Tóm tắt Luận án Tiến sỹ Hóa học: Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan từ một số loài rong nâu Việt Nam

28 109 0
Tóm tắt Luận án Tiến sỹ Hóa học: Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan từ một số loài rong nâu Việt Nam

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

Mục tiêu nghiên cứu của luận án là: Nghiên cứu phân lập, xác định các đặc điểm cấu trúc và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các fucoidan từ một số loài rong nâu sinh trưởng ở vùng biển Việt Nam phục vụ cho việc điều tra tài nguyên hợp chất thiên nhiên biển của Việt Nam và làm rõ bản chất hóa học của các đối tượng nghiên cứu.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - BÙI VĂN NGUYÊN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN TỪ MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU VIỆT NAM TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Chuyên ngành: Hóa học hợp chất thiên nhiên Mã số: 9440117 Hà Nội – 2018 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Bùi Minh Lý Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS Nguyễn Quyết Chiến Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 201… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Việt Nam quốc tế công nhận quốc gia có tính đa dạng sinh học cao giới, với nhiều kiểu rừng, đầm lầy, sông suối, biển,… Nằm trung tâm Đơng Nam Á, Việt Nam có tổng chiều dài bờ biển khoảng 3260 km làm ranh giới phía tây biển Đơng, với diện tích mặt nước rộng 1.000.000 km2 biển quan trọng giới, có nguồn rong biển đa dạng phong phú Trên giới có khoảng 6.000 lồi rong biển xác định chia làm 03 ngành rong dựa sắc tố chúng rong lục (Chlorophytes), rong nâu (Pheophytes) rong đỏ (Rhodophytes) Rong biển có vai trò quan trọng nguồn lợi sinh vật biển, ngày người khai thác, nuôi trồng sử dụng rộng rãi lĩnh vực thực phẩm , công nghiệp Theo kết nghiên cứu Việt Nam phát gần 1000 lồi rong biển, có khoảng 143 lồi rong nâu (Phaeophyta) nhóm rong có kích thước cá thể lớn dài với sinh lượng lớn Do vậy, rong nâu coi nguồn nguyên liệu vô quý giá tương lai cho nông nghiệp, công nghiệp sản xuất dược liệu, thực phẩm chức mỹ phẩm Trong ngành công nghiệp sản xuất dược liệu, rong nâu sử dụng làm nguồn nguyên liệu để chiết tách hợp chất có hoạt tính sinh học polysaccharide bao gồm fucoidan, laminaran, alginate hợp chất khác phlorotannin, mannitol,… với khả ứng dụng rộng lớn [1-6] Trong số polysaccharide từ rong nâu, fucoidan hợp chất đặc biệt quan tâm nghiên cứu có nhiều hoạt tính sinh học q chống đông tụ máu, kháng khuẩn, chống virus kể HIV, chống ung thư, chống nghẽn tĩnh mạch, điều biến miễn dịch, giảm lipid máu, chống oxy hóa, hạ cholesteron, đặc tính chống bổ thể, chống lại bệnh gan, đường tiết niệu, tác dụng bảo vệ dày khả điều trị phẫu thuật,… [6] Fucoidan sulfated polysaccharide có nguồn gốc từ rong nâu, có cấu trúc hóa học phức tạp tính đa dạng liên kết glycoside nhiều gốc đường đơn khác liên kết với khả phân nhánh với vị trí nhóm sulfate nhánh khác xếp không theo quy luật mạch polymer Thành phần cấu tạo nên fucoidan thường bao gồm chủ yếu fucose sulfate số gốc đường khác galactose, glucose, manose, xylose , đơi có axít uronic [6,7] Nhờ vào đa dạng cấu trúc hóa học sở hữu nhiều hoạt tính sinh học thú vị, sulfated polysaccharide (fucoidan) nghiên cứu mạnh sâu Việc giải thích làm sáng rõ xác cấu trúc hóa học fucoidan phức tạp, fucoidan tách từ rong nâu thường hỗn hợp nhiều cấu trúc sulfated polysaccharides khác Fucoidan thông thường có cấu trúc phân nhánh chứa nhiều monosaccharide khác có nhóm sulfate axtate [7,8] Fucoidan từ rong nâu thuộc chi Sargassum, Hormophysa Turbinaria có cấu trúc hóa học phức tạp [9,10] lại hấp dẫn hoạt tính ứng dụng chúng sẵn có tự nhiên Mặc dù có nhiều cơng trình nghiên cứu nhằm xác định cấu trúc tinh vi fucoidan công bố, có vài kết nghiên cứu phát tính quy luật cấu trúc fucoidan [10,11,12] liên kết gốc đường, phân nhánh, vị trí gốc sulfate, phân tử đường đơn khác… Cho tới nay, phần lớn cơng trình nghiên cứu hoạt tính sinh học tiến hành sản phẩm fucoidan thơ Vì vậy, mối quan hệ cấu trúc hoạt tính sinh học fucoidan thực tế chưa sáng tỏ [12,13,14] Để giúp cho việc nghiên cứu chế tác dụng fucoidan lên tế bào sinh vật tiến tới sử dụng fucoidan để bào chế dược liệu việc xác định xác cấu trúc hóa học fucoidan điều định thu hút ý nhiều nhà khoa học giới Chính tơi chọn tên đề tài luận án “Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc hoạt tính sinh học fucoidan từ số loài rong nâu Việt Nam” Mục tiêu nghiên cứu luận án là: Nghiên cứu phân lập, xác định đặc điểm cấu trúc thử nghiệm hoạt tính sinh học fucoidan từ số loài rong nâu sinh trưởng vùng biển Việt Nam phục vụ cho việc điều tra tài nguyên hợp chất thiên nhiên biển Việt Nam làm rõ chất hóa học đối tượng nghiên cứu Để đạt mục tiêu luận án, nội dung nghiên cứu luận án bao gồm: Nghiên cứu sàng lọc số loài rong nâu để chọn đối tượng nghiên cứu sâu cấu trúc hoạt tính sinh học fucoidan Nghiên cứu sâu cấu trúc hoạt tính sinh học fucoidan chiết xuất từ số loài rong nâu chọn lọc Khảo sát mối quan hệ đặc điểm cấu trúc hoạt tính sinh học số fucoidan chọn lọc Bố cục luận án: Luận án gồm 175 trang: Mở đầu trang, Chương Tổng quan 45 trang, Chương Đối tượng phương pháp nhiên cứu 21 trang, Chương Thực nghiệm 15 trang, Chương Kết thảo luận 79 trang, Kết luận kiến nghị trang, Danh