A _ Bỏ YTẼ VA MỌT SO KY THUẠT Y SINH HỌC PHÂN TỬ ■ (Sách đào tạo sau đại học y dược) Chủ bỉên: PGS.TS TẠ THÀNH VÀN HQGHN 72 R )0489 Ỹ NHÀ XUẤT BẢN Y HỌC * a ' BỘ Y TÊ PCR VÀ MỘT ■ SỐ KỸ THUẬT ■ Y SINH HỌC PHÂN TỬ ■ Sách đào tạo sau đại học y dược Mã số: Đ.01.Y.06VV Chủ biên: PGS TS TA THÀN H VĂN NHÀ XUẤT BẢN Y HỌC ■ HÀ N Ộ I- ■ CHÍ ĐẠO BIẼN SOẠN: Vụ Khoa học Đào tạo, Bộ Y tê CHỦ BIÊN: PGS TS Tạ Thành Văn NHỮNG NGƯỜI BIÊN SOẠN: PGS TS Tạ Thành Văn THAM GIA TỔ CHỨC BẢN THẢO: ThS Phí Văn Thâm TS N gu yển Mạnh Pha © Bản quyền thuộc Bộ Y tê (Vụ Khoa học Đào tạo) LỜI GIỚI THIỆU ■ Đào tạo nguồn nhân lực cán chất lượng cao môi quan tâm hàng đầu ngành Y tế Song song vỏi việc đầu tư sơ vật chất cho sơ đào tạo, Bộ Y tế đặc biệt trọng tăng cương phương tiện dạy vè học, việc biên soạn giáo trình, tài liệu giảng dạy đặc biệt ưu tiên Sách “PCR sô kỹ th u ật y sinh học phân tử” biên soạn nhằm phục vụ chủ yếu cho việc đào tạo sau đại học Trường đại học Y, Dược dựa chương trình khung Trường Đại học Y Hà Nội tài liệu đề đào tạo đại học tham khảo, tự học cho nghiên cứu viên làm việc lĩnh vực y sinh Bên cạnh kiến thức lý thuyết nguyên lý kỹ th u ậ t y sinh học phân tử, sách cung cấp quy trình kỹ th u ậ t cụ thể hướng dẫn cho người bắt đầu triến khai kỹ th u ậ t chuyên sâu Cuốn sách biên soạn PGS TS Tạ Thành Văn, nhà khoa học giàu kinh nghiệm lĩnh vực Hóa sinh học phân tử tế bào Sách Hội đồng chuyên môn Bộ Y tê thẩm định theo Quyêt định sô 928/QĐ BYT ngày 22 tháng năm 2010 gồm chuyên gia thuộc chuyên ngành Hóa sinh, Miễn dịch, Sinh lý bệnh, Vi sinh Sinh học Cuốn sách ban hành làm tài liệu sử dụng thức phục vụ đào tạo đại học sau đại học ngành Y tế Đồng thòi sách tài liệu tham khảo hữu ích cho cán làm việc phòng thí nghiệm, phòng xét nghiệm y sinh Bộ Y tế xin chân thành cảm ơn GS TSKH Phan Thị Phi Phi, Chủ tịch Hội đồng thẩm định, GS TS Phùng Đắc Cam PGS TS Nguyễn Thị Hà, ủy viên phản biện ủy viên Hội đồng đọc, đóng góp nhiều ý kiến q báu đê cn sách hồn thiện Đây lần xuất đầu tiên, sách chắn chỉnh lý, bổ sung cập n h ật lần xuất tiếp sau Chúng mong nhận ý kiến đóng góp đồng nghiệp độc giả để sách hoàn chỉnh cho lần xuất sau VỤ KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y T Ế LỜI MỞ ĐẦU Các kỹ th u ậ t sinh học phân khoa học làm việc lĩnh vực gen người hoàn tất, kỹ y học phát huy hiệu trị phòng bệnh tử cơng cụ đặc biệt hữu ích cho nhà cơng nghệ sinh học Kê từ việc giải mã thuật ngày ứng dụng rộng rãi to lốn chẩn đốn, theo dõi hiệu điều Cn sách “PCR sô kỹ thuật y sinh học phân tử ' biên soạn dành cho nghiên cứu viên, sinh viên bậc đại học sau đại học thuộc chuyên ngành khác lĩnh vực y sinh Cuốn sách cung cấp cho dộc giả kiến thức lý thuyết bản, nguyên lý, triển vọng ứng dụng PCR kỹ th u ật y sinh học phân tử khác, mà cung cấp quy trình kỹ th u ật cụ thê hướng dẫn cho người bắt đầu triển khai kỹ th u ậ t chuyên sâu Nội dung sách để cập đến lĩnh vực mà kỹ th u ật sinh học phân tử chuyên biệt áp dụng Các độc giả tìm thấy sách kiến thức khoa học chuyên sâu, sỏ lý luận khoa học việc thiết lập quy trình kỹ thuật, từ cán khoa học có thê tự điểu chỉnh, thay đổi, cải tiến quy trình cho phù hợp vối mục đích điều kiện phòng thí nghiệm để phát huy tối đa hiệu nghiên cứu khoa học hoạt động chun mơn thường quy Vối tất nội dung trình bày, sách tài liệu học tập, tham khảo cho cán khoa học thuộc chuyên ngành Kỹ th u ật Y học, Hóa sinh, Sinh học, Miễn dịch học, Vi sinh Trường đại học Y Dược, Trường đại học Tổng hợp Viện nghiên cứu Với tốc độ phát triển nhanh công nghệ sinh học năm gần đây, đặc biệt kỹ th u ật sinh học phân tử ứng dụng y học, khuôn khô sách này, tác giả không hướng tối mục đích mơ tả chi tiêt tất quy trình kỹ th u ậ t ứng dụng khác PCR nói riêng kỹ th u ậ t sinh học phân tử nói chung Tuy nhiên, có thê nói kiến thức trình bày kiến thức nhất, mà thường kỹ th u ậ t dù th ế đểu dựa nguyên tắc khoa học Tác giả xin bày tỏ biết ơn tói đồng nghiệp dành thời gian đọc thảo góp ý chi tiết nội dung, cách trình bày, cán Vụ Khoa