh học hợp chất phân lập đƣợc 3.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất phân lập từ loài G glomerulatum Kết đánh giá hoạt tính gây độc tế bào mười hợp chất GG1GG10 dòng tế bào ung thư A-549, MCF-7, OVCAR, HT-29 21 (bảng 2.2.) cho thấy hợp chất GG1, GG2, GG5 GG7 có nhóm benzoyloxy C-22 thể hoạt tính gây độc mạnh với dòng tế bào ung thư A-549, HT-29 OVCAR với giá trị IC50 dao động từ 5,9 µM đến 10,6 µM (tương đương với chất đối chứng dương mitoxantrone, IC50 dao động khoảng 3,1 µM đến 10,3 µM) Hợp chất GG3 thể độc tính dòng tế bào HT-29 OVCAR với giá trị IC50 tương ứng 7,3 µM 6,6 µM Hợp chất GG8-GG10 khơng có nhóm benzoyloxy C-22 thể hoạt tính gây độc yếu với giá trị IC50 từ 27,7 µM đến 94,9 µM Hợp chất GG4 khơng có nhóm C-16 C-22 biểu độc tính mạnh với giá trị IC50 9,7 µM 7,5 µM dòng tế bào ung thư A-549 HT-29 Tất mười hợp chất có hoạt tính gây độc yếu dòng tế bào ung thư MCF-7 Các kết phù hợp với nghiên cứu trước báo cáo hoạt tính gây độc hợp chất saponin khung oleanane với nhóm acyl C-21 C-22 dòng tế bào ung thư khác bao gồm A-549, HL-60 HCT-116 nhóm nghiên cứu công bố [43, 46, 84-86] Nghiên cứu cho thấy hoạt tính gây độc tế bào hợp chất GG1, GG2, GG5 GG7 dòng tế bào A-549, HT-29 OVCAR tương đương với mitoxantrone 3.3.2 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất phân lập từ loài G hirsutum Kết đánh giá hoạt tính gây độc tế bào năm hợp chất GH1-GH5 bốn dòng tế bào ung thư A-549, MCF-7, SW-626, HepG2 (bảng 2.4.) cho thấy hợp chất GH1, GH2, GH4 GH5 có nhóm benzoyloxy C-21 thể hoạt tính gây độc mạnh với bốn dòng tế bào ung thư A-549, MCF-7, SW-626 HepG2 với giá trị IC50 dao động từ 3,4 µM đến 10,2 µM (chất đối chứng dương ellipticine, IC50 dao động khoảng 1,4 µM đến 2,1 µM) Điều lần cho thấy hợp chất saponin khung oleanane có chứa nhóm acyl C-21 có tiềm thể hoạt tính gây độc tế bào, chống ung thư [43, 46, 8486] Hợp chất GH3 có chứa nhóm acetyloxy glc C-6" có hoạt tính gây độc tế bào yếu với giá trị IC50 dao động từ 47,0 µM đến 54,4 µM 22 Trong mối quan hệ cấu trúc hoạt tính gây độc tế bào hợp chất GH1-GH3: hợp chất có thêm đơn vị đường glc C-3" (hợp chất GH2) hoạt tính gây độc tế bào biểu mạnh hơn, nhiên, xuất nhóm acetyloxy glc C-6" (hợp chất GH3) hoạt tính gây độc tế bào thể yếu Nghiên cứu chứng tỏ hoạt tính gây độc tế bào GH2 thể bốn dòng tế bào ung thư người thử nghiệm A-549, MCF-7, SW-626, HepG2, tương đương với hoạt tính gây độc tế bào ung thư chất sử dụng làm đối chứng dương ellipticine KẾT LUẬN Đây cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học hai lồi Glochidion glomerulatum (Sóc chụm) Glochidion hirsutum (Sóc lơng) Việt Nam Nghiên cứu thành phần hóa học Sử dụng kết hợp phương pháp sắc ký, phương pháp phổ đại phân lập xác định cấu trúc 15 hợp chất từ hai loài G glomerulatum G hirsutum, hợp chất saponin khung olean-12-ene: - Từ loài G glomerulatum phân lập xác định cấu trúc 10 hợp chất mới: Glomeruloside I (GG1), Glomeruloside II (GG2), Glomeruloside A (GG3), Glomeruloside B (GG4), Glomeruloside C (GG5), Glomeruloside D (GG6), Glomeruloside E (GG7), Glomeruloside F (GG8), Glomeruloside G (GG9), Glomeruloside H (GG10) - Từ loài G hirsutum phân lập xác định cấu trúc hợp chất mới: Hirsutoside A (GH1), Hirsutoside B (GH2), Hirsutoside C (GH3), Hirsutoside D (GH4), Hirsutoside E (GH5) Nghiên cứu hoạt tính sinh học - Đã tiến hành đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư 10 hợp chất phân lập từ lồi G glomerulatum dòng tế bào ung thư 23 người là: A-529, HT-29, OVCAR, MCF-7 Kết cho thấy, hợp chất Glomeruloside I, II, Glomeruloside C, E thể hoạt tính gây độc mạnh với dòng tế bào ung thư A-549, HT-29 OVCAR với giá trị IC50 dao động từ 5,9 µM đến 10,6 µM Hợp chất Glomeruloside A thể hoạt tính gây độc mạnh dòng tế bào HT-29 OVCAR với giá trị IC50 tương ứng 7,3 µM 6,6 µM; Glomeruloside F-H thể hoạt tính gây độc yếu với bốn dòng tế bào thử nghiệm; Glomeruloside B biểu độc tính mạnh với giá trị IC50 9,7 µM 7,5 µM dòng tế bào ung thư A-549 HT-29 Tất mười hợp chất có hoạt tính gây độc yếu dòng tế bào ung thư MCF-7 - Đã tiến hành đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư hợp chất phân lập từ lồi G.hirsutum dòng tế bào ung thư người là: A-529, MCF-7, HepG2, SW-626 Kết cho thấy, hợp chất Hirsutoside A, B, D, E thể hoạt tính gây độc mạnh với bốn dòng tế bào ung thư A-549, MCF-7, SW-626 HepG2 với giá trị IC50 dao động từ 3,4 µM đến 10,2 µM Hợp chất Hirsutoside C có hoạt tính gây độc tế bào yếu bốn dòng tế bào thử nghiệm với giá trị IC 50 dao động từ 47,0 µM đến 54,4 µM KIẾN NGHỊ Hợp chất Glomeruloside B biểu độc tính mạnh với giá trị IC50 9,7 µM 7,5 µM dòng tế bào ung thư A-549 HT-29; hợp chất Glomeruloside I, II Glomeruloside C, E thể hoạt tính gây độc mạnh với dòng tế bào ung thư A-549, HT-29 OVCAR với giá trị IC50 dao động từ 5,9 µM đến 10,6 µM; hợp chất Hirsutoside A, B, D, E thể hoạt tính gây độc mạnh với bốn dòng tế bào ung thư A-549, MCF-7, SW-626 HepG2 với giá trị IC50 dao động từ 3,4 µM đến 10,2 µM Vì vậy, cần thêm nghiên cứu sâu chế gây độc tế bào, tác dụng dược lý hợp chất 24 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đây cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học hai lồi G glomerulatum G hirsutum Việt Nam Đã phân lập xác định cấu trúc 15 hợp chất từ hai lồi G glomerulatum G hirsutum Trong đó: - Từ loài G glomerulatum phân lập xác định cấu trúc 10 hợp chất mới: Glomeruloside I, Glomeruloside II, Glomeruloside A, B, C, D, E, F, G, H - Từ loài G hirsutum phân lập xác định cấu trúc hợp chất mới: Hirsutoside A, B, C, D, E Mười hợp chất phân lập từ lồi G glomerulatum đánh giá hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư người: A-529, HT-29, OVCAR, MCF-7 Kết Glomeruloside I, II Glomeruloside C, E thể hoạt tính gây độc mạnh với dòng tế bào ung thư A-549, HT-29 OVCAR (giá trị IC50 dao động từ 5,9 µM đến 10,6 µM) Hợp chất Glomeruloside A thể hoạt tính gây độc mạnh dòng tế bào HT-29 OVCAR với giá trị IC50 tương ứng 7,3 µM 6,6 µM; Glomeruloside F-H thể hoạt tính gây độc yếu với bốn dòng tế bào thử nghiệm; Glomeruloside B biểu độc tính mạnh với giá trị IC50 9,7 µM 7,5 µM dòng tế bào ung thư A-549 HT-29 Năm hợp chất phân lập từ loài G hirsutum đánh giá hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư người: A-529, MCF-7, HepG2, SW-626 Kết rằng, hợp chất Hirsutoside A, B, D, E thể hoạt tính gây độc mạnh với bốn dòng tế bào ung thư A-549, MCF-7, SW-626 HepG2 (giá trị IC50 dao động từ 3,4 µM đến 10,2 µM) Hợp chất Hirsutoside C có hoạt tính gây độc tế bào yếu bốn dòng tế bào thử nghiệm với giá trị IC50 dao động từ 47,0 µM đến 54,4 µM 25 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ Vu Kim Thu, Nguyen Van Thang, Nguyen Xuan Nhiem, Bui Huu Tai, Nguyen Hoai Nam, Phan Van Kiem, Chau Van Minh, Hoang Le Tuan Anh, Nanyoung Kim, Seonju Park, Seung Hyun Kim Oleane-type saponins from Glochidion glomerulatum and their cytotoxic activities Phytochemistry, 2015, 116, 213-220 Vu Kim Thu, Nguyen Van Thang, Nguyen Xuan Nhiem, Hoang Le Tuan Anh, Phạm Hải Yến, Chau Van Minh, Phan Van Kiem, Nan Young Kim, Seon Ju Park and Seung Hyun Kim Oleane-type saponins from Glochidion glomerulatum Natural Product Communications, 2015, 10(6), 875-876 Nguyen Van Thang, Vu Kim Thu, Nguyen Xuan Nhiem, Duong Thi Dung, Tran Hong Quang, Bui Huu Tai, Hoang Le Tuan Anh, Pham Hai Yen, Nguyen Thi Thanh Ngan, Nguyen Huy Hoang, and Phan Van Kiem Oleane-type Saponins from Glochidion hirsutum and Their Cytotoxic Activities Chemistry and Biodiversity, 2017, 14(5), 1-9 ... Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính gây độc tế bào lồi Sóc chụm (Glochidion glomerulatum) lồi Sóc lơng (Glochidion hirsutum) Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu luận án Nghiên cứu thành phần hóa học. .. hoạt tính gây độc tế bào thể yếu Nghiên cứu chứng tỏ hoạt tính gây độc tế bào GH2 thể bốn dòng tế bào ung thư người thử nghiệm A-549, MCF-7, SW-626, HepG2, tương đương với hoạt tính gây độc tế bào. .. ellipticine KẾT LUẬN Đây cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học hai lồi Glochidion glomerulatum (Sóc chụm) Glochidion hirsutum (Sóc lơng) Việt Nam Nghiên cứu thành phần hóa học Sử