mục công trình cơng bố trang, Tài liệu tham khảo 12 trang, có 31 bảng biểu 64 hình ảnh Chương TỔNG QUAN Rong biển hay gọi tảo kích thước lớn, rong biển thực vật bậc thấp sống tự dưỡng cách quang hợp, hình thái dạng tản Rong biển sinh trưởng phát triển nhanh, có vòng đời sinh trưởng khơng q năm, tốc độ tăng trọng nhanh tạo sinh khối lớn [1,4] Tổng số loài rong biển giới báo cáo chủ yếu thuộc ngành chính, có 900 loài thuộc ngành rong lục (Chlorophyta), 1500 loài thuộc ngành rong nâu (Phaeophyta) 4000 loài thuộc ngành rong đỏ (Rhodophyta) có nhiều cơng trình nghiên cứu phát loài bổ sung vào tổng số loài rong biển phân bố toàn giới Fucoidan sulfated polysaccharide phân lập từ rong nâu lần Kylin vào năm 1913 [23] Theo danh pháp carbohydrate, vì polysaccharide tạo nên fucose sulfate đặt tên sulfate fucan Sulfated polysaccharide có nguồn gốc từ rong nâu động vật thực tế có mặt ngành Da gai (echinoderms), cụ thể cầu gai hải sâm [10] Nhưng ngược lại, cấu trúc sulfated polysaccharide từ rong nâu phức tạp nhiều thành phần Ngoài fucose sulfate, chúng chứa thêm monosaccharide khác như: galactose, xylose, manose, axít glucuronic,… đồng thời bị acetyl hóa phần Cấu trúc hóa học chi tiết polymer sinh học phức tạp nhiều trường hợp chưa biết đến Sulfated polysaccharide (Fucoidan) hợp chất đặc biệt quan tâm nghiên cứu nhờ hoạt tính sinh học đa dạng đặc thù chúng như: kháng đông tụ, kháng huyết khối, kháng virut, kháng dính, kháng tạo mạch (antiangiogenic), kháng viêm, kháng u, kháng bổ thể (anticomplementary), điều biến hệ miễn dịch, ngừa thai [6] Vì vậy, mà fucoidan trở thành nguồn tiềm cho ứng dụng làm thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ dưỡng, dược liệu, số cơng trình nghiên cứu fucoidan tăng vọt khoảng 10 năm trở lại [25] Khi nghiên cứu tổng quan tình hình nghiên cứu ngồi nước chúng tơi rút kết luận sau: Các nghiên cứu hàm lượng, thành phần hóa học đặc điểm cấu trúc fucoidan tách chiết phân lập từ loài rong nâu Sargassum feldmannii, Sargassum duplicatum, Sargassum denticapum Sargassum binderi, chưa nghiên cứu đầy đủ hệ thống Về nghiên cứu cấu trúc hoạt tính fucoidan từ hai loài rong nâu nghiên cứu luận án Sargassum aquifolium Turbinaria decurrens chưa nghiên cứu ngồi nước Cấu tạo hóa học fucoidan từ loài rong nâu: Sargassum polycystum (Fsp), Sargassum mcclurei (Fsm), Sargassum oligocystum (Fso), Sargassum denticarpum (Fsd), Sargassum swatzii (Fsw) Tubinaria ornata (Fto), nghiên cứu công trình trước, nhiên chưa có nghiên cứu nói mối quan hệ cấu tạo mạch nhánh fucoidan với hoạt tính gây độc tế bào Vì chúng tơi nghiên cứu mối quan hệ hình dạng, kích thước với hoạt tính sinh học fucoidan nhánh từ loài rong Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu luận án sulfated polysaccharides (fucoidan) phân lập từ số loài rong nâu Rong nâu thu thập vùng biển vịnh Nha Trang, Khánh Hòa, Việt Nam Đối tượng nghiên cứu luận án cụ thể sau: Fucoidan phân lập từ rong nâu Sargassum aquifolium (FSA) Turbinaria decurrens (FTD), fucoidan dùng để nghiên cứu cấu trúc hóa học hoạt tính sinh học luận án Hai lồi rong nâu đối tượng luận án Fucoidan từ loài rong nâu: Sargassum polycystum (Fsp), Sargassum mcclurei (Fsm), Sargassum oligocystum (Fso), Sargassum denticarpum (Fsd), Sargassum swatzii (Fsw) Tubinaria ornata (Fto), fucoidan nghiên cứu cấu trúc, dùng để nghiên cứu mối quan hệ cấu trúc hoạt tính sinh học Fucoidan từ loài rong nâu Sargassum feldmannii, Sargassum duplicatum, Sargassum denticapum Sargassum binderi, đối tượng nghiên cứu thành phần hóa học đặc điểm cấu trúc fucoidan 2.2 Phương pháp nghiên cứu Các phương pháp nghiên cứu sử dụng là: Chiết tách fucoidan từ rong nâu phương pháp chiết tách thông thường, tham khảo công bố giới phù hợp với đối tượng mục đích nghiên cứu luận án Các phương pháp để xác định thành phần cấu trúc fucoidan kết hợp phương pháp sắc ký, phương pháp hóa học, phổ đại (IR, NMR, MS, SAXS) phép thử hoạt tính sinh học Xác định cấu trúc polysaccharide nói chung fucoidan nói riêng thách thức lớn hóa học chất hữu có gốc đường Cấu trúc fucoidan chiết từ rong nâu thường phức tạp, bao gồm nhiều vấn đề thành phần đường đơn, dạng đồng phân đường, mức độ phân nhánh polymer hóa chúng Vì vậy, để xác định cấu trúc fucoidan cần phải phân tích, xác định thông số sau: Thành phần gốc đường hàm lượng sulfate, vị trí nhóm sulfate gốc đường, vị trí liên kết gốc đường, trật tự xếp gốc đường Chương THỰC NGHIỆM 3.1 Thu thập xử lý rong Rong nâu thu thập vùng biển Vịnh Nha Trang, Khánh Hòa, Việt Nam Thời gian thu mẫu rong nâu vào tháng năm 2014 Các mẫu rong nâu phân loại TS Lê Như Hậu (Viện Nghiên cứu Ứng dụng công nghệ Nha Trang), tất tiêu lưu giữ Viện Nghiên cứu Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Rong nâu thu hoạch, rửa nước biển để loại bỏ cát, đất, chất bẩn khác,…Sau thu hoạch tiếp tục phơi khô tự nhiên Mẫu rong sau phơi khô cắt nhỏ trước đem tách chiết fucoidan 3.2 Chiết tách phân lập fucoidan từ rong nâu Hình 3.3 Sơ đồ chiết tách phân đoạn fucoidan rừ rong nâu Sargassum aquifolium Hình 3.4 Sơ đồ chiết tách phân đoạn fucoidan rừ rong nâu Turbinaria decurrens Hình 3.5 Sơ đồ chiết tách phân đoạn fucoidan rừ loài rong nâu S.polycystum (Fsp), S.mcclurei (Fsm), S.oligocystum (Fso), S.denticarpum (Fsd), S.swatzii (Fsw) T.ornata (Fto) Hình 3.6 Qui trình chiết theo Bản quyền Nga (Patent WO 2005/014657) [109] 3.3 Xác