học Đào tạo, Bộ Y tế, Nhà xuất Y học giúp đỡ tác giả q trình hồn thiện sách Hà Nội, ngày 01 tháng năm 2010 PGS TS TẠ THẢNH VĂN MỤC LỤC ■ ■ Lời giới thiệu Lời mở đầu Chương I N hững kiến thức chu ng A Thành phần hóa học cấu trúc acid nu cleic 11 11 Thành phần hóa học acid nucleic 11 Cấu trúc hóa học acid nucleic 13 2.1 Cấu trúc acid deoxyribonucleotid (DNA) 13 2.1.1 Cấu trúc xoắn kép 13 2.1.2 Cấu trúc Watson-Crick (B-DNA) 13 2.1.3 Các dạng cấu trúc xoắn khác acid nucleic 14 2.1.4 Các lực hóa học cấu trúc làm bền vững cấu trúc acid nucleic 2.1.5 Sự biến tính th u ận nghịch 1.2 Cấu trúc acid ribonucleic (RNA) 15 16 17 1.2.1 Cấu trúc RNA 17 1.2.2 Các loại RNA 17 B Câu trúc gen yếu tơ điểu hòa hoạt động gen tê bào có nhân 18 Gen điều khiển gen tăng cường 19 1.1 Một số phức hợp gen tăng cường 20 1.1.1 Phức hợp gen tăng cường có nguồn gốc virus 20 1.1.2 Phức hợp gen tăng cường có nguồn gốc tế bào 22 1.2 Gen điều khiển gen tăng cường cảm ứng 22 1.3 Cơ chế hoạt động gen tăng cường 22 Môi tương tác gen điều khiển intron 23 Các tín hiệu thối hóa mRNA q trình polyadenin hóa 24 Kiểm sốt q trình chép 25 Các tượng liên quan 26 Chương II Giới th iệu c h u n g kỷ th u ậ t PCR 28 Giối thiệu chung: PCR, máy photocopy 28 Lịch sử kỹ th u ật PCR 28 Kỹ thuật PCR liên quan đến trình chép DNA 29 PCR điều khiển nhiệt độ 30 Liệu kỹ th uật PCR có thê thay thê kỹ thuật tạo dòng gen? 31 ứ n g dụng kỹ th u ậ t PCR 32 Chương III N guyên tắc kỹ thuật PCR 33 Kỹ thuật PCR tiến hành th ế nào? 33 Triển vọng ứng dụng PCR 35 DNA khuôn gen phần gen tê bào 36 Động học phản ứng PCR 37 4.1 Những chu kỳ đầu (E) 38 4.2 Những chu kỳ (M) 38 4.3 Những chu kỳ cuối độ bão hòa (L) 39 Phân tích sản phẩm PCR 39 Chương IV Hóa chất th iết bị 40 Những ưu điểm kỹ thuật PCR 40 Các dung dịch phản ứng 40 Dung dịch đệm PCR 40 3.1 Tris-HCl 3.2 KC1 41 41 3.3 MgCl2 41 Nucleotid 42 Hỗn hợp dung dịch PCR trộn trước (PCR premix) Đoạn oligonucleotid mồi 43 43 6.1 Nhiệt độ nóng chảy (Tm) 45 6.2 Mồi đánh dấu ỏ đầu 5’ 46 6.3 Khuếch đại gen đích nhò hỗn hợp mồi 47 6.4 Nồng độ mồi 47 DNA polymerase 7.1 DNA polvmerase với nhiệt 7.2 Đặc tính Taq DNA polymerase 48 7.3 Một số loại Taq DNA polymerase thương mại 49 7.4 Một sơ loại DNA polymerase bền vối nhiệt có hoạt tính sửa chữa 50 Acid nucleic khuôn 48 48 50 Vật tư tiêu hao 51 10 Máy tạo chu kỳ nhiệt cho PCR 51 11 Xây dựng hệ thống phòng xét nghiệm sinh học phân tử 51 11.1 Phòng tách chiết DNA/RNA 51 11.2 Phòng chuẩn bị Mastermix 52 11.3 Phòng bố sung khn 52 11.4 Phòng đặt máy RCR/Realtime PCR 52 11.5 Phòng điện di 52 Chương V Phân tích sản phẩm PCR 54 Điện di (Electrophoresis) 54 Southern dot blot 56 PCR lồng 57 Sử dụng enzym cắt giới hạn 59 Giải trình tự gen trực tiếp 60 Đánh dấu trực tiếp sản phẩm PCR 61 Kỹ thuật miễn dịch 62 Kỹ thuật điện hóa phát quang 62 Realtime PCR PCR định lượng 63 10 Phương pháp MLPA (multiplex ligation-dependent probe ampliíication) 66 11 Biểu sản phẩm PCR in vitro 68 12 Một sô vấn đề kỹ th u ật cần lưu ý đọc phân tích kết PCR 69 Chương VI Tinh tách dòng sản phẩm PCR 73 Tinh sản phẩm PCR 73 1.1 Tủa ethanol 73 1.2 Gắn vào gel (In-gel ligation) 74 1.3 Tinh chê cột ly tâm (Spin columns) 74 1.4 Điện di đẩy (Electroelution) 74 1.5 Tinh chê hỗn hợp silica glassmilk 75 1.6 Sử dụng kit thương mại 75 Tách dòng sản phẩm PCR 75 2.1 Các vector tách dòng 76 2.2 Phân tích clon mang DNA đích 79 Chương VII Các phương pháp phân tích gen 80 Phân tích cấu trúc đa hình thái chuỗi đơn 81 1.1 Nguyên tắc 81 1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến di chuyến sợi đơn DNA 83 Phản ứng nối chuỗi 84 2.1 Nguyên tắc 84 2.2 Một sô đặc điểm kỹ th u ật LCR 85 Hệ thống khuếch đại đột biến bên với nhiệt 86 Khuếch đại phân đoạn cấu trúc đa hình thái 87 P hân tích kiểu gen “một ơng nghiệm Tm" 88 Phương pháp sử dụng enzym giới hạn phân tích chuỗi gen đa hình thái 90 Khuếch đại ngẫu nhiên DNA đa hình thái 91 Phân tích thê đa hình thái A lu PCR đa mồi 92 Phân tích lặp lại minisatelite 93 10 Microsatelite 95 Chương VIII