định thành phần cấu trúc fucoidan 3.3.1 Xác định hàm lượng tổng carbohydrate 3.3.2 Xác định thành phần monosaccharide 3.3.3 Xác định hàm lượng sulfate 3.3.4 Phương pháp khử sulfate 3.3.5 Xác định hàm lượng axít uronic 3.3.6 Phân tích liên kết methyl hóa 3.3.7 Thủy phân tạo oligosaccharide 3.3.8 Sắc ký thẩm thấu gel (GPC) 3.3.9 Phổ IR 3.3.10 Phổ NMR 3.3.11 Phổ ESI-MS/MS 3.3.12 Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) 3.4 Đánh giá hoạt tính sinh học Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp chiết tách fucoidan Chúng tơi sử dụng quy trình chiết tách fucoidan Bilan cộng [87] để nghiên cứu cấu trúc hoạt tính sinh học fucoidan 4.2 Hàm lượng fucoidan số polysaccharide tan nước 06 loài rong nâu sinh trưởng biển Nha Trang, thành phần hóa học fucoidan thu Trong nội dung nghiên cứu này, 06 loài rong nâu sinh trưởng vịnh Nha Trang khảo sát thành phần polysaccharide tan nước, bao gồm fucoidan, laminaran alginat Hàm lượng fucoidan xác định cách phân lập trực phương pháp Bilan cs Hàm lượng laminaran alginat xác định tách chiết thơng thường quy trình tách fucoidan Kết phân tích cho thấy:  Fucose chiếm hàm lượng đáng kể từ 9.2 - 62.9% tất mẫu fucoidan, hàm lượng fucose cao fucoidan chiết từ rong Turbinaria decurrens (62.9%) thấp fucoidan chiết từ rong Sargassum aquifolium (9,2%)  Hàm lượng galactose fucoidan chiết từ loài rong thuộc chi Sargassum chiếm tỉ lệ tương đối cao đứng sau hàm lượng fucose Trong đó, mẫu fucoidan chiết từ Turbinaria decurrens có hàm lượng galactose gần nửa so với fucose  Ngoài hai thành phần fucose galactose, tất mẫu fucoidan lồi rong nghiên cứu có thêm đường đơn khác với hàm lượng nhỏ mannose, xylose glucose  Hàm lượng gốc đường biến đổi theo chi rong loài rong khác nhau, nhiên chi rong chúng biến đổi không nhiều Các kết hồn tồn phù hợp với cơng bố trước đa dạng thành phần hóa học fucoidan [6,20]  Bên cạnh thành phần gốc đường, phân tử fucoidan chứa gốc sulfate axít uronic Hàm lượng sulfate mẫu fucoidan khác không nhiều (bảng 4.2), dao động khoảng 21.9-25.6% so với lượng mẫu phân tích, lớn fucoidan rong Sargassum binderi (25.6%) nhỏ fucoidan chiết từ rong Sargassum duplicatum (21.9%) Điều cho thấy đa dạng thành phần hóa học fucoidan lồi rong khác nhau, chí chi rong Sargassum Việt Nam Brasil có thành phần khác Nhìn chung fucoidan rong nâu sinh trưởng vùng biển ơn đới thường có thành phần đường tương đối đơn giản, chúng có gốc đường fucose lượng nhỏ đường đơn khác Trong fucoidan rong nâu biển nhiệt đới nói chung biển Việt Nam nói riêng phần lớn thuộc nhóm galactofucan, thành phần chủ yếu chứa hai gốc đường fucose galactose với lượng nhỏ gốc đường khác rhamnose, xylose, mannose, glucose, Sự khác thành phần hàm lượng đường đơn fucoidan từ loài rong khác lần khẳng định điều kiện mơi trường có ảnh hưởng lớn đến trình sinh tổng hợp polysaccharide rong nâu 4.3 Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc fucoidan từ hai loài rong nâu S binderi S duplicatum Trong nội dung này, nghiên cứu sơ số đặc điểm cấu trúc fucoidan từ hai lồi rong nâu Sargassum binderi S duplicatum Q 4.trình chiết tách, hiệu suất phân lập thành phần cấu tạo fucoidan tổng hai loài rong nâu trình bày nội dung 4.2 luận án Các kết trình bày Bảng 4.1 Bảng 4.3.1 Nội dung kết nghiên cứu loài Sargassum binderi Tách phân đoạn fucoidan tổng FSB rong nâu Sargassum binderi cột sắc ký trao đổi anion DEAE-cellulose rửa giải với dung dịch muối NaCl 0.5M, 1M, 1.5M 2.0M cho 04 Như vậy, phân đoạn fucoidan rong nâu Sargassum binderi với thành phần đường fucose galactose lượng lớn sulfat gọi galactofucan sulfat hóa Trong fucoidan số loài rong nâu khác thuộc Fucales sống vùng ôn đới Fucus evanescens, Fucus vesiculosus thành phần chúng chứa fucose sulfat gọi fucan sulfat hóa [68,35] Phổ 13C-NMR phân đoạn F2 tách từ rong nâu Sargassum binderi trình bày Hình 4.4 Phổ có nhiều tín hiệu mạnh vùng anomeric (99.7 - 103.18 ppm) vùng từ trường cao (15.40 ppm 16.16 ppm) tín hiệu điển hình gốc α-L-fucopyranoside Các tín hiệu vùng 67 -84 ppm nguyên tử C2 - C5 vòng pyranoid Các tín hiệu 61.5 ppm ứng với nhóm CH2OH gốc β-Dgalactopyranose tín hiệu 65.0 ppm nhóm CH2OR cho gốc O-6-β-D-galactopyranose Một số tín hiệu mạnh 173.7 - 174.6 ppm 20.92 ppm khẳng định diện nhóm O-acetyl Phổ 1H-NMR F2 bao gồm vài tín hiệu mạnh vùng α-anomeric (5.09 - 5.23 ppm) vùng trường cao (1-1.5 ppm) Trong tín hiệu vùng 2.0 - 2.2 ppm xác định diện nhóm Oacetyl Cấu trúc fucoidan tách từ rong nâu Sargassum binderi Malaysia nghiên cứu công bố vào năm 2016 [84] 4.3.2 Nội dung kết nghiên cứu loài Sargassum duplicatum Kết xác định thành phần hóa học (Bảng 4.4.) cho thấy phân đoạn SDAuF1 SDAuF2 có đường fucose galactose thành phần đường trung tính Fucose phân đoạn SDAuF2 cao (59,5 %) phân đoạn SDAuF1 (40 %), phân đoạn SDAuF2 khơng có xuất đường mannose Cả phân đoạn khơng có xuất đường glucose, phân đoạn SDAuF2 hàm lượng xylose chiếm lượng nhỏ Fucoidan tổng FSDu phân lập từ rong nâu S duplicatum với hiệu suất 2,28% theo phươn pháp Bilan cs Trên phổ hồng ngoại IR hình 4.6 FSDu xuất tín hiệu hấp thụ 1.244 cm-1 (vùng dao động đặc trưng liên kết S=O) Vùng tín hiệu đặc trưng cho liên kết C – O – S 800-845 cm-1 rõ Giống nhiều fucoidan chiết xuất từ rong nâu khác giới, fucoidan FSDu từ rong nâu S duplicatum có phổ 1H-NMR phức tạp có nhiều pic chồng chất lên (Hình 4.7.) Tuy nhiên phổ 1H-NMR có tín hiệu cộng hưởng đặc trưng giúp cho việc nhận biết fucoidan Đó tín hiệu xuất vùng proton anomer (5,0 – 5,5 pm) tín hiệu vùng trường cao (1,2 - 1,5 ppm) nhóm CH3 vòng α-L-Fucopyranose Trên phổ 1H-NMR fucoidan từ rong nâu S duplicatum xuất tín hiệu đặc trưng giúp ta nhận biết fucoidan Đó tín hiệu vùng 1,2 - 1,4 ppm (nhóm methyl fucose) 5,1-5,3 ppm (H-anomer gốc →3)-α-L-Fucp(1) Các tín hiệu 5,3 ppm 3,5 ppm đặc trưng cho H-1 H-6 gốc β-D-galactose Ngồi tín hiệu 2,1 - 2,3 ppm xác nhận có mặt nhóm O-acetyl phân tử fucoidan Trong cơng trình nghiên cứu độc lập với luận án này, cấu trúc xác fucoidan FSDu xác định bới Usoltseva cộng thuộc Viện Hàn lâm khoa học Nga Viễn đơng [113] Theo fucoidan galactofucan sulfat hóa acetyl hóa FSDu có cấu trúc phân nhánh phức tạp làm cho phổ NMR khó giải thích Mạch cấu tạo chủ yếu gốc 4)-α-LFuc-(1 β-D-Gal luân phiên liên kết với Mạch nhánh liên kết với O-6 galactose cấu tạo gốc fucose có liên kết mạch O-3 có nhóm sulfat vị trí O-2 O-4 Mạch nhánh có đến gốc đường nhiều Kết luận chung cho nội dung nghiên cứu 4.2 4.3 nhằm lựa chọn đối tượng rong nâu để nghiên cứu sâu cấu trúc hoạt tính:  Kết phân tích fucoidan thành phần polysaccharid tan nước khác fucoidan loài rong thuộc chi rong khác khác nhau, loài rong thuộc chi rong hay loài rong khác thành phần tỉ lệ mol gốc đường đơn Điều cho thấy thành phần đặc điểm cấu trúc fucoidan vô phức tạp Tuy nhiên, fucoidan loài rong có đặc điểm chung bên cạnh hàm lượng sulfat cao, hai đường fucose galactose chiếm hàm lượng lớn so với gốc đường khác, với đặc điểm chúng gọi galactofucan sulfat hóa Theo tài liệu cơng bố, fucoidan rong nâu nói chung galactofucan 12 2,3,6 →4Hexp→ 10 15 2,3,6 →4Hexp→ 2,4,6 →3Hexp→ - 2,3,4 →6Hexp→ 21 2,6 →3,4Hexp→ - 4,6 →2,3Hexp→ 3 - tr 3,6+4,6 3,6 →2,4Hexp→ 3 tr 2,3 →4,6Hexp→ 2 2,4 →3,6Hexp→ 10 - - 3,4+2,4 →3,4,6Hexp→ tr →2,3,6Hexp→ - →2,4,6Hexp→ - 10 3(4) - 3(4) 2 Gal - Các kết phân tích trình bày Bảng 4.7 cho thấy:  Có nhiều fucitol methyl hóa có nguồn gốc từ gốc fucofuranose Đây điểm đặc biệt vì trước có trường hợp tìm thấy có mặt lượng đáng kể fucofuranose loài Chordaria flagelliformis [8]  Các polysaccharid sulfat hóa bao gồm chủ yếu gốc fucose hai, chí đến ba lần Như vậy, nằm chuỗi mạch thẳng chúng phải gắn với nhóm sulfat mạch nhánh  Các mẫu tách loại sulfat chứa nhiều gốc fucose đầu mạch không khử (terminal nonreducing residues) Có khả chúng liên kết với đường đơn khác loại nằm mạch  Hàm lượng mannose 1,5M-deS khơng đáng kể Vì tất hexitol methyl hóa bắt nguồn từ gốc galactose Phần lớn gốc có gắn kết C-4 C-6  Phân đoạn fucoidan mẹ FSA-1,5M có gốc galactose có gắn kết C-6, hầu hết số lại có thêm nhóm khác, có khả fucose sulfat  Phân đoạn 1,0M-deS có hàm lượng mannose galactose khơng khác nhiều Điều làm cho việc phân tích kiện methyl hóa FSA-1,0M 1,0M-deS trở nên phức tạp dẫn xuất methyl hóa hai hexose khơng thể phân biệt phương pháp phổ khối lượng 13 4.4.2.4 Tách 1,0M-deS cột sắc ký trao đổi anion Bảng 4.8 Hiệu suất thành phần (%) phân đoạn tách 1,0M-deS cột sắc ký trao đổi anion so sánh với fucoidan mẹ chúng Fucoidan H% Fuc Xyl Man Glc Gal Axít SO3Na Uronic FSA-1.0M 21.9 c 1.0MdeS 15.9 5.9 3.5 2.2 11.3 13.6 21.8 8.1 4.0 7.8 4.3 14.0 30.6 2.8 deS-1 3.1 c 5.7 15.9 5.4 8.0 30.1 2.5 n.d deS-2 13.8 c 15.4 12.1 2.3 3.3 38.8 7.1 2.3 deS-3 15.4 c 16.4 10.1 4.5 5.1 24.1 12.1 1.9 deS-4 34.6 c 6.7 2.4 8.4 2.9 4.2 40.9 n.d deS-5 13.8 c 11.4 3.7 4.4 3.1 5.3 47.0 1.5 deS-6 7.6c 7.4 2.6 4.0 2.7 3.0 51.1 1.5 c % 1,0MdeS 4.4.2.5 Các đặc điểm cấu trúc deS-2 deS-3 Các tín hiệu mạnh vùng H-anomer phổ 1H-NMR phân đoạn deS-2 tìm thấy δH 5,3 (d, J = Hz), 4,45, 4,47 4,49 ppm (d, J = Hz) Các phổ COSY, TOCSY ROESY tín hiệu thuộc α-Galp, β-Xylp, β-Galp Phổ HSQC deS-2 (Hình 4.15) cho phép gán tín hiệu phổ 13C deS-2 trình bày Bảng 4.9 Hình 4.15 Một phần phổ HSQC deS-2 14 Hình 4.16 Các mảnh cấu trúc fucoidan desulfat hóa deS-2 (các gốc đường dạng pyranose) Bảng 4.9 Kết gán phổ 1H- 13C-NMR deS-2 H-1 H-2 H-3 H-4 H-5 H-6 C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 5.31 3.88 3.96 4.25 4.18 3.85,385 101.7 70.6 70.0 80.0 73.0 61.9 4.45 3.81 3.77 4.15 3.73 3.77,3.77 104.4 71.7 81.6 69.6 76.3 62.2 4.45 3.81 3.77 4.11 3.80 4.06,3.97 104.4 71.7 81.6 69.7 74.2 70.7 4.49 3.30 3.48 3.65 4.00,3.32 - 102.9 74.2 77.0 70.5 66.4 - 4.47 3.32 3.58 3.80 4.12,3.40 - 104.6 74.0 75.0 77.5 64.2 - 4.49 3.56 3.69 4.02 3.98 4.04,4.04 104.6 72.1 74.0 70.5 74.7 71.8 deS-2 A B C 4)-α-D-Gal -(1 3)- -D-Gal -(1 3,6)- -D-Gal -(1 D - -D-Xyl -(1 E F 4)- -D -Xyl -(1 6)- -D-Gal -(1 Các kiện NMR nêu cho phép rút kết luận số đặc điểm cấu trúc deS-2 sau:  Tất gốc α-Galp có vị trí liên kết C-4  Gốc β-Galp có vị trí liên kết C-3 C-6, vị trí liên kết C-3 C-6  Còn gốc β-Xylp có vị trí liên kết C-4 chiếm giữ vị trí đầu mút khơng khử mạch nhánh 15 ppm 1D/6C 1А/3А 70 72 1А/5А 74 76 1E/4E 1D/4E 1B/4А 78 80 1А/3B 82 Hình 4.17 Một phần phổ HMBC deS-2 Cấu trúc chuỗi mạch deS-2 kết xuất sở phân tích phổ HMBC (Hình 4.17) Cụ thể phổ HMBC xuất tín hiệu ứng với tương tác 1H/13C gốc đường sau: H-1(α-Galp, A)/C-3(β-Galp, B C), H-1(β-Galp, B)/C-4(α-Galp, A), H-1(β-Xylp, D)/C-6(β-Galp, C), H-1(β-Xylp, D)/C-4(β-Xylp, E), H-1(β-Galp, F)/C-6(β-Galp, F) (thành phần thứ yếu) Các kiện nêu gợi ý có mặt mạch có cấu trúc sau: →4)-α-Galp- (1→3)-β-Galp-(1→ Trong cấu trúc đó, phần gốc β-Galp gốc β-Xylp chuỗi ngắn (1→4)-β-Xylp có từ gốc đường trở lên Hàm lượng fucose xylose phân đoạn deS-2 giống nhau, cố gắng xác định vị trí gốc fucose phương pháp phổ NMR không cho kết Các phổ NMR hai chiều deS-2 có mặt lượng nhỏ homopolymer (1→6)-β-Galp Nó mạch nhánh nằm bên cạnh mạch xylose gắn với mạch C-6 gốc →3)-β-Galp-(1→ Nó polysaccharid riêng rẽ, khơng liên kết với polymer Kết phân tích liên kết methyl hóa mẫu deS-2 (Bảng 4.7) xác nhận có mặt mạch với gốc Galp luân phiên liên kết với C-4 C-3 mang mạch nhánh C-6 Hơn nữa, chúng cho thấy có mặt của:  Một lượng nhỏ Galp có liên kết mạch C-6  Các Fuc hai dạng fucopyranose fucofuranose có liên kết mạch khác  Các Xyl đầu mạch Xyl liên kết mạch C-4 Kết phân tích liên kết methyl hóa cho thấy mạch polysaccharid deS-3 cho thấy deS-3 có đặc điểm cấu trúc tương tự deS-2 Tuy nhiên có điểm khác biệt sau:  Chứa nhiều Gal liên kết C-4 Gal liên kết C-3  Các gốc Gal liên kết C-6 gần hoàn toàn vắng mặt  Gốc Xyl đầu mạch chiếm ưu vượt trội so với Xyl liên kết C-4 16 Trước có số cơng bố fucogalactan, ví dụ từ loại rong nâu Undaria pinnatifida [115,116,117] Laminaria japonica [118,119] Các kết nghiên cứu nêu làm rõ phần đặc điểm cấu trúc fucogalactan deS-2 deS-3 từ S aquifolium Tuy nhiên, cấu trúc xác polysaccharid phân nhánh câu hỏi cho nghiên cứu tương lai 4.4.2.6 Các đặc điểm cấu trúc deS-4 Phổ HSQC deS-4 trình bày Hình 4.18, phổ HMBC Hình 4.19 Hình 4.18 Phổ HSQC deS-4 Hình 4.19 Một phần phổ HMBC deS-4 Kết phân tích phổ NMR hai chiều deS-4 theo cách tương tự trình bày cho thấy:  Polysaccharid có mạch chủ tạo thành gắn kết luân phiên gốc 2)-α-DManp-(1 )4-β-D-GlcpA-(  Khoảng nửa số gốc mannose có mạch nhánh O-3 gốc đường α-L-Fucp 4-β-DGlcpA với tỉ lệ 4:1 17 Trình tự gốc đường đơn mạch xác định phổ HMBC tương tác xa proton anomer sau (ký hiệu xem Hình 4.19): H-1(α-Manp, S)/C-4(β-GlcpA, R), H-1(α-Manp, U)/C-4(β-GlcpA, T), H-1(β-GlcpA, R)/C-2(αManp, U), H-1(β-GlcpA, T)/C-2(α-Manp, S) Vị trí α-Fucp β-Xylp O-3 α-Manp xác nhận tương tác tương ứng sau: H-1(α-Fucp, V)/C-3(α-Manp, U), H-1(β-Xylp, G)/C-3(α-Manp, U) Các đặc điểm cấu trúc xác nhận kết phân tích dẫn xuất metyl hóa Trước đây, fucoglucuronomannan tương tự polysaccharid deS-4 tìm thấy nhiều loài rong nâu khác Đặc biệt, polysaccharid từ rong nâu Kjellmaniella crassifolia có cấu trúc phân nhánh với mạch cấu tạo đơn vị trisaccharid lặp lặp lại (Các polysaccharid tương tự có khả có mặt lồi Saccharina latissima Laminaria bongardiana Gần đây, có nghiên cứu cho thấy cấu trúc gồm mạch nhánh fucooligosaccharide ngắn nằm kề bên với mạch nhánh có nhóm Fucp có mặt fucoglucuronomannan từ rong nâu Kjellmaniella crassifolia Còn cấu trúc mà mạch nhánh có gốc Xylp deS-4 S aquifolium lần tìm thấy Hình 4.20 Mảnh cấu trúc deS-4 Bảng 4.10 Kết gán phổ 1H- 13C-NMR deS-4 deS-4 S Uv UG T R 2)- -D-Man -(1 - -D-Man -(1 2,3)- -D-Man -(1 - -D-Gle A-(1 4)- -D-Gle A-(1 V -L-Fuc -(1 H-1 H-2 H-3 H-4 H-5 H-6 C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 5.38 4.14 3.81 3.69 3.69 3.84,3.79 100.0 79.0 70.9 68.0 74.0 61.5 5.36 4.32 3.89 3.83 3.74 3.84,3.79 99.8 74.6 74.7 66.0 74.0 61.5 5.36 4.34 3.84 3.80 3.74 3.84,3.79 99.8 73.9 76.5 65.9 74.0 61.5 4.46 3.38 3.65 3.78 3.75 - 102.8 74.2 77.5 78.8 77.6 176.0 4.46 3.38 3.65 3.78 3.75 - 103.0 74.2 77.5 78.0 77.6 176.0 5.08 3.79 3.93 3.81 4.22 1.20 96.4 69.2 70.5 73.1 67.9 16.6 4.38 3.30 3.44 3.62 4.00,3.29 - 18 G -D-Xyl -(1 104.6 74.4 77.0 70.6 66.5 - 4.4.2.7 Các đặc điểm cấu trúc deS-6 Phổ HSQC deS-6 trình bày Hình 4.21, phổ HMBC Hình 4.22 Hình 4.21 Phổ HSQC deS-6 Hình 4.22 Một phần phổ HMBC deS-6 Phân đoạn deS-6 bật hàm lượng axít uronic cao Phổ HSQC (Hình 4.21) cho thấy thành phần glucuronan Nó có mạch β-D-GlcpA gốc β-D-Xylp α-LFucp (thứ yếu) vị trí C-4 liên kết với qua C-3 (Hình 4.21) Cấu trúc mạch xác định cường độ mạnh tín hiệu tương tác β-GlcpA H1/C-3 phổ HMBC (Hình 4.22) Vị trí α-Fucp β-Xylp O-4 β-GlcpA xác định tín hiệu có cường độ mạnh tương tác H-1(β-Xylp, K)/C-4(β-GlcpA, YK) H-1(α-Fucp, H)/C-4(βGlcpA,YH) (thứ yếu) Một fucoglucuronan tương tự tìm thấy với vai trò thành phần nhỏ fucoidan chiết xuất từ rong nâu Saccharina latissima Bên cạnh fucoglucuronan, deS-6 chứa lượng đáng kể fucoglucuronomannan, thành phần phân đoạn deS-4 19 Hình 4.23 Mảnh cấu trúc deS-6 Bảng 4.11 Kết gán phổ 1H- 13C-NMR deS-6 4.4.2.8 Các đặc điểm cấu trúc deS-5 Phân đoạn deS-5 hỗn hợp có tỉ lệ gần 1:1 fuco(xylo)glucuronomannan xylo(fuco)glucuronan, thành phần deS-4 deS-6 4.4.2.9 Nghiên cứu số đặc điểm cấu trúc phân đoạn FSA-1,5M phương pháp phân tích methyl hóa kết hợp với phổ ESI-MS/MS Tất kiện thu cho phép ta rút đặc điểm khái quát cấu trúc sau cho fucoidan FSA-1,5M:  Fucoidan FSA-1,5M có hàm lượng sulfat cao (31,5%), cấu tạo chủ yếu từ α-L-fucose (19,2%) galatose (5,5%) Đường fucose tồn hai dạng vòng pyranose furanose Đường galactose có dạng pyranose  Fucoidan FSA-1,5M có cấu trúc phân nhánh cao Mạch cấu tạo chủ yếu gốc fucose liên kết luân phiên với vị trí O-3 O-4 Các gốc galactose nằm đầu không khử liên kết với O-3 fucose tạo thành mạch nhánh  Trong cấu trúc lõi, nhóm sulfat chủ yếu nằm vị trí O-2 gốc fucose galactose 4.4.3 Đánh giá hoạt tính sinh học 4.4.