Các quy trình kỹ th uật sinh học phân tử 97 Quy trình 2.1 Quy trình PCR 97 Quy trình 3.1 Phosphoryl hóa đầu chuỗi oligonucleotid 99 Quy trình 3.2 Tách chiết genomic DNA từ mô thực vật 100 Quy trình 3.3 Chuẩn bị DNA khn 101 Quy trình 3.4 Tách chiết DNA sử dụng proteinase K 103 Quy trình 4.1 Southern blotting Quy trình 4.2 Giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR 105 107 Quy trình 4.3 Giải trình tự gen 108 Quy trình 5.1 Tạo phân đoạn PCR đầu tù 110 Quy trình 5.2 Tủa sản phẩm DNA ethanol 111 Quy trinh 5.3 Biến nạp DNA vào hệ vi khuẩn 112 Quy trình 6.1 Quy trình chép ngược 114 Quy trình 6.2 Thu hồi DNA từ gel khơ 115 Quy trình 6.3 Khuếch đại nhanh cDNA từ đầu tận (5’-RACE) 116 Quy trình 6.4 Cơ định lát cắt mơ vào phiến kính 118 Tài liệu tham khảo 120 10 Chương I NHỮNG KIẾN THỨC c BẢN CHUNG A THÀNH PHẨN HÓA HỌC VÀ CẤU TRÚC ACID NUCLEIC ■ Nucleotid hợp chất sinh học tham gia vào nhiều trình chun hóa tế bào Chúng phương tiện dự trữ vận chuyển lượng, đáp ứng hóa học tê bào hormon chất kích thích khoảng gian bào, th àn h phần cấu trúc coenzym hay chất chuyển hoá trung gian Song điều quan trọng phải nucleotid th àn h phần cấu tạo nên acid nucleic: acid deoxyribonucleic (DNA) acid ribonucleic (RNA), sỏ vật chất thơng tin di truyền THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA ACID NƯCLEIC Cấu trúc hóa học acid nucleic Phoebus Levine Alexander Todd đưa năm đầu năm 50 th ế kỷ trước Acid nucleic chuỗi polymer thang (phổ biến) nucleotid nôi vối cầu nôi phosphat vị trí 3’ 5’ hai phân tử đường liên tiếp I iiì; — — " adenine 5' end ũ — p — — CH ' — p — — (etc) nucleic aciđ Q 3' end H ình 1.1 Thành phần mơ hình cấu trúc dinucleotid (adenyl-3’ , 5’-cytidyl-3’, '-phosphat (ACp)) 11 như: gắn vái enzym cho phản ứng phát khơng sử dụng phóng xạ gắn với chất giá sử dụng cho mục đích tinh chế Ngồi có phương pháp đánh dấu khác như: đánh dấu digoxingenin, chất phát màu huỳnh quang (íluorescent dye) hay dẫn xuất phosphoramidit 6.3 K huếch đại gen đích nhờ hỗn hợp mồi Mồi sử dụng cho PCR thường thiết kê sở trinh tự chuỗi DNA biết trước Tuy nhiên, số trường hợp, khơng biết xác trình tự DNA khn mà biết trình tự acid amin chuỗi protein mà DNA khuôn mã hóa Trong trường hợp có lựa chọn: i) có nhiều gen gen sinh vật giải trình tự, lập bảng đế xác định xem ba mã hóa mà sinh vật hay dùng cho acid amin; điều cho phép đưa lựa chọn tối ưu cho trình tự nucleotid giả định cho chuỗi acid amin đó; ii) sử dụng hỗn hợp chuỗi nucleotid khác tấ t ba mã hóa giả định acid amin có mặt Chúng ta biết acid amin khơng phải mã hóa nucleotid Do vậy, chuỗi acid amin mã hóa vài chuỗi DNA Trong trường hợp này, người ta sử dụng hỗn hợp mồi mang ba mã hóa giả định đế khuếch đại đoạn gen đích (chưa biết rõ trình tự nucleotid) mã hóa chuỗi protein (đã biết trưốc trình tự acid amin) 6.4 N ồng độ mồi Nồng độ mồi sử dụng cho PCR phụ thuộc vào thí nghiệm tỷ lệ mồi/khn đóng vai trò quan trọng Nói chung, hai mồi phải có nồng độ tương đương dao động khoảng 0,1-1 M-M tương ứng với 5-50 pmol mồi tổng thể tích phản ứng 50 |il Thực nghiệm cho thấy, vói phản ứng, mồi nồng độ thấp 0,1 fiM (đối với genomic DNA) lượng mồi vượt q DNA khn vào khoảng 107 suốt chu trình phản ứng, lẽ khoảng 95% mồi chưa sử dụng sau 30 chu kỳ phản ứng Điều gợi ý sử dụng mồi với nồng độ cao dẫn đến việc hình th àn h sản phẩm phụ không mong muôn mồi kép (primer dimer) q trình bắt cặp nhầm Để tính tốn nồng độ mồi, sử dụng cơng thức: A260 = Ecl hay c = A260/e1; A260: độ hấp thụ mật độ quang bước sóng 260 nm dung dịch mồi Cần phải pha loãng dung dịch đế đảm bảo trị số A260 khoảng 0,1-0,8 47 - e: hệ sô" mol (M cm'1) tính tốn cách xác cách nhân tổng số loại nucleotid với hệ số £ chúng (A: 15200; T: 8400; G: 12010; C: 7050) - c: nồng độ mồi cần biết - 1: chiều dài cuvette (thường cm) DNA POLYMERASE Trong trình tổng hợp DNA, DNA polymerase lựa chọn nucleotid phù hợp để kéo dài mồi theo nguyên tắc bổ sung với sợi khn Có nhóm DNA polymerase thường sử dụng: - DNA polymerase phụ thuộc DNA - DNA polymerase phụ thuộc RNA DNA polymerase luôn xúc tác phản ứng tổng hợp chuỗi DNA theo chiều 5’—►3’ Tuy nhiên sơ DNA polymerase có hoạt tính enzym exonuclease xúc tác theo chiều 3’—►5’ gọi hoạt tính enzym sửa chữa (proreading activity), (hình 4.3) Enzym có khả kiểm tra lại độ xác tất nucleotid gắn vào q trình kéo dài đoạn DNA mồi Nếu có nucleotid gắn không theo nguyên tắc bổ sung với sợi DNA khuôn, enzym xúc tác cắt bỏ nucleotid sai sót thay thê vào nucleotid khác theo nguyên tắc đối mã Khi cân nhắc lựa chọn DNA polymerase cho PCR, người ta thường cân nhắc tối yếu tố: xác hiệu suất phản ứng Một sơ" enzym có khả gắn 5-10 nucleotid 1/10 giây số khác gắn tới 100 nucleotid 1/10 giây 7.1 DNA polym erase với n h iệt Taq DNA polymerase từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus lần mô tả Brock Freeze (1969) DNA polymerase bền với nhiệt độ cao nên cho phép việc lặp lại nhiều lần chu kỳ PCR mà cần bô sung lần n hất enzym vào thời điểm bắt đầu phản ứng Nhiệt độ tối ưu cho enzym khoảng 72-75°C 7.2 Đặc tính Taq DNA polym erase Taq DNA polymerase protein 94 kDa có trung tâm hoạt động: - 5’—►3’ DNA polymerase có khả kéo dài với tốc độ 50-60 nucleotid 1/10 giây tương ứng vối kb 1/10 giây - 5’—►3’ exonuclease 48 Enzym có thời gian bán hủy khoảng 40 phút 95°c, tương ứng với 50 chu kỳ phản ứng PCR điều kiện chuẩn Enzym hoạt tính 3’—►õ’ exonuclease (hoạt tính sửa chữa) sai sót q trình kéo dài không khắc phục DNA khuôn Trung tâm hoạt động polymerase ■DNA khuôn Trung tâm hoạt động exonuclease Tổng hợp chuỗi Sửa chữa sai sót H in h 4.3 c ấ u trúc phàn tử DNA polym erase có hoạt tỉnh sửa chữa Trung tâm hoạt động polymerase có hoạt tính kéo dài chuỗi trung tâm exonuclease có hoạt tính enzym sửa chữa 7.3 Một sơ' loại Taq DNA polym erase thương mại - A m p liT a q K: sản phẩm PE Biosystem dạng enzym tái tổ hợp Taq DNA polymerase sản xuất E coli Chính vậy, có khả dung dịch enzym nhiễm DNA E coli trình tinh enzym, điều gây nên nhiễm cho phản ứng, đặc biệt sử dụng DNA vi khuẩn DNA khn A m p liT Gold,®: dạng A m pliTaq * cung cấp dạng bất hoạt Do enzym cần 9-12 phút tiền PCR (pre-PCR) nhiệt độ 94°c 95nC đế hoạt hóa hoạt tính polymerase Enzym có tác dụng hạn chê sai sót q trình kéo dài tăng hiệu suất sản phẩm đặc hiệu - - Taq2000™ DNA polymerase (Stratene): enzym tinh chê mức độ tinh khiết từ Thermus aquaticus tổng hợp dạng tái tơ hợp - Stoffel fragment\ có trọng lượng phân tử 61 kDa, khơng có 289 acid am in ỏ đầu iV-tận phân tử AmpliTaq® sản xuất ỏ dạng tái tơ’ hợp Enzym khơng có hoạt tính 5’—►3’ exonuclease AmpliTaq* Enzym có khả bền với nhiệt cao AmpliTaq" lần cho phép phản PCR-4 49 ứng xảy nhiệt độ cao trình gắn mồi đặc hiệu Chính vậy, enzym thường dùng cho PCR mà mồi có tỷ lệ G+C cao Tốc độ xúc tác vào khoảng kb 1/10 phút 70°c hiệu đôi với phản ứng mà sản phẩm nhỏ 500 đơi base • - Advan Taq™\ dạng Taq polymerase bị cắt đoạn acid amin đầu iV-tận sản xuất Clontech Enzym có độ nhậy cao Taq polymerase nên có khả xúc tác trường hợp phản ứng có nồng độ DNA khuôn thấp - AGSGold DNA polymerase (Hybaid): dạng biến đổi Taq polymerase, có hiệu suất cao Taq polymerase lần bền vối có mặt hóa chất bổ sung vào phản ứng DMSO, formamid Enzym hoạt động ỏ dải nhiệt độ rấ t rộng sản phẩm tạo tối 15 kb, song khơng có hoạt tính enzym sửa chữa - Tfl polymerase (Promega): từ Thermus flavus, có hoạt tính giơng Taq DNA polymerase 7.4 Một số loại DNA polym erase bền với n h iệt có hoạt tính sửa chữa Trên thị trường có nhiều DNA polymerase bền với nhiệt lại có hoạt tính enzym sửa chữa Ưu điểm enzym cho phép phản ứng có độ xác cao sản phẩm phản ứng sai sót so với polymerase khơng có hoạt tính enzym sửa chữa Thêm vào đó, enzym có khả bền vững nhiệt độ cao có khoảng dao động pH tối ưu lớn Nhiều sản phẩm có mặt ỏ thị trường kể đến như: Vent®, Deepvent R® (New England Biolabs); Tli DNA polymerase (Promega); GB-D, Plu (Promega); ULTma™ (PE Biosystem); Pwo (Boehringer) ACID NUCLEIC KHUÔN Khn PCR rấ t đa dạng, DNA RNA, gồm gen tê bào (genomic DNA) mRNA, cDNA, thư viện DNA (library DNA) RNA, plasmid, phage, cosmid, chủng BAC YAC Bên cạnh khuôn bạn tạo ra, sản phẩm thương mại làm khn cho phản ứng như: genomic DNA, thư viện DNA RNA, poly(Ạ)+RNA Các chế phẩm nàv có nguồn gốc từ động vật, lồi thực vật dòng tế bào Lượng khn cần thiết cho phản ứng cần phải thăm dò trước tùy thuộc vào nguồn gốc khn Nó có thê dao động từ nanogram khn vector tạo dòng tối microgram đối vối toàn gen tê bào (genomic DNA) Thưòng phản ứng cần 3xl05 phân tử khn tùy vào nguồn gốc khuôn mà ước định sau: - fig genomic DNA - 10 ng genomic DNA nấm - ng genomic DNA E coli 50 - 1-2 pg plasmid M13DNA - 20 pg bacteriophage X DNA Trong số trường hợp đặc biệt, tăng số lượng khn để có thề giảm số lượng chu kỳ quy trình PCR, ví dụ tạo đột biến nhân tạo hay tái tổ hợp gen VẬT TƯ TIÊU HAO Có nhiều cơng ty cung cấp vật tư tiêu hao cho PCR Các vật tư ống polypropylen tích 0,2 0,5 ml; đĩa nhựa 96 giếng; phiến kính, ống mao quản đầu pipet tự động Các vật tư tiêu hao phải đạt chuẩn, đảm bảo không bị nhiễm 10 MÁY TẠO CHU KỲ NHIỆT CHO PCR Thê hệ máy PCR đơn giản cánh tay robot để chuyến giá để ống nghiệm từ bể nước sang bể nước khác có nhiệt độ khác nhau, v ề sau, thiết bị thay thê thiết bị đốt nóng làm lạnh chỗ, gọi thiết bị tạo chu trình nhiệt Có nhiều chế đốt nóng làm lạnh khác nhau, điện, dung dịch hay vật liệu bán dẫn Máy PCR hãng khác thường khác vê cơng nghệ đốt nóng làm lạnh Sự cải thiện tốc độ thay đổi nhiệt độ thiết bị làm cho thòi gian cho phản ứng ngày giảm cách đáng kể Vối máy PCR thông thường, thời gian cho phản ứng h, vối máy đại, thời gian giảm xuống 30-45 phút chí ngắn Một sơ ví dụ máy PCR hãng khác như: GeneAmp® PCR (PE Biosystems) th ế hệ 480, 2400, 9600, 9700; PCR Express (Hybaid); Eppendorí G radient Mastercycler; RoboCycler®; ABI PRISMđ 7700; LightCycler 11 XY DNG H THNG PHềNG XẫT NGHIỆM SINH HỌC PHÂN TỬ • • • Một hệ thống phòng xét nghiệm sinh học phân tử dùng chẩn đốn bệnh gồm nhiều phòng phòng có chức riêng biệt Đế đảm bảo vơ trùng, tấ t phòng hoạt động nguyên tắc theo chiều có phương tiện để khử khuẩn 11,1 P hòng tá ch ch iế t DNA/RNA - Do m ẫu dùng để tách chiết DNA/RNA là: virus, vi khuẩn, nấm men mô bệnh phẩm nên để bảo vệ cho làm việc, cần có tủ an toàn sinh học cấp Toàn trình tách chiết diễn tủ - Trong tủ an tồn cần phải có trang thiết bị sau: máy Vortex, micropipet, giá đõ cho ống l,5/2,0ml, ống PCR dành riêng cho tách chiết 51 - Trong phòng cần phải có máy ly tâm thường, máy ly tâm lạnh, tủ lạnh âm sâu -30 -80 đế bảo quản mẫu - Trước sau mồi lần làm việc với DNA/RNA, tủ an toàn sinh học cần phải khử trù n g cồn 70 độ sau đèn cực tím 11.2 P h ò n g c h u ẩ n bị M asterm ix - Phòng chuẩn bị MasterMix phòng hồn tồn khơng có khn (DNA/RNA) sản pham PCR - Bất kỳ thiết bị dụng cụ từ phòng tách chiết điện di khơng phép mang vào phòng - Chính đê phục vụ cho cơng việc chuẩn bị MasterMix, phòng cần có tủ thao tác PCR với micropipet, máy MiniSpin máy Vortex loại giá đỡ cho ông 1,5/2,0 ml ống realtime PCR riêng - Đặc biệt xây dựng phòng này, thường thiết kê áp lực khơng khí phòng dương so với bên ngồi nhằm mục đích ngăn khơng cho khơng khí bên ngồi trà n vào phòng mở cửa 11.3 P h ò n g bố su n g k h u n - Cần có tủ thao tác PCR với micropipet, máy MiniSpin máy Vortex loại giá đỡ cho ống 1,5/2,0 ml ống realtime PCR riêng - Trước sau lần làm việc vối DNA/RNA tủ thao tác PCR cần phải khử trù n g cồn 70 độ sau đèn cực tím 11.4 P h ò n g đ ặt m áy RCR/Realtim e PCR - Phòng cần tran g bị máy RCR/Realtime PCR với số lượng tùy theo nhu cầu sử dụng - Trong phòng nên có lưu điện đế đảm bảo máy chạy ổn định, không bị m ất điện chừng máy chạy - Không nên đặt máy PCR sát liền đế trán h quạt làm lạnh máy thối vào máy k ế cận 11.5 P h ò n g đ iệ n di Đây phòng làm nhiệm vụ tạo gel điện di, điện di kết PCR đọc kết sau điện di - Đế phục vụ cho điện di cần có tủ thao tác, tủ có trang bị đèn chiếu sáng đèn cực tím Trong buồng thao tác cần phải trang bị dụng cụ thiết bị sau: điện di