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào Hoạt tính gây độc tế bào FSA phân đoạn tách sắc ký thử nghiệm dòng tế bào ung thư gan Hep-G2, ung thư phổi LU-1 ung thư mô liên kết RD theo phương pháp hành Viện nghiên cứu ung thư quốc gia USA [120,121] Thử nghiệm sơ thực nồng độ 100 g/ml với chứng dương ellipticin Hoạt tính gây độc tế bào biểu diễn tỉ lệ phần trăm tế bào 20 sống sót có mặt chất thử nồng độ định (Bảng 4.13) Các kết thử nghiệm cho thấy FSA-1,5M thể hoạt tính gây độc tế bào dòng ung thư gan Hep-G2 ung thư phổi LU-1, giá trị IC50 tương ứng 60,7 80,0 µg/mL Còn FSA-2,0M thể hoạt tính gây độc tế bào dòng ung thư gan Hep-G2 ung thư mô liên kết RD, giá trị IC 50 tương ứng 46,7 81,0 µg/mL Bảng 4.13 Tỉ lệ sống sót tế bào ung thư có mặt phân đoạn fucoidan từ FSA TT Nồng độ Chất thử Tỉ lệ tế bào sống sót CS (%) (g/mL) Hep-G2 LU-1 RD FSA-1.5M 100 40,50,8 41,20,3 70,21,3 FSA-2.0M 100 29,30,5 78,250,2 40,51,3 Ellipticin 0,50,5 1,10,2 0,030,0 4.4.3.2 Hoạt tính chống khối u in vitro Các kết nêu cho phép đưa kết luận hai mẫu thử nghiệm có khả ức chế rõ rệt hình thành khối u tế bào ung thư dòng Hep-G2 nồng độ 100 μg/ml, mẫu 2,0M thể hoạt tính mạnh mẫu 1,5M Hoạt tính ức chế có khả tác động fucoidan tới trình apoptosis tế bào Bảng 4.14 Tác dụng chất thử tới kích thước trung bình mật độ quần thể tế bào Nồng độ Mẫu thử Kích thước quần thể tế bào Tỷ lệ giảm mật độ mẫu Đường kính Tỷ lệ giảm so với (g/ml) (µm) đối chứng (%) 41,35  1,85 0 Đối chứng (-) (% ) 1.5M 100 31,13  1,42 24,72 22,14  1,12 2.0M 100 27,28  0,95 34,03 41,11  0,88 Đối chứng (-) 1,5M (100 g/ml) 2,0M (100 g/ml) 21 Hình 4.28 Hình ảnh kính hiển vi ngược quần thể tế bào Hep-G2 nuôi cấy thạch mềm tác dụng cácchất thử 4.4.3.3 Hoạt tính chống đơng máu Hoạt tính chống đông máu tương tự heparin phân đoạn FSA xác định phương pháp APTT (activated partial thromboplastine time, phương pháp đo thời gian đông máu với thromboplastin khơng có yếu tố mơ có tác nhân kích hoạt) [122] Phép thử tiến hành máy Coatron®M2 (TECO, Đức) theo quy trình thiết lập công ty cung cấp máy Các mẫu fucoidan chứng dương Clexan, heparin khối lượng phân tử thấp, thử nghiệm nồng độ 1, 5, 10 µg/mL Kết trình bày Hình 4.29 cho thấy phân đoạn FSA-0,5M khơng có hoạt tính, hoạt tính chống đơng máu fucoidan lại tăng từ FSA-1,0M tới FSA-2,0M tỉ lệ thuận với mức độ sulfat hóa Giá trị 2APTT (được định nghĩa nồng độ chất thử cần thiết để kéo dài gấp đơi thời gian hình thành cục máu đơng) xác định cho mẫu FSA-2,0M 6.5 ± 0.4 µg/mL, cho chứng dương enoxaparin 3.9 ± 0.4 µg/mL Điều chứng tỏ, mẫu fucoidan có mức độ sulfat hóa cao FSA-2,0M Thời gian đơng tụ máu (s) có hoạt tính chống đơng máu nửa enoxaparin Nồng độ (µg/ml) Hình 4.29 Hoạt tính chống đông máu fucoidan từ S aliqualium đo phương pháp APTT Tóm tắt kết nghiên cứu nội dung nghiên cứu 4.4:  Từ rong nâu Sargassum aquifolium vùng biển Nha Trang chiết xuất fucoidan tổng số gọi tên FSA với hiệu suất 3.7% tính ngun liệu khơ  FSA có KLPT trung bình cao (110 kDa) có cấu tạo phức tạp với thành phần bao gồm LFucose, D-galactose, D-mannose, axit D-glucuronic, D-xylose sulfat Việc nghiên cứu cấu trúc FSA trực tiếp phương pháp phổ MS NMR thực  FSA tách thành 04 phân đoạn (ký hiệu FSA-0,5M, FSA-1,0M, FSA-1,5M, FSA2,0M) có hàm lượng sulfat tăng dần phương pháp sắc ký trao đổi anion  Các phân đoạn FSA-1,0M FSA-1,5M (21,0 9,8% từ FSA) phân tích phương pháp methyl hóa trước sau tách loại sulfat  Sản phẩm tách loại sulfat FSA-1,0M 1,0M-deS tách thành 06 phân đoạn (ký hiệu deS-1 tới deS-6) có hàm lượng axit uronic tăng dần phương pháp sắc ký trao đổi anion Các đặc điểm cấu trúc chúng xác định phép phân tích methyl hóa kiện NMR Kết nhận biết 03 polysaccharid có cấu trúc khác nhau: 22  Polysaccharid thứ có mạch gồm gốc 2)-α-D-Gal-(1 4)-β-D-GlucA-(1 liên kết luân phiên với Khoảng nửa gốc 2)-α-D-Gal-(1 có nhóm α-L-Fucp β-D-Xylp O-3  Polysaccharid thứ hai có mạch (13)-β-D-glucopyranuronan phần gốc β-D-Xylp α-L-Fucp O-4  Polysaccharid thứ ba có mạch xylo(fuco)galactan có mạch thẳng cấu tạo từ gốc 4)-α-D-Gal-(1 3)-α-D-Gal-(1 liên kết luân phiên với Gốc 3)-α-DGal-(1 mang nhóm gốc β-D-Xylp mạch ngắn gồm 4)-β-D-Xylp-(1, 6)-α-D-Gal-(1 α-L-Fuc có liên kết vị trí khác  Trong FSA polysaccharid mang nhóm sulfat vị trí khác nhau, khơng có qui luật xác định  Phân đoạn sắc ký FSA-1,5M có hàm lượng sulfat cao (31,5%), có thành phần đơn giản, cấu tạo chủ yếu từ α-L-fucose (19,2%) galatose (5,5%), có cấu trúc phức tạp, khơng trực tiếp nghiên cứu phổ MS NMR Nghiên cứu FSA-1,5M phương pháp phân tích methyl hóa kết hợp với phổ ESI-MS/MS sản phẩm thủy phân phần với TFA cho thấy:  Fucoidan FSA-1,5M cấu tạo chủ yếu từ α-L-fucose (19,2%) D-galatose (5,5%) Đường fucose tồn hai dạng vòng pyranose furanose Đường galactose có dạng pyranose  Fucoidan FSA-1,5M có cấu trúc phân nhánh cao Mạch cấu tạo chủ yếu gốc fucose liên kết luân phiên với vị trí O-3 O-4 Các gốc galactose nằm đầu không khử liên kết với O-3 fucose tạo thành mạch nhánh  Trong cấu trúc lõi, nhóm sulfat chủ yếu nằm vị trí O-2 gốc fucose galactose  Các phân đoạn fucoidan FSA có hoạt tính chống đông máu, gây độc tế bào chống khối u Các hoạt tính tăng theo hàm lượng fucose mức độ sulfat hóa 4.5 Nghiên cứu cấu trúc hoạt tính gây độc tế bào fucoidan phân lập từ rong nâu Turbinaria decurrens  Fucoidan tổng FTD phân lập từ với hiệu suất 2,19% FTD có KLPT trung bình 227 kDa, có hàm lượng sulfat 24,3% có thành phần đường đơn đơn giản gồm chủ yếu fucose galactose với tỉ lệ 1:0,5  Đã phân lập từ FTD 03 fucoidan FTD-0,5N, FTD-1,0N FTD-2,0N với