agarose, micropipet riêng (thê tích khoảng từ 20 |il) để tra mẫu, không dùng micropipet cho mục đích khác 52 - Trong phòng cần phải trang bị hệ thơng chụp ảnh gel, lò vi sóng, dụng cụ đố gel cân điện tử để cân agarose - Phòng điện di thường thiết kê với áp lực âm so với bên ngoài, mục đích để ngăn khơng khí phòng điện di khơng ngoài, hạn chê tối đa lây nhiễm chéo khơng khí làm việc hệ thơng phòng xét nghiệm chung Chú ý: - Nên có hai hệ thống phòng (với thiết bị, dụng cụ, đồ tiêu hao hóa chất) riêng cho DNA RNA - Nếu khơng có điều kiện: phải sử dụng hai tủ an toàn sinh học khác (kèm theo micropipet, máy MiniSpin máy Vortex loại giá đỡ cho ống 1,5/2,0 ml) riêng cho tách DNA RNA 53 Chương V Phân tích sản phẩm PCR việc quan trọng giúp cho việc tơi ưu hóa điều kiện phản ứng nhằm thu kết tin cậy xác Thêm vào đó, số trường hợp việc phân tích lý giải kết PCR giúp ích cho chẩn đốn Chương giới thiệu đến độc giả phương pháp phân tích sản phẩm PCR thích hợp tùy thuộc vào mục đích loại thí nghiệm kê tiếp sau Điều quan trọng phải tối ưu điều kiện phản ứng đế đảm bảo độ lặp lại kết PCR Việc lựa chọn phương pháp phân tích sản phẩm PCR phụ thuộc vào thông tin mà cần: - Có hay khơng có sản phẩm gen cần khuếch đại - Chiều dài sản phẩm - Tỷ lệ sản phẩm thu so với lượng khuôn ban đầu - Phân tích trình tự lai hóa sử dụng đầu dò giải trình tự trực tiếp sản phẩm ĐIỆN DI (E lectrophoresis) mm Các giếng Lớn Hướng DNA 'ỉ' nhỏ Hinh 5.1 Kết điện di D N A 54 Kỹ th u ật phân tích sản phẩm PCR phố biến thông dụng điện di gel agarose (hình 5.1) Tùy theo chiều dài sản phẩm mà ngưòi ta lựa chọn nồng độ gel thích hợp, thường dao động khoảng 0,8-3% agarose có |ig/ml ethidium bromid Thơng thường 1/10-1/5 tổng tích sản phẩm PCR sử dụng đê điện di, phần lại bảo quản 4°c -20°c cho thí nghiệm Dung dịch màu có glycerol bromophenol blue cần phải trộn vối sản phẩm PCR để theo dõi di chuyển sản phẩm suốt trình điện di B ả ng 5.1 Ước định nồng độ gel agarose tương ứng với kích thước phân đoạn DNA A garose (%) Kích thước phân đoạn DNA (kb) 0,5 1-30 0,7 0,8-12 1,0 0,5-10 1,2 0,4-7 1,5 0,2-3 2,0 0,05-2 Các mẫu chuẩn đoạn DNA có chiều dài biết trước như: 100, 200, 1000 bacteriophage lambda 0X174 xử lý enzym cắt giối hạn đưa vào giếng rìa phiến gel để đối chiếu vối kết điện di s ả n phẩm điện di thấy rõ ánh sáng đèn tử ngoại có thê chụp ảnh nhờ thiết bị có gắn máy ảnh Chúng ta ưốc định nồng độ gel agarose tương ứng với kích thước phân đoạn DNA (bảng 5.1) Trong đa sơ trường hợp, agarose 1% đủ đế phân tích tốt phân đoạn DNA có chiều dài từ 5004000 đơi base Nếu sản phẩm PCR có kích thước nhỏ, dùng sơ loại agarose đặc biệt Metaphor® 3,5'% Gel có độ phân tách đoạn DNA có chiều dài 10-1000 đơi base NuSieve® 4% cho DNA có chiều dài 502000 đơi base c ả hai sản phẩm BioWhittaker Molecular Applications Một số loại agarose đặc biệt khác có độ phân tách cao Agarose 1000 (Life Technologies) có khả phân tách đoạn DNA có khác 10-500 đôi base Gel sử dụng trường hợp PCR đa mồi vối nhiều loại sản phẩm có chiều dài khác Đối với sản phẩm PCR có kích thưốc r ấ t nhỏ như: đoạn lặp lại vệ tinh DNA (microsatellite repeats), cấu trúc chuỗi đơn đa hình thái (single-strand coníbrmational polymorphisms), kỹ th u ậ t điện di gel polyacrylamid (biên tính khơng biến tính) thường lựa chọn thích hợp 55 SOUTHERN VÀ DOT BLOT Southern blot kỹ th u ậ t liên quan đến việc chuyển đoạn DNA từ gel agarose sang màng lynon phương pháp chuyển mao dẫn, sau DNA lai hóa vối đầu dò đặc hiệu để phát có m ặt DNA đích Chi tiết kỹ th u ật quy trình 5.2 Kỹ th u ậ t có độ nhạy cao, cho phép phát đoạn DNA đích sử dụng đầu dò đánh dấu phóng xạ chất khơng phải phóng xạ hệ thống phát enzym Các điều kiện cho q trình lai hóa kiểm sốt thời điểm khác sau trình cách thay đổi nhiệt độ nồng độ muối Sử dụng đầu dò cho phép phát đoạn DNA đích mà khơng thể phát ethidium bromid Thêm vào đó, việc sử dụng đầu dò cho biết đoạn gen đích có đồng n hất hay khơng? Các gen có thực gen đích gen giống mà có nguồn gốc khác Có thể thay th ế kỹ th u ậ t Southern blot kỹ th u ậ t khác, nhanh đơn giản kỹ th u ậ t (miễn dịch điểm) dot blot Trong kỹ th u ậ t này, sản phẩm PCR chuyến trực tiếp sang màng sau q trình lai hóa DNA với đầu dò đặc hiệu Kỹ th u ậ t khơng liên quan đến việc điện di gen agarose chuyển mao dẫn Do kỹ th u ậ t nhanh hơn, có khả xác định xác sản phẩm DNA đích song khơng xác định kích thước gen có mặt sản phẩm phụ khác Chính kỹ th u ậ t dot blot thường sử dụng có lượng lớn mẫu sản phẩm PCR cần phân tích Có nhiều phương pháp đánh dấu đầu dò dùng cho kỹ th u ậ t Southern dot blot Đầu dò oligonucleotid thường đánh dấu đầu 5’ 32p bời T4 polynucleotid kinase có tác dụng chuyển 32p từ [y-32P]ATP đến đầu 5’ chuỗi oligonucleotid Một đoạn DNA dài đánh dấu cách gắn 32p từ [y32P]dCTP dATP trình tổng hợp DNA DNA polymerase Đầu dò đánh dấu chất khơng phải phóng xạ chất nhuộm huỳnh quang gắn với enzym horseradish peroxydase (HPR) alkalin phosphatase (AP); vối digoxygenin p hát kháng thể kháng DIG đặc hiệu gắn với HPR hay AP; với acridinium ester hay số chất khác 56 DNA đích Đầu dò DNA Xử lý với enzym giới hạn Điện di £el agarose llii ■ B ị Đánh dấu đầu dò VD: đầu dò phóng xạ (*) Biến tính Bién tí DNA dung dịch kiềm [11 Biến tính nhiệt ị ■ Áp màng nylon nitrocellulose ị Lai đầu dò với DNA đích Chuyển DNA lên màng Loại bỏ đầu dò dư thừa dung dịch rửa Chiếu tía X Hình ảnh sản phẩm lai H ình 5.2 Q uy trình kỹ thuật Southern blot PCR LỒNG PCR lồng kỹ th u ậ t tin cậy cho phép phát nhanh sản phẩm PCR Ngưòi ta sử dụng cặp mồi nằm sản phẩm PCR đầu tiên, s ả n phẩm PCR đầu khuôn cho phản ứng sử dụng cặp mồi nội phân tử (hình 5.3) 57 A Khuôn PCR lần 1 Sản phẩm (mồi & 2) PCR lòng Sản phẩm (mồi & 4) B Marker 1EF 1CD c BN c BN Sản phẩm (mồi & 4) 2CD c 2EF BN c BN 3CD c BN 3EF c BN 1450bp 750bp Exon 39 Í G C C A Ĩ Sequencing - _ > Exon 44 + TTC 9CAC&G A * r T M € A C 229 24 T G M A G G C G K 253 TT C A C A G ầ ĩ C I G I Ĩ C A G M A 65 ĨG CC G G CG 77 H ình 5.3 Sơ đồ PCR lổng (A); Kết PCR lồng khuyếch đại gen Dỵstrophin (B) s ả n phẩm giải trình tự đ ể xác định đột biến, (kết thực Trung tàm nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đ ại học Y Hà Nộii) Do sản phẩm PCR lần có kích thước nhỏ sản phẩm lần Người ta ước tính PCR lồng cho phép làm tăng tới 104 lần độ nhậy kỹ th u ậ t PCR đơn Mặc dù sản phẩm PCR lần khơng rõ (ít nhiều sản phẩm phụ) song khn đích khuếch đại lên nhiều lần nhờ PCR lồng 58 tiêp theo Còn sản phẩm phụ sản phẩm PCR lần có khả gán với mồi (của PCR lồng lần 2) không khuếch đại Trong trường hợp lý khơng thiết kê mồi cho PCR lồng, có thê sử dụng mồi cũ (của PCR lần 1) mồi (nội phân tử PCR lần 2) Hoặc cần kéo dài thêm cặp mồi phản ứng lần thêm nucleotid đầu 3’ đủ đê tăng độ đặc hiệu cho phản ứng PCR lồng lần lên nhiều lần Đê giảm thao tác trán h lây nhiễm, tiến hành đồng thời PCR lần PCR lồng nghiệm, c ả hai cặp mồi cho vào đồng thời, song cặp mồi cho PCR lồng thiết kế cho có Tm thấp cặp mồi phản ứng Điều cho phép q trình khuếch đại gen đích lần đầu có nhiệt độ gắn mồi cao PCR lồng Như q trình khuếch đại gen đích PCR lần có nhiệt độ gắn mồi thấp hơn, cho phép cặp mồi khuếch đại sản phẩm PCR đặc hiệu từ sản phẩm PCR ban đầu Sản phẩm PCR cuối điện di gel agarose quan sát thấy sản phẩm trình PCR, lần lần sản phẩm lần có kích thước nhỏ Mặc dù PCR lồng kỹ th u ậ t nhạy song cần lưu ý số yếu tô' h ạn chế kỹ th u ậ t PCR lồng Đó sản phẩm PCR lần không đặc hiệu song lại đủ lớn làm khn cho PCR lồng Hiện tượng dẫn đến sản phẩm gen không đặc hiệu khuếch đại làm sai lệch kết Điều khắc phục cách pha loãng sản phẩm PCR lần tinh chế sản phẩm trước tiến hành PCR lồng lần Thêm vào đó, trường hợp, việc tiến hành song song mẫu đối chứng cần thiết SỬ DỤNG ENZYM CAT g i i h n Phân tích sản phẩm PCR cách sử dụng enzym cắt giới hạn kỹ th u ậ t không phổ biến Tuy nhiên, kỹ th u ậ t đem lại ưu điểm như: hiệu cao, cho kết rõ ràng, nhanh đơn giản Qúy trình kỹ th u ật bao gồm: dung dịch sản phẩm PCR; dung dịch đệm cho enzym giối hạn lOx; enzym cắt giới hạn, thiết bị ủ dụng cụ kèm hóa chất để điện di chụp ảnh Song điều quan trọng phải có vị trí cắt enzym đoạn DNA đích Một điều tấ t enzym giới hạn hoạt động tốt điều kiện sản phẩm PCR vối nhiều thành phần khác như: đệm, ion, nucleotid, mồi, DNA khuôn Do thường phải có bước tinh sản phẩm trưốc tiến hành phản ứng enzym cắt Kỹ th u ậ t phân tích enzym cắt cơng cụ hữu hiệu trường hợp cần xác định có mặt đột biến tạo phản ứng PCR, mà đột biến cấu thành vị trí cắt enzym sợi DNA khn ban đầu khơng có Kỹ th u ậ t phối hợp với kỹ th u ậ t khác lai Southern blot hay PCR lồng 59 158 bp 248 249 250 CGG AGG c c c 5’ i Vị trí cắt Hae-lll 3' ĩ 92 bp 66 bp c / / mm — M -168*4 - 92 • 66 BN BN B\ B\ B> Kho IIP cát m H ình 5.4 Kết cắt enzym giới hạn để xác định đột biến Đột biến 249Ser gen P53 bệnh nhân ung thư gan (a) sả n phẩm b ị cắt thành hai băng 66 92 bp ỏ giếng trường hợp không b ị đột biến; sản phẩm khơng bị cắt 158 bp ỏ giếng biểu thị đột biến ỏ 249Ser Sản phẩm đột biến giải trình tự; sử dụng enzym cắt D del đ ể phân tích đột biến xố đoạn exon gen SMN1 bệnh nhân thoái hoá tuỷ (b) Bệnh nhi BN2, 3, 4, m ang đột biến xoá đoạn exon Bệnh nhi BN6 khơng mang đột biến xố đoạn exon 8, (kết thực Trung tâm nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đ ại học Y Hà Nội) GIẢI TRÌNH T ự GEN TRựC TIẾP (Direct sequencing) Khi sản phẩm PCR đưa vào vector tách dòng tiến hành giải trìn h tự gen cách dễ dàng Tuy nhiên, trường hợp có nhiều sản phẩm PCR cần phải phân tích sàng lọc việc đưa đoạn DNA khác vào 60 vector tách dòng việc làm nhiều cơng sức Chính vậy, trường hợp đó, kỹ thuật giải trình tự gen trực tiêp phương án có tính khả thi Lẽ dĩ nhiên lúc cần phái khăng định gen đích việc giải trình tự Dù kỹ th u ậ t khơng đơn giản, tơn cơng chi phí cao 4S *ilIC A )*G nS G C C *iG JC C C > »)C > C A I»M Ằ S *»M T t*»*U A A JC í)*C T S *G C *í»5»C ÍA T C iA S (;ỉ.l!C ÍÍ»ílíC nC T lA T C C T C nT *l»C T S *«*K )C T SA T M IÍÍ*C »C :l 129 137 145 153 161 169 177 185 193 201 209 217 225 23J 2« IirCCIC(ÍGWClTCÍÍCAIlĩIAGGlCniAA/T(An(iACWÍIÍG;ACíííí?CKACíGCICíĩIlCĩC(ííẪCGCCÍ.CGíACííClĩCC 141 151 161 171 181 191 201 211 221 231 241 H ình 5.5 Kết giải trình tự trực tiếp xác định đột biến gen APC bệnh nhân ung thư đại trực tràng (A) gen FVIII bệnh nhân Hemophilia A (B), ịk ê t thực Trung tâm nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học y Hà Nội) Tuy nhiên, ngày với tiến vượt bậc lĩnh vực này, việc giải trình tự gen ngày tự động hóa, trỏ nên đơn giản tơn Cần phải lưu ý rằng, việc giải trình tự gen trực tiếp có nhiều ưu điểm, giải trình tự nhiều đoạn gen khác sán phẩm PCR Vì có số đột biến phát sinh trình PCR nên trìn h tự gen sản phẩm đại diện cho tấ t đoạn DNA sản phẩm Chính vậy, cần thiết phải giải trìn h tự vài mâu riêng biệt đê đảm bảo đoạn DNA đích với trình tự xác khăng định ĐÁNH DẤU TRỰC TIEP SAN PHAM PCR Kỹ th u ậ t lai Southern blot dot blot cho phép p hát đồng thòi xác định sản phẩm PCR Tuy nhiên, cần phải thiết lập điều kiện thích hợp đế phát nhanh, đơn giản sản phẩm PCR Một kỹ thu ật đảm bảo tính ưu việt đánh dấu trực tiếp sản phẩm PCR s ả n phẩm PCR đánh dấu trình khuêch đại gen đích cách thêm dNTPs hay cặp mồi đánh dấu phóng xạ, huỳnh quang hay biotin Do vậy, sản phẩm PCR đoạn DNA mang cặp mồi hay nucleotid đánh dấu Trong trường hợp này, kỹ th u ật phát áp dụng điện di, chụp tia X hay kỹ th u ậ t phát tín hiệu huỳnh quang 61 ...* a ' BỘ Y TÊ PCR VÀ MỘT ■ SỐ KỸ THUẬT ■ Y SINH HỌC PHÂN TỬ ■ Sách đào tạo sau đại học y dược Mã số: Đ.01 .Y. 06VV Chủ biên: PGS TS TA THÀN H VĂN NHÀ XUẤT BẢN Y HỌC ■ HÀ N Ộ I- ■ CHÍ... d y vè học, việc biên soạn giáo trình, tài liệu giảng d y đặc biệt ưu tiên Sách PCR sô kỹ th u ật y sinh học phân tử biên soạn nhằm phục vụ chủ y u cho việc đào tạo sau đại học Trường đại học. .. viên bậc đại học sau đại học thuộc chuyên ngành khác lĩnh vực y sinh Cuốn sách cung cấp cho dộc giả kiến thức lý thuyết bản, nguyên lý, triển vọng ứng dụng PCR kỹ th u ật y sinh học phân tử khác,