hiệu suất tương ứng 20, 30, 46%  FTD-2,0N có KLPT trung bình 227 kDa, có hàm lượng sulfat 34,5% có thành phần đường đơn giản, gồm fucose galactose với tỉ lệ 1:0,65  Fucoidan FTD-2,0N có khả ức chế hình thành khối u tế bào ung thư dòng HepG2 nồng độ 100 μg/ml 23  Các kết nghiên cứu phổ IR, NMR (1D 2D) ESI-MS/MS cho thấy FTD-2,0N galactofucan tạo thành từ loại đường (1→3)-α-L-Fuc với nhóm sulfat vị trí C-2 -Dgalactose mang nhóm sulfat vị trí C-6 Galactose nối với fucose qua liên kết glucoside 1→4 Mảnh cấu trúc FTD-2,0N đề xuất sau: [→3-α-L-Fucp2(OSO3-)-(1→4)-β-D-Gal6(OSO3-)-1→]n 4.6 Nghiên cứu kích thước hình dáng fucoidan phân lập từ rong nâu Việt Nam, phân tích liên hệ chúng với hoạt tính gây độc tế bào  Đã chiết xuất, phân lập, xác định thành phần cấu tạo khối lượng phân tử trung bình fucoidan từ 06 loài rong nâu Nha Trang là: S polycystum (Fsp), S mcclurei (Fsm), S oligocystum (Fso), S denticarpum (Fsd), S swatzii (Fss), T ornata (Fto)  Hình dáng kích thước mẫu fucoidan nghiên cứu phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ Kết phân tích đồ thị Kratky tán xạ tia X góc nhỏ cho thấy mẫu fucoidan có hình dáng kiểu que (rod-like) với mạch nhánh cồng kềnh mức độ phân nhánh khác Kết tính tốn cho mơ hình lý thuyết cho thấy mạch nhánh có khả nằm kề có độ dài tới gốc đường  Kết phân tích đồ thị Guinier cho phép ước lượng bán kính hồi chuyển mặt cắt ngang phân tử cho mẫu fucoidan Rgc nằm khoảng 0,78 - 1,51 nm đại diện cho mức độ cồng kềnh mạch nhánh  Đã thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào mẫu fucoidan hai dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 ung thư mô liên kết RD Kết cho thấy mẫu thể hoạt tính Hai mẫu có hoạt tính cao Fto (IC50 Hep-G2 RD 3,1 1,6 µg/mL) Fsp (IC 50 Hep-G2 RD 5,5 5,7 µg/mL)  Khảo sát mối liên hệ hoạt tính gây độc tế bào với số đặc điểm cấu tạo cấu trúc mẫu fucoidan sơ cho thấy: a) khối lượng phân tử trung bình có tương quan rõ rệt với hoạt tính gây độc tế bào Các mẫu có khối lượng phân tử trung bình cao có hoạt tính cao Các mẫu có khối lượng phân tử trung bình thấp có hoạt tính thấp nhất; b) Mức độ sulfat hóa đường thể mức độ định tương quan với hoạt tính gây độc tế bào Tỉ lệ sulfat/đường cao gắn liền với hoạt tính cao ngược lại; c) Khơng thấy có biểu tương quan rõ rệt mức độ cồng kềnh (độ dài) mạch nhánh (thể qua bán kính hồi chuyển mặt cắt ngang Rgc) với hoạt tính gây độc tế bào Các kiện gợi ý khối lượng phân tử cao cấu trúc phân nhánh với tỉ lệ sulfat/đường cao yếu tố cần thiết cho hoạt tính gây độc tế bào mẫu fucoidan KẾT LUẬN Nghiên cứu cấu trúc hoạt tính sinh học fucoidan từ số loài rong nâu Việt Nam, thu kết sau: Đã khảo sát hàm lượng thành phần hóa học fucoidan từ 11 loài rong nâu thuộc hai chi Sargassum Turbinaria sinh trưởng vùng biển Nha Trang Kết cho thấy nhìn tổng thể thành phần hóa học đặc điểm cấu trúc fucoidan Dựa kết này, fucoidan phân 24 lập từ Sargassum aquifolium Turbinaria decurrens lựa chọn để nghiên cứu sâu cấu trúc hóa học hoạt tính sinh học Đã nghiên cứu đặc điểm cấu trúc fucoidan từ hai loài rong Sargassum duplicatum Sargassum binderi Kết cho thấy fucoidan từ hai loài rong galactofucan sulfate Kết lần góp phần khẳng định đại đa số fucoidan tách từ loài rong nâu sinh trưởng vùng nhiệt đới hay gặp dạng galactofucan sulfate Từ rong nâu Sargassum aquifolium phân lập, xác định cấu trúc hoạt tính sinh học fucoidan FSA-0.5M, FSA-1.0M, deS-1, deS-2, deS-3, deS-4, deS-5, deS-6, FSA-1.5M FSA-2.0M - Cấu trúc fucoidan lần giới Việt Nam nghiên cứu xylo(fuco)galactan (deS-2), fuco(xylo)glucuronomannan (deS-4) xylo(fuco)glucuronan (deS-6) Đặc biệt cấu trúc mạch phân đoạn fucoidan có manose (deS-4), uronic acid (de-S6) mạch nhánh có xylose (de-S2) Đây điểm cấu trúc fucoidan tách chiết từ loài rong nâu biển Nha Trang, nghiên cứu đối tượng rong khác cho thấy đa số fucoidan galactofucan - Kết hoạt tính sinh học: Các phân đoạn FSA-0.5M, FSA-1.0M, FSA-1.5M, FSA-2.0M chiếm hữu hoạt tính chống đơng tụ máu, gây độc tế bào ngăn ngừa phát triển khối u Đặc biệt hoạt tính chống đơng tụ máu, lần fucoidan tách chiết từ rong nâu Việt Nam khảo sát hoạt tính Fucoidan FTD2.0N phân lập từ rong nâu Turbinaria decurrens galactofucan sulfate tạo thành từ loại đường (1→3)-α-L-Fuc với nhóm sulfate vị trí C-2 α-D-galactose bị sulfate vị trí C-6 với tỷ lệ mol L-Fuc : D-Gal = 1: 0,65 Galactose nối với fucose qua liên kết glucoside 1→4 Fucoidan FTD2.0N từ rong nâu có khả ức chế hình thành khối u tế bào dòng HepG2 Galactofucan sulfate (FTD2.0N) fucoidan lần phân lập từ rong nâu Turbinaria decurrens Bằng phương pháp phổ SAXS xác định mối quan hệ giữ cấu trúc nhánh hoạt tính gây độc tế bào ung thư fucoidan phân lập từ loài rong nâu Việt Nam Kết cấu tạo nhánh fucoidan nhiều nhóm sulfate, cho thấy fucoidan có hoạt tính sinh học mạnh fucoidan khác Đã nghiên cứu ảnh hưởng thông số cấu trúc (hàm lượng sulfate, trọng lượng phân tử trung bình mạch nhánh) đến hoạt tính sinh học fucoidan Đây điểm so với nghiên cứu lĩnh vực nước Các kết nêu cho phép đưa nhận xét sau: Khác với fucoidan có xuất xứ biển ôn đới, phần lớn fucoidan phân lập từ rong nâu Việt Nam có cấu tạo cấu trúc phức tạp Tuy nhiên, kết hợp khéo léo phương pháp nghiên cứu kinh điển với phương pháp công cụ đại, đặc biệt phương pháp CHTHN hai chiều, phương pháp phổ khối lượng nhiều lần MS/MS phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ, khoa học cho phép ngày làm rõ yếu tố cấu trúc tinh vi chúng 25 Các kết nghiên cứu luận án nhiều cơng trình khoa học cơng bố gần Việt Nam cho thấy, loài rong nâu Việt Nam không là nguồn tài nguyên biển có giá trị sử dụng cao mà kho tàng hợp chất thiên nhiên có kiểu cấu trúc mới, phức tạp đa dạng, đáng để tiếp tục sâu nghiên cứu NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN: Lần thành phần fucoidan có lồi rong nâu Sargassum aquifolium Turbinaria decurrens Việt Nam chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc phương pháp đại hóa học carbohydrat Các phương pháp tách fucoidan thành phân đoạn cột trao đổi anion, phương pháp tách loại sulfat, phương pháp phân tích methyl hóa cho phép thu phân đoạn đồng hơn, đơn giản hơn, phù hợp với việc xác định cấu trúc tinh vi phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân phổ khối phân giải cao Từ tổng fucoidan FSA rong nâu S aquifolium phân lập xác định cấu trúc phân đoạn có dạng cấu trúc gồm xylo(fuco)galactan (deS-2), fuco(xylo)glucuronomannan (deS-4) xylo(fuco)glucuronan (deS-6) với cấu trúc mạch khác với cấu trúc galactofucan thường gặp loài rong nâu khác biển Nha Trang Từ tổng fucoidan FTD rong nâu T decurrens phân lập galactofucan sulfate FTD2.0N với cấu trúc sau: [→3-α-L-Fucp2(OSO3-)-(1→4)-β-D-Gal6(OSO3-)-1→]n Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ lần áp dụng để nghiên cứu cấu dạng fucoidan tách chiết từ loài rong nâu Việt Nam Kết phân tích đồ thị Guinier cho phép ước lượng bán kính hồi chuyển mặt cắt ngang phân tử Rgc nằm khoảng 0,78 - 1,51 nm Kết phân tích đồ thị Kratky cho thấy mẫu fucoidan có hình dáng kiểu que, mạch ngắn, phân nhánh Các kết thử nghiệm hoạt tính sinh học cho thấy phân đoạn fucoidan FSA-2,0M FTD2,0N có hàm lượng sulfat cao phân lập từ rong nâu S aquifolium T decurrens có hoạt tính gây độc tế bào hoạt tính ức chế khối u Phân đoạn FSA-2,0M có hoạt tính chống đơng máu cao so sánh với chất chuẩn heparin Kết khảo sát sơ mối liên hệ hoạt tính gây độc tế bào với số đặc điểm cấu tạo cấu trúc mẫu fucoidan gợi ý khối lượng phân tử cao, cấu trúc phân nhánh tỉ lệ sulfat / đường cao yếu tố cần thiết cho hoạt tính gây độc tế bào mẫu fucoidan KIẾN NGHỊ Trên sở kết thu từ luận án, chúng tơi có số kiến nghị sau: Tiếp tục nghiên cứu cấu trúc hóa học hoạt tính sinh học sulfated polysaccharide (fucoidan) từ loài rong nâu khác Việt Nam nhằm tìm kiếm hợp chất có hoạt tính sinh học cao từ làm sở cho việc khai thác sử dụng hiệu nguồn tài nguyên biển Việt Nam 26 Tiếp tục nghiên cứu mối quan hệ cấu trúc - hoạt tính để làm rõ ảnh hưởng cấu trúc polysaccharide dẫn xuất đến hoạt tính sinh học, làm sở để tạo dẫn xuất có hoạt tính cao mẫu tự nhiên CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Maria I Bilan, Nadezhda E Ustyuzhanina, Alexander S Shashkov, Thanh Thi Thu Thuy, Bui Minh Ly, Tran Thi Thanh Van, Bui Van Nguyen, Anatolii I Usov , Sulfated polysaccharides of the Vietnamese brown alga Sargassum aquifolium (Fucales, Sargassaceae), Carbohydrate Research, Volume 449 (2017) PP 23-31, https://doi.org/10.1016/j.carres.2017.06.016 (SCI) Yoshiaki Yuguchi, Bui Minh Ly, Bui Van Nguyen, Tran Thi Thanh Van and Thanh Thi Thu Thuy, Study on branched structure-physiological activity relationship of fucoidan, Chemistry letter, Vol.45 No.7 2016 p.840-842 doi:10.1246/cl.160189 (SCI) Bui Van Nguyen, Tran Thi Thanh Van, Bui Minh Ly, Nguyen Quyet Chien, Thanh Thi Thu Thuy, Maria I Milan, Anatolii I Usov, Structural characteristics and anticoagulant activity of sulfate polysaccharide from the brown alga sargassum aquifolium , Journal of Science and Technology 54 ( 2C) (2016) 360-365 Bùi Văn Nguyên, Trần Thị Thanh Vân, Bùi Minh Lý, Nguyễn Quyết Chiến, Thành Thị Thu Thủy, Study on structure and cytotoxic activity of fucoidan extracted from brown seaweed Sargassum aquifolium, Vietnam journal of chemistry 54(6e2)(2016)215-218 Bùi Văn Nguyên, Bùi Minh Lý, Võ Mai Như Hiếu, Đặng Vũ Lương, Trần Thị Thanh Vân Thành Thị Thu Thủy, Xác định cấu trúc fucoidan tách chiết từ rong nâu Turbinaria decurents phương pháp phổ IR, NMR ESIMS, Tạp chí Khoa học cơng nghệ T.52 (5B), 2014 (637-642) Bui Van Nguyen, Cao Thi Thuy Hang, Tran Thi Thanh Van, Nguyen Thi Hai Au, Dang Xuan Cuong, Natalia M Shevchenko, Svetlana P Ermakova, T.N Zvyagintseva and Pham Duc Thinh, The content and chemical composition of water-soluble polysaccharides isolated from some sargassum seaweed species in viet nam, Journal of Science and Technology 54 (2B ) (2016), pp 84-90 TÀI LIỆU THAM KHẢO Luận án nghiên cứu 122 tài liệu tham khảo tác giả nước dạng báo khoa học, sách tham khảo, luận án ... trúc hoạt tính sinh học fucoidan từ số loài rong nâu Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu luận án là: Nghiên cứu phân lập, xác định đặc điểm cấu trúc thử nghiệm hoạt tính sinh học fucoidan từ số loài rong. .. luận án bao gồm: Nghiên cứu sàng lọc số loài rong nâu để chọn đối tượng nghiên cứu sâu cấu trúc hoạt tính sinh học fucoidan Nghiên cứu sâu cấu trúc hoạt tính sinh học fucoidan chiết xuất từ số. .. cao cấu trúc phân nhánh với tỉ lệ sulfat/đường cao yếu tố cần thiết cho hoạt tính gây độc tế bào mẫu fucoidan KẾT LUẬN Nghiên cứu cấu trúc hoạt tính sinh học fucoidan từ số loài rong nâu Việt Nam,

Ngày đăng: 09/01/2020, 15:49

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan