VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÊ THỊ THỦY NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP CỦA VIRUS GÂY BỆNH CÚM A/H7N9 BẰNG PHƯƠNG PHÁP BIỂU HIỆN TẠM THỜI TRONG CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana benthamiana) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Chuyên ngành: Sinh lý thực vật Mã số: 42 01 12 LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC Hà Nội, 2019 Cơng trình hồn thành Viện Cơng nghệ sinh học Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: 1.PGS.TS Phạm Bích Ngọc PGS.TS Chu Hồng Hà Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ Hội đồng chấm luận án Tiến sĩ phiên thức họp tại: Viện Cơng nghệ sinh học Vào hồi ngày tháng Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc Gia Việt Nam - Trang web: http: luanvan.moet.gov.vn - Viện Công nghệ sinh học năm 2019 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Cúm A/H7N9 chủng virus cúm gia cầm phát Trung Quốc vào năm 2013 Virus cúm A/H7N9 gây bệnh truyền nhiễm cấp tính có tốc độ lây lan nhanh với tỷ lệ gây chết cao đàn gia cầm bị bệnh Virus cúm A/H7N9 phân type nhóm virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae, có protein Hemagglutinin (HA) Neuraminidase (NA) bề mặt capsid hạt virus mang tính kháng nguyên tham gia trình đáp ứng miễn dịch Kháng nguyên HA có 16 type (ký hiệu từ H1 đến H16) kháng nguyên NA có type (ký hiệu từ N1 đến N9) Kháng nguyên HA mã hóa phân đoạn hệ gen virus cúm A, có đặc tính kết hợp với thụ thể đặc hiệu bề mặt màng tế bào nhiễm HA có khả đột biến gen tạo nên khác biệt làm thay đổi tính kháng nguyên, đặc biệt điểm cắt enzym protease vị trí có glycosyl hóa xác định bao gồm Asn30, Asn46, Asn249 tiểu phần HA Asn421, Asn493 tiểu phần HA2 Cả vị trí có tính bảo thủ cao kháng nguyên H7 chủng virus H7N9 gây bệnh người gia cầm chuỗi nối HA1 HA), tái tổ hợp biến chủng làm thay đổi kháng nguyên bề mặt dẫn đến thay đổi tương quan đáp ứng miễn dịch Kháng nguyên NA phân đoạn mã hóa, protein bề mặt làm nhiệm vụ enzym phân giải thụ thể tế bào cắt liên kết glycosid phân tử acid sialic (N-acetylneuramic acid) giải phóng virus trình lây nhiễm Kháng nguyên NA phân đoạn mã hóa, protein bề mặt làm nhiệm vụ enzym phân giải thụ thể tế bào cắt liên kết glycosid phân tử acid sialic (N-acetylneuramic acid) giải phóng virus q trình lây nhiễm Trong đợt dịch cúm từ ngày 31/03/2013 có ba trường hợp nhiễm virus cúm gia cầm A/H7N9 người phát công bố Thượng Hải An Huy, Trung Quốc Chỉ thời gian ngắn, tính đến ngày 09/06/2013 loại virus nguy hiểm lây lan 11 tỉnh thành Trung Quốc, gây 131 trường hợp nhiễm bệnh, đa phần bị suy hơ hấp nặng, 39 người tử vong (WHO, 2013) Trong đợt dịch cúm A/H7N9 thứ người Trung Quốc diễn từ 19/1/2017 đến 14/2/2017 khiến 36 người chết tổng số 304 người mắc bệnh (WHO, 2017) Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) nhận định tỷ lệ cao bất thường cho lây nhiễm xác định H7N9 chủng virus nguy hiểm người Các nghiên cứu hệ gen, xác định vùng biến đổi virus cúm A/H7N9 cho thấy virus A/H7N9 tỏ thích ứng nhanh có độc lực cao với tế bào lồi có vú (người, heo, ) so với chủng virus cúm gia cầm khác Cho đến chưa có chứng việc virus cúm A/H7N9 lây truyền từ người sang người - yếu tố để A/H7N9 biến chuyển thành đại dịch cúm Tuy nhiên, lan truyền người người xảy với virus H7 (dịch H7N7 Hà Lan năm 2003) nên cần phải cảnh giác khả lây truyền người-người virus H7N9 Ở Việt Nam chưa ghi nhận trường hợp cúm A/H7N9 người gia cầm; nhiên, nguy xâm nhập, lan truyền gây bùng phát dịch cao Việt Nam có đường biên giới trải dài với Trung Quốc Vấn đề cấp bách việc triển khai biện pháp phòng bệnh chủ động sử dụng trang thiết bị cho việc giám sát máy đo thân nhiệt từ xa, hệ thống xét nghiệm xác định virus… cần thiết nghiên cứu chủ động sản xuất vacxin phòng bệnh Trong năm gần hướng ứng dụng để phát triển loại vacxin cúm khác nhau, có hướng nghiên cứu tạo vacxin thực vật Hệ thống biểu thực vật hữu dụng vacxin tạo hứa hẹn có giá thành thấp từ 10-20 lần so với phương pháp truyền thống Tuy nhiên, protein tái tổ hợp tích luỹ trồng chuyển gen lại không cao thiếu phương thức tinh protein tái tổ hợp hiệu Để khắc phục nhược điểm này, hệ thống biểu tạm thời phương pháp hữu ích để sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp thực vật Phương pháp có ưu điểm nhanh, hàm lượng protein tái tổ hợp cao, khơng bị ảnh hưởng vị trí gắn gen đích tế bào thực vật tiến hành biểu mô biệt hóa hồn tồn Nhận thấy việc nghiên cứu biểu kháng nguyên virus cúm A/H7N9 tế bào thực vật cấp thiết Hơn mơ hình sản xuất kháng ngun tái tổ hợp phương pháp biểu tạm thời thực vật sản xuất vacxin với số lượng lớn nhanh chóng (1-2 tháng) đáp ứng kịp thời dịch bệnh xảy Việc kết hợp kháng nguyên tái tổ hợp với vật liệu nano (ND) nhằm sản xuất vacxin dạng virus nhằm tăng cường hoạt tính kháng nguyên Với sở khoa học ứng dụng trên, lựa chọn đề tài “ Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp virus gây bệnh cúm A/H7N9 phương pháp biểu tạm thời thuốc (Nicotiana benthamiana.) thông qua vi khuẩn Agrobacterium” Mục tiêu nghiên cứu  Biểu xác định đặc điểm cấu trúc kháng nguyên HA trimeric phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND  Đánh giá hoạt tính sinh học, khả kích thích đáp ứng miễn dịch động vật thí nghiệm kháng nguyên tái tổ hợp HA trimeric phức hệ HA trimeric:ND Nội dung nghiên cứu (1):Thu thập thông tin, tổng hợp gen mã hóa kháng nguyên thiết kế vector biểu mang gen mã hóa kháng nguyên HA; (2) :Nghiên cứu biểu tinh kháng nguyên HA virus H7N9 thuốc ;(3): Nghiên cứu tạo phức hệ khả gây ngưng kết hồng cầu kháng nguyên HA HA trimeric:ND (1:12); (4): Nghiên cứu khả kích thích đáp ứng miễn dịch kháng nguyên HA phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND động vật thí nghiệm Đóng góp luận án - Đã thiết kế thành công cấu trúc vector biểu pCB301/HA mono_ELP pCB301/HA trimeric_ELP, pCB301/HA trimeric pCB301/HA trimeric-IgMFc mang gen HA tổng hợp nhân tạo từ gen HA chủng virus cúm H7N9 tạo chủng Agrobacterium mang vector tương ứng - Biểu tinh thành công protein HA tái tổ hợp pCB301/HA mono_ELP, pCB301/HA trimeric_ELP, pCB301/HA trimeric pCB301/HA trimeric-IgMFc thuốc phương pháp mITC IMAC - Đã xác định cấu trúc trimeric kháng nguyên HA khả gây ngưng kết hồng cầu protein HA với hiệu giá ngưng kết HA trimeric_ELP HA trimeric HAU, HA trimeric:ND (1:12) 1024 HAU với lượng µg giếng - Các kháng nguyên HA dạng HA trimeric HAtrimeric:ND (1:12) gây đáp ứng miễn dịch chuột HA trimeric:ND (1:12) kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh HA trimeric Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án 5.1 Ý nghĩa khoa học Luận án cung cấp sở khoa học quan trọng việc thiết kế cấu trúc vector chuyển gen mang gen HA mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric HA trimeric-IgMFc mã hóa cho kháng nguyên HA tái tổ hợp; biểu kháng nguyên tái tổ hợp thuốc phương pháp biểu tạm thời; tách chiết, tinh đánh giá khả kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể kháng nguyên tái tổ hợp động vật thí nghiệm Kết đề tài luận án chứng khoa học tiềm việc sản xuất, phát triển vacxin tiểu đơn vị phòng virus cúm thực vật 5.2 Ý nghĩa thực tiễn Các cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen HA mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp HA mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric HA trimeric-IgMFc chủng virus cúm lưu hành tai Trung Quốc chủng A tumefaciens mang vector sử dụng để nghiên cứu biểu hiện, sản xuất phát triển vacxin tiểu đơn vị phòng virus cúm Quy trình biểu gen HA thuốc phương pháp biểu tạm thời với điều kiện tối ưu đề tài luận án ứng dụng để sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp HA mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric HA trimeric-IgMFc protein tái tổ hợp khác Kháng nguyên tái tổ hợp HA trimeric : ND tạo đề tài luận án ứng viên tiềm cho sản xuất vacxin tiểu đơn vị phòng bệnh cúm gia cầm Việt Nam CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tham khảo tổng kết 19 tài liệu nước, 140 tài liệu nước với nội dung liên quan bao gồm: (1) Đặc điểm cấu trúc virus cúm A/ H7N9 như: nguồn gốc virus cúm A/H7N9, đặc điểm cấu trúc virus cúm A/H7N9, đa hợp tạo nên phân type A/H7N9, đặc điểm kháng nguyên bề mặt virus cúm A/H7N9, tình hình dịch cúm A/H7N9; (2) Vacxin phòng chống bệnh cúm A như: Một số loại vacxin phòng bệnh cúm A nay, vacxin tái tổ hợp từ thực vật, nghiên cứu vacxin cúm A/H7N9 giới, số nghiên cứu vacxin cúm gia cầm Việt Nam nay; (3) Biểu tạm thời protein tái tổ hợp thực vật như: Hệ thống biểu tạm thời protein tái tổ hợp thực vât, q trình biểu tạm thời thơng qua Agrobacterium tumefaciens, chiến lược tăng cường biểu protein tái tổ hơp thực vật, sản xuất protein tái tổ hợp phương pháp biểu tạm thời, tinh protein tái tổ hợp thực vật; (4) Nano kim cương (NDs) ứng dụng tiềm công nghệ sinh học như: giới thiệu chung vật liệu nano kim cương, Ứng dụng Nanodiamons khoa học sống công nghệ sinh học Với tài liệu thu thập kết phân tích cho thấy chủng virus cúm H7N9 trước xuất gây dịch bệnh chim Hà Lan, Nhật Bản Hoa Kỳ Ba trường hợp nhiễm virus cúm gia cầm A/H7N9 người phát công bố Thượng Hải An Huy, Trung Quốc vào ngày 31/03/2013 (WHO, 2013) Đặc biệt, bùng phát dịch cúm H7N9 người gần ghi nhận Trung Quốc diễn từ 19/1/2017 đến 14/2/2017 xem đợt dịch thứ khiến 36 người chết tổng số 304 người mắc bệnh (WHO, 2017) Dữ liệu theo dõi mặt virus học phân tích trình tự genome 83 chủng phân lập từ môi trường (2 trường hợp) người bệnh (81 trường hợp) cho thấy chủng gây bệnh người tương tự chủng phân tích năm 2013 Phân tích tiến hành để xác định xem virus vacxin có liên quan kháng nguyên với virus đợt dịch thứ năm hay không Theo Tổ chức Y tế giới không loại trừ khả cúm gia cầm A/H7N9 lây từ người sang người ổ dịch Trung Quốc Mặc dù, chưa có chứng việc virus cúm A/H7N9 lây truyền từ người sang người - yếu tố để H7N9 biến chuyển thành đại dịch cúm Tuy nhiên, lan truyền người người xảy với virus H7 (dịch H7N7 Hà Lan năm 2003) nên cần phải cảnh giác khả lây truyền người-người virus H7N9 Điều gây nhiều khó khắn cho việc nghiên cứu sản xuất vacxin phòng chống virus cúm A Các vacxin sản xuất từ chủng virus dòng châu Âu dòng Bắc Mỹ hai dạng chủ yếu vaccine sống – nhược độc vacxin vơ hoạt Vacxin vơ hoạt thường an tồn, có khả phòng ngừa triệu chứng lâm sang hiệu bảo hộ không cao Vacxin nhược độc tạo miễn dịch nhược độc tốt với chủng tương đồng mức bảo hộ giảm dần giảm mức tương đồng với chủng mới, có nguy phát triển độc tính trở lại, thân virus vacxin sau nhiều lần truyền nhiễm đột biết trở thành cường độc Để nâng cao hiệu phòng chống virus cúm A, việc nghiên cứu sản xuất loại vacxin hệ có bảo hộ cao với biến chủng cần thiết Vacxin tiểu đơn vị sản xuất thực vật phòng chống virus cúm hướng nghiên cứu đánh giá có triển vọng ưu điểm ổn định bền vững, đảm bảo hoạt tính sinh học, dễ dàng sản xuất với khối lượng lớn, chi phí sản xuất thấp Protein HA protein kháng nguyên mang gen chủng virus H7N9 lựa chọn ứng viên có tiềm để sản xuất vacxin tiểu đơn vị phòng chống virus cúm A Hiện có nhiều hệ thống biểu protein HA virus cúm thử nghiệm, hệ thống chúng tơi sử dụng hệ thống biểu gen tạm thời thực vật phương pháp biểu tạm thời nhờ Agrobacterrium phương pháp để sản xuất kháng nguyên có nhiều ưu điểm chứng minh như: Hàm lượng kháng nguyên cao, thời gian biểu nhanh, không bị ảnh hưởng vị trí gắn gen đích tế bào thực vật tiến hành biểu mơ biệt hóa hồn tồn mơ Với hiểu rõ cấu trúc phân tử hệ gen tính kháng nguyên virus cúm A gây bệnh gia cầm thành tựu đạt biểu hiện, sản xuất vacxin tiểu đơn vị thực vật phòng chống bệnh cúm để thực đề tài luận án CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 VẬT LIỆU 2.1.1 Chủng vi khuẩn Chủng Escherichia coli DH5α; Chủng A tumefaciens C58C1; Chủng A tumefaciens C58C1 mang vector pIBT-35S-HC-Pro PVY chứa gen mã hóa protein HcPro PVY 2.1.2 Các vector vật liệu thực vật, động vật Vector pUC/HA mang gen mã hóa cho kháng nguyên nhân tạo tổng hợp công ty SGIDNA Thụy Điển; Vector tách dòng pBT (Phan cs., 2005); Vector pRTRA35S-HA-histag-cmyc100xELP-KDEL vector pRTRA-35S-H5pII-histag-cmyc-ELP-KDEL Vector pRTRA_35S_SP_His_ H5_pII_IgMFc _cmyc_KDEL thiết kế (Phan cs., 2013); Các vector chuyển gen pCB301-Kan (dựa vào pCB301 Xiang cs., 1999) pBT/Hcpro PRSV; Cây thuốc N benthamiana; Chuột bạch chủng BALB/C 2.1.3 Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu Các mồi sử dụng để khuếch đại vùng mang gen mã hóa H7: cặp mồi nhân gen HA mono_ELP H7-BamHI_F, H7-BamHI_R; cặp mồi nhân gen HA trimeric TrH7-PspOMI_R, H7-BamHI_F H7-BamHI_R; cặp mồi nhân gen HA trimeric-IgMFc M-BamHI-trimer_R, H7-BamHI_F; cặp Mồi giải trình tự gen H7 35S-SQF 35STerm 2.1.4 Hóa chất Kit tách chiết RNA từ thực vật GenElute TM Total RNA Miniprep (Sigma), kit tách chiết plasmid QIAprep Spin Miniprep , kit gel QIAquick Gel Extraction kit tinh DNA QIAamp DNA mini hãng QIAGEN, thang DNA Kb, protein (Fermentas), loại enzyme hạn chế Fermentas Các hoá chất khác như: Yeast extract, NaCl, Agarose, Sucrose, Trypton, KCl, Tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, Glycerol, CaCl2, Ethanol 70%, nước khử ion; loại kháng sinh kanamycin, rifamycine, spectinomycin hóa chất thơng dụng khác hãng Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech… Kháng thể kháng cmyc tổng hợp từ khuẩn phòng thí nghiệm trọng điểm-Viện Công nghệ sinh học, kháng thể anti-mouse IgG cộng hợp HRP (Promega - USA), kháng ngun scFv (50 ng/µl) có trình tự cmyc tổng hợp phòng thí nghiệm trọng điểm-Viện Cơng nghệ sinh học, hóa chất màu TMB (3,3’,5,5’ tetramethylbenzidine), DAB (Diaminobenzidine) Kit phim Super Signal West Pico Trial (Thermo Scientific) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Các phương pháp thiết kế gen, thiết kế vector chuyển gen tạo chủng A tumefaciens cho biểu tạm thời Phân tích tổng hợp thơng tin trình tự gen HA mã hóa cho kháng ngun hemagglutinin virus cúm A/H7N9 gây bệnh Trung Quốc Ngân hàng GenBank Thu thập thông tin mã phổ biến ưu tiên sử dụng máy sản xuất protein thực vật Lựa chọn mã ưu tiên tương thích để cải biến trình tự gen HA cho phù hợp với hệ biểu thực vật, đồng thời bổ sung trình tự nhận biết số enzyme cắt hạn chế cho mục đích thiết kế vector chuyển gen Đặt hàng cơng ty để tổng hợp nhân tạo đoạn gen HA đổi mã Thành phần phản ứng PCR bao gồm : DNA khn 50 ng, Mồi xi 0,1 µM, Mồi ngược 0,1 µM, dNTPs 0,2 µM, Pfu DNA polymerase 2,5 U, 10X đệm Pfu DNA polymerase µl, Tổng thể tích 50 µl Chu trình nhiệt sau: 94oC/3 phút; 30 chu kỳ lặp lại bước 94 oC/30 giây, 58oC/30 giây, 72oC/1 phút 30 giây; 72oC/5 phút Sản phẩm PCR điện di gel agarose 0,8% sau đưuọc tinh sahj xử lý với enzyme cắt giới hạn thiết kế để ghép nối vào plasmid pRTRA 35S-Histag-Cmyc-100xELP biến nạp vào E.coli theo phương pháp sốc nhiệt Sambrook cộng (2012) Khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp chọn lọc môi trường LB đặc bổ sung kháng sinh 50 mg/l kanamycin Vector tái tổ hợp tách chiết từ khuẩn lạc cho kết PCR dương tính (Colony-PCR) giải trình tự, sử dụng cặp mồi trình bày Bảng 2.1 phân tích kiểm tra tính xác phần mềm BioEdit 7.0 Lasergen (DNAstarinc, Madison, WI, USA) 2.2.2 Thiết kế cấu trúc vector mang gen HA phục vụ chuyển gen Vector nhân dòng pRTRA tái tổ hợp mang gen mã hóa kháng HA mono_ELP, HA trimeric_ELP, HA trimeric, HA trimeric-IgFMc vector chuyển gen thực vật pCB301 phân cắt enzyme HindIII Các sản phẩm cắt từ vector pRTRA bao pCB301 35S-HA mono_ELP, pCB301 35S-HA trimeric_ELP, pCB301 35S-HA trimeric – KDE pCB301 35SHA trimeric_ELP–KDE ghép nối vào khung vector pCB301 sử dụng T4 DNA ligase biến nạp vào tế bào E coli DH5α khả biến phương pháp sốc nhiệt (Sambrook cs., 2012) Việc chọn dòng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp thực mơi trường LB đặc có chứa 50 mg/l kanamycin phản ứng Colony-PCR Các vector tái tổ hợp mang gen đích pCB301 35S-HA mono_ELP, pCB301 35S-HA trimeric_ELP, pCB301 35S-HA trimeric – KDE pCB301 35S-HA trimeric_ELP–KDE, tách chiết từ dòng khuẩn lạc dương tính kiểm tra phản ứng cắt với enzyme giới hạn HindIII NcoI Các vector chuyển gen sau biến nạp vào chủng A tumefaciens C58C1 phương pháp xung điện Tách chiết tinh plasmid: Plasmid tinh theo phương pháp Sambrook cộng (2012) Sử dụng kít hãng Fermentas cung cấp để tinh plasmid Phương pháp xử lý AND enzyme cắt giới hạn: Thành phần phản ứng cắt thực theo hướng dẫn hãng sản xuất bọ Kit sử dụng enzyme 2.2.3 Các phương pháp biểu tạm thời đánh giá mức độ biểu protein tái tổ hợp thuốc 2.2.3.1 Chuẩn bị dịch khuẩn Các dòng khuẩn lạc vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58C1 mang vector đích chứa đoạn gen mã hóa protein HA Agrobacterium tumefaciens C58C1 mang vector chứa gen mã hóa protein HcPro PRSV ni ml mơi trường YEB có bổ sung 50 µg/ml Rif 100 µg/ml Spectinomycin (Spec) qua đêm Sau ml dịch ni ni tiếp 50 ml YEB chứa 50 µg/ml Rif 100µg/ml Spec qua đêm Tồn dịch ni dùng để nuôi chuyển tiếp 500 ml YEB bổ sung 50 µg/ml Rif 100 µg/ml Spec qua đêm Khuẩn thu nhận cách ly tâm 4000 v/p 10 phút 4oC Cặn khuẩn chủng hòa tan đệm MES (10 mM MgCl2; 10 mM MES; pH 5,6) tới OD600 = 0,5 để dùng cho biến nạp Dịch khuẩn dùng riêng rẽ hay trộn với theo tỷ lệ 1:1, tùy theo mục đích thí nghiệm 2.2.3.2 Phương pháp xâm nhiễm khuẩn vào thuốc Cây Nicotiana benthamiana từ 4-8 tuần tuổi dùng để biến nạp Trước biến nạp, bọc giấy quanh bầu đất sau úp ngược xuống Tồn bị nhấn dìm bình chứa vi khuẩn bên bình hút chân khơng Hút chân không 27 inches Hg, phút Xả không khí từ từ, mở nắp Các thuốc sau biến nạp tiếp tục nuôi chăm sóc buồng sinh trưởng có điều kiện ánh sáng 5.000 – 7.000 Lux, nhiệt độ 25 ± 2oC, độ ẩm 60 - 70% 2.2.3.3 Tách chiết protein tổng số Protein tổng số từ mẫu tách dịch chiết: PBS (Phosphate-buffered saline) 0,05% Tween theo tỉ lệ 1:2 (Trọng lượng mẫu - g) : Thể tích dịch chiết - ml) bảo quản -20 oC Hàm lượng protein tổng số đo bước sóng 595 nm theo phương pháp Bradford năm (1976) với đường chuẩn dựng BSA (Bovine Serum Albumin) 2.2.3.4 Điện di SDS-PAGE lai miễn dịch Western blot Mức độ biểu protein tái tổ hợp mẫu protein tách chiết từ xâm nhiễm khuẩn đánh giá lai miễn dịch Western Blot theo phương pháp Burnette cs, 1981 Điện di SDS-PAGE: Bản gel chuẩn bị theo công thức Laemmli, 1970 Western blot : Sau điện di biến tính protein gel polyacrylamide-SDS, protein chuyển qua màng máy Pierce G2 Fast Blotter chế độ 25 V 1,3 mA 20 phút Màng chứa kháng nguyên phủ 5% sữa tách bơ pha dung dịch PBS 0,05% Tween Rửa màng dung dịch PBST lần, lần phút 2.2.4 Tách chiết tinh protein tái tổ hợp 2.2.4.1 Phương pháp tinh protein dựa vào sắc ký ion cố định kim loại IMAC (Immobilized Metal ion Chromatography) Lá thuốc biểu protein tái tổ hợp làm lạnh nitơ lỏng nghiền thành dạng đồng máy xay sinh tố Protein tổng số tách chiết đệm 50 mM Tris (pH 8,0) Dịch chiết phân tách ly tâm lần (25,000 v/p, 30 phút, 4oC) trộn với agarose gắn Ni-NTA Hỗn hợp trộn 30 phút, oC đưa vào cột sắc ký Rửa cột chứa hỗn hợp lần với đệm rửa (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 30 mM Imidazole, pH 8,0) 2.2.4.2 Phương pháp tinh protein gắn ELP mITC (membrane-based Inverse Transition Cycling) Nghiền 100 g nitơ lỏng cối chày sứ Bổ sung 200 ml Tris-HCl 50 mM (pH 8.0) lạnh Ly tâm 13000 v/p 30 phút 4oC Bổ sung NaCl đến nồng độ M Ly tâm 13000 v/p 30 phút 4oC Dung dịch đưa qua màng polyethersulfone (PES) 0,22 µm 4oC để thu dịch chiết trước xử lý Dịch chiết làm ấm đến nhiệt độ phòng lọc qua màng cellulose acetate 0,2 µm sử dụng máy bơm Rửa màng lần NaCl 2M để loại protein lẫn Nước Milipore-Q lạnh chuyển qua màng lọc để thu hồi protein gắn ELP 2.2.5 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học protein kháng nguyên tinh 2.2.5.1 Phương pháp đánh giá khả hình thành oligomer protein HA trimeric phản ứng liên kết ngang (crosslinking reaction) Để kiểm tra khả hình thành trạng thái oligomer protein gắn cấu trúc tạo trimer, phản ứng crosslinking thực theo Weldon cs, 2010 Cụ thể, µg protein tái tổ hợp tinh trộn với Bis [sulfosuccinimidyl] suberate (BS3) đến nồng độ mM ủ 30 phút nhiệt độ phòng Dừng phản ứng cách bổ sung 1M Tris-HCl pH 8.0 đến nồng độ 50 mM ủ 15 phút Sau phản ứng, protein điện di biến tính gel SDS-PAGE 4-10% chuyển lên màng cho phân tích Western blot 2.2.5.2 Phản ứng ngưng kết hồng cầu Chuẩn bị tế bào hồng cầu: Thu ml mẫu máu từ tĩnh mạch cánh gà khỏe mạnh, chưa tiêm chủng với loại vacxin hòa dung dịch Alserver với tỷ lệ 1: Dung dịch sau ly tâm với thể tích tương đương PBS với tốc độ 1500 vòng/10 phút để hồng cầu lắng xuống đáy Quá trình lặp lại hai lần với PBS Sau hút ml hồng cầu cho vào 198 ml PBS để thu tế bào hồng cầu gà 1% bảo quản tủ 4°C Phản ứng ngưng kết hồng cầu: Phản ứng ngưng kết hồng cầu thực theo OIC (OIC, 2014) Bổ sung thêm 50 µl kháng nguyên vào giếng nhựa vi chuẩn độ có đáy hình chữ V chứa 50 µl PBS Pha lỗng lần tồn hàng, sau bổ sung thêm 50 µl 1% tế bào hồng cầu vào giếng Kết đọc sau ủ đĩa 25°C 30 Nồng độ pha loãng đến điểm cuối cho phản ứng ngưng kết hồng cầu xách định đơn vị ngưng kết (HAU) (Phan cs., 2014) 2.2.5.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học protein HA trimeric tinh kết hợp với hạt Nano kim cương Phương pháp sản xuất hạt Nano kim cương (NDs) Bột kim cương (Diamond Innovations, USA) chức hóa bề mặt với nhóm có chứa oxy phương pháp xử lý hỗn hợp axit oxy hóa mạnh (3 thể tích H 2SO4: thể tích HNO3) lò vi sóng làm nóng (~ 100 °C) mơ tả nghiên cứu trước Pham Dinh Minh cộng (2013) Việc xử lý thực lò vi sóng lò phản ứng (100W, Model Discover, CEM) Vào cuối giai đoạn làm nóng lò vi sóng, chúng tơi có biện pháp phòng ngừa để đảm bảo axit dư lại pha loãng trước thu thập NDs Lưu ý rằng, để an tồn, lò phản ứng vi sóng đặt hộp hóa học để bảo vệ người thực khỏi tiếp xúc NO2 Tổng hợp phức hệ H7 trimeric-ND Hạt Nano kim cương có nồng độ 10 mg hạt/ ml siêu âm trước trộn với kháng nguyên tinh theo tỷ lệ 1:1 (g protein:g hạt), 1:3, 1:5, 1:7, 1:9, 1:12 1:15 loại đệm khác PBS nước deion nhằm tìm điều kiện thích hợp cho hoạt tính protein đạt độ tan hỗn hợp HApII-NDs tốt Hỗn hợp hạt protein tiếp tục siêu âm Phương pháp nghiên cứu đặc điểm HA trimeric-ND Phương pháp đo kích thước Zeta potential: Sự phân bố kích thước Zeta potential ND trước sau gắn protein đo máy phân tích hạt (Delsa @ NanoC, Backman Coulter, USA) Để phân tích kích thước Zeta potential, ND ND gắn protein hòa lại DI-H2O nồng độ 50 μg / mL Để đánh giá xu hướng kết tủa phức hợp ND protein đệm muối, mẫu hòa tan lại 1X PBS trước đo kích thước hạt Phương pháp phân tích ảnh hiển vi điện tử (Transmission Electron Microscopy -TEM): Đặc điểm bề mặt hình dạng ND phức hệ HApII-ND kiểm tra ảnh TEM ND H7:ND hòa tan nước deion đến nồng độ mg/mL Hạt dung dịch đặt đĩa TEM quan sát ND H7:ND đánh giá hoạt tính sinh học phản ứng ngưng kết hồng cầu (theo 2.2.5.1) Tỷ lệ trộn hạt cho kết hiệu giá ngưng kết cao dùng để chuẩn bị cho gây miễn dịch chuột Khả bám protein với hạt kiểm tra lai miễn dịch 2.2.5.4 Phương pháp gây miễn dịch tạo kháng thể chuột Protein tái tổ hợp sau tinh sạch, chuẩn nồng độ 50 µg/ml hỗn hợp protein tái tổ hợp trộn với hạt Nano kim cương theo tỷ lệ tốt (gam protein:gam hạt) sử dụng để gây đáp ứng miễn dịch chuột Chuột chia làm nhóm nhóm : Nhóm tiêm PBS trộn hạt; Nhóm tiêm HApII trộn hạt Nhóm tiêm HA trimeric Chuột tiêm da ba lần vào ngày 1, 14 28 với liều lượng 200 µl Huyết từ máu chuột thu vào ngày thứ sau lần tiêm thứ thứ Huyết chiết từ máu chuột sử dụng để phát kháng thể IgG đặc hiệu kỹ thuật ELISA lai Western blot 2.2.5.5 Kiểm tra khả tạo đáp ứng kháng thể lai miễn dịch ELISA Phản ứng lai miễn dịch: Protein từ gel chuyển sang sang màng nitrocellulose (4oC qua đêm, 20 mA) Màng phủ dung dịch PBS1X chứa 5% sữa không béo Tiếp đến, màng rửa lần với PBS 1X Sau đó, màng phủ với huyết (pha loãng 500 lần) kháng thể Anti-mouse H7N9 hemagglutinin/HA antibody (SinoBiological InC.) Màng rửa lần với PBS 1X Màng phủ với kháng thể anti-mouse IgG có gắn HRP (horseradish Peroxidase) với độ pha loãng 500 lần Tiếp đến, màng rửa dung dịch PBS 1X lần Cuối protein màng màu dung dịch màu có chứa chất DAB (Diaminobenzidine) 15 phút đến băng màu nâu Phản ứng ELISA: Để kiểm tra huyết chuột, giếng đĩa microtiter (ImmunoPlate Maxisorp, Nalgen Nunc International, Roskilde, Denmark) phủ với 50 ng kháng nguyên đệm PBS1X ủ qua đêm 40C Sau đó, đĩa phủ dung dịch PBS1X chứa 5% sữa không béo Tiếp đến, đĩa rửa lần với PBS 1X Đĩa phủ với huyết (pha loãng 5000 lần) Đĩa rửa lần với PBS 1X Sau đó, đĩa phủ với kháng thể anti-mouse IgG có gắn HRP (Horseradish Peroxidase) với độ pha lỗng 500 lần rửa dung dịch PBS 1X lần Cuối cùng, đĩa màu dung dịch màu có chứa chất 3,3',5,5'Tetramethylbenzidine (TMB) 15 phút, sản phẩm phản ứng cho màu xanh, sau cố định màu HCl 1N, màu vàng phản ứng đo bước sóng 450nm 2.2.6 Phân tích thống kê kết thực nghiệm Xử lý phân tích thống kê kết thực nghiệm: phân tích thống kê thực chương trình Xcxel sử dụng phương pháp Student, t-test 0,05 ≥ p có ý nghĩa thống kê 2.3 Địa điểm nghiên cứu: Phòng cơng nghệ tế bào thực vật, phòng thử nghiệm sinh học thuộc Viện Công nghệ sinh học CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tổng hợp nhân tạo thiết kết vector hỗ trợ biểu gen mã hóa kháng nguyên HA 3.1.1 Tổng hợp nhân tạo gen mã hóa kháng ngun HA 3.1.1.1 Phân tích trình tự gen HA Tìm kiếm khai thác thơng tin ngân hàng gen quốc tế, thu thập trình tự nucleotide gen HA mã hóa cho kháng nguyên hemagglutinin chủng virus cúm A/H7N9 gây bệnh gia cầm Trung Quốc năm 2013 2014 với mã số KF918659.1 KJ411975.1 Theo đó, gen H7 hoàn chỉnh chủng bao gồm 1683 nucleotide mã hóa cho 559 axit amin, 18 axit amin dẫn đầu đoạn peptide tín hiệu đóng vai trò định tham gia vào việc vận chuyển chuỗi polypeptide xuyên qua màng tế bào, tiểu phần HA1 gồm 321 axit amin tiểu phần HA2 gồm 220 axit amin Khi biểu tế bào thực vật, với mục đích giữ lại protein kháng nguyên hemagglutinin mạng lưới nội chất, loại bỏ chuỗi peptide tín hiệu gồm 18 axit amin dẫn đầu (được ký hiệu màu đen Hình 3.1), đồng thời, trình thiết kế vector chuyển gen sau này, chúng tơi sử dụng đoạn trình tự gồm 75 nucleotide (được gạch chân Hình 3.1) mã hóa cho LeB4 ER-signal peptide đoạn peptide tín hiệu gen LeB4 (mã hóa cho protein legumin type B đậu ngựa Vicia faba) để nối ghép với đoạn gen HA tối ưu hóa Trên sở trình tự axit amin suy diễn, xác định vị trí axit amin quy định đặc tính quan trọng kháng nguyên HA chủng A/Shanghai/2/2013 nghiên cứu bao gồm vị trí glycosyl hóa, điểm cắt protease, vị trí bám dính thụ thể vị trí epitope, đồng thời so sánh với kháng nguyên HA số chủng virus H7N9 phát phân lập người gia cầm vùng dịch Trung Quốc giai đoạn từ 2013-2016 3.1.1.2 Cải biến trình tự gen mã hóa kháng ngun HA Để cải biến mã theo hướng phù hợp với máy sản xuất protein thực vật, vào bảng tần suất sử dụng codon thực vật ngân hàng liệu mã di truyền Codon Usage Database (http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html) kết hợp với việc sử dụng phần mềm Codon Optimization 2.0, loại bỏ thay codon (khoảng 10%) gen H7 Ngồi ra, trình tự ATTTA cho gây bất ổn cho trình phiên mã (Gutierrez đtg., 1999) loại bỏ Thêm vào đó, hình thành cấu trúc mRNA thứ cấp giảm thiểu nhờ sử dụng phần mềm gốc Invitrogen Mặc khác, để thuận tiện cho việc cắt nối ghép gen trình thiết kế vector chuyển gen vào thực vật, hai vị trí nhận biết enzyme hạn chế BamHI PspOMI thêm vào đầu 5’ 3’ gen H7 Việc đổi mã thực dựa sở mã thay đổi cho phù hợp với hệ thống biểu thực vật không làm thay đổi trình tự axit amin Trình tự nucleotide trình tự acid amin suy diễn đoạn gen trước sau đổi mã kiểm tra so sánh phần mềm BioEdit Kết cho thấy, gen HA gốc gen HA cải biến mã có trình tự nucleotide tương đồng 76%, nhiên vị trí sai khác khơng làm ảnh hưởng đến trình dịch mã, trình tự axit amin suy diễn từ gen đạt độ tương đồng 100% hình 3.2 3.1.2 Kết tạo vector chuyển gen mã hóa kháng nguyên HA mono_ ELP 3.1.2.1 Tạo vector tách dòng pRTRA _35S_HA mono_ ELP Gen HA có kích thước 1644 bp tổng hợp nhân tạo công ty SGI-DNA (USA) nằm vector pUC/HA Hai đầu đoạn gen chứa trình tự nhận biết cặp enzyme cắt giới hạn BamHI PspOMI Do đó, chúng tơi sử dụng cặp enzyme để thu đoạn gen HA từ vector ban đầu Sản phẩm cắt điện di thu đoạn có kích thước tương ứng với HA khoảng 1,7 kb Sản phẩm gel, tinh điện di kiểm tra gel agarose 0,8 % với thang DNA kb Kết thể (Hình 3.3.A.) đồng thời vectoeer tách dòng trung gian pRTRA35S_H5-histagcmycELP-KDEL xử lý cặp enzyme BamHI PspOMI để loại bỏ đoạn gen H5 thu đoạn khu có kích thước 5,05kb Các phân đoạn ADN có kích thước khoảng 1,7kb 5,05kb thu nhận tinh phục vụ cho phản ứng ghép nối tạo vector tách dòng tương ứng pRTRA_HA mono_ELP Hình 3.8 Kết điện di sản phẩm xử lý vector tách dòng enzyme giới hạn BamHI/PspOMI M: Marker DNA, (1) pRTRA_35S_ HA trimeric 3.1.4.2 Tạo vector chuyển gen pCB301_35S_ HA trimeric Vector tách dòng trung gian pRTRA_35S_ HA trimeric pBC301cùng xử lý enzyme HindIII nhằm thu đoạn gen mục tiêu bao gồm promoter 35S_ HA trimeric Kết điện di cho thấy, với sản phẩm cắt vector pCB301 cho băng nằm kích thước khoảng 5,6 kb theo tính tốn lý thuyết, sản phẩm cắt vector pRTRA 35S_ HA trimeric cho vạch băng: vạch có kích thước khoảng 2,5 kb tương ứng với cassette 35S_ HA trimeric, băng lại có kích thước khoảng 1,7 kb 0,9 kb đoạn khung vector lại (Hình 3.9.A) Các phân đoạn DNA có kích thước 5,6 kb 2,6 kb sau thu nhận tinh để phục vụ cho phản ứng nối ghép tạo vector chuyển gen tương ứng pCB301_35S_ HA trimeric Để biết chắn plasmid biến nạp vào tiến hành nuôi tách plasmid khuẩn biến nạp vector tái tổ hợp, sau kiểm tra enzyme cắt giới hạn HindIII (Hình 3.9.B) kết kiểm tra chứng minh vector pCB301_35S_ HA trimeric thiết kế thành công Vector tái tổ hợp sau biến nạp vào tế bào A tumefaciens C58C1 Hình 3.9 Kết phân tích kiểm tra vector chuyển gen pCB301_35S_ HA trimeric HindIII 3.1.5 Tạo cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen HA trimeric-IgMFc 3.1.5.1 Tạo vector tách dòng mang gen mã hóa protein HA trimeric-IgMFc Thiết kế vector tách dòng pRTRA_35S_SP_His_ HA trimeric-IgMFc Xử lý đồng thời đoạn gen HA trimeric-IgMFc khuếch đại vector pRTRA_35S_SP_His_ HA trimeric-IgMFc cặp enzyme BamHI PspOMI Gen HA xử lý enzyme đoạn khung vector sau loại bỏ gen mã hóa kháng ngun H5 (khoảng 1,5 kb) lại có chiều dài gần 4,3 kb thu nhận tinh (Hình 3.10 A, B) phục vụ cho phản ứng nối ghép T4-DNA ligase để tạo vector tái tổ hợp pRTRA_35S_SP_His_ HA trimeric-IgMFc Kết điện di sản phẩm cắt cho băng vạch khoảng 1,5 kb 4,3 kb theo tính tốn lý thuyết (Hình 3.10.D) Như thiết kế thành công vector pRTRA_35S_SP_His_ HA trimeric-IgMFc 11 Hình 3.10 Kết thiết kế vector pRTRA_35S_SP_His_ HA trimeric-IgMFc xử lý vector BamHI PspOMI B): sản phẩm tinh đoạn gen HA (1) khung vector (2) sau xử lý BamHI PspOMI (C): colony-PCR chọn lọc khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp (D): cắt kiểm tra vector BamHI PspOMI 3.1.5.2 Tạo vector chuyển gen pCB301_35S_SP_His_HA trimeric-IgMFc Kết điện di cho thấy, với sản phẩm cắt vector pCB301 cho băng nằm kích thước khoảng 5,5 kb theo tính tốn lý thuyết (Hình 3.11.A.1); sản phẩm cắt vector pRTRA_35S_SP_His_ HA trimeric_IgMFc cho vạch băng: vạch có kích thước gần 3,2 kb tương ứng với cassette 35S_SP_His_ HA trimeric_IgMFc, vạch băng lại có kích thước gần 2,7 kb đoạn khung vector lại (Hình 3.11.A.2) Các phân đoạn DNA có kích thước 5,5 kb 3,2 kb sau thu nhận tinh để phục vụ cho phản ứng nối ghép tạo vector chuyển gen CB301_35S_SP_His_ HA trimeric_IgMFc Vector tái tổ hợp kiểm chứng xử lý enzyme giới hạn HindIII (Hình 3.11 B) Đồng thời để chọn vector chứa gen mã hóa protein HA-pII-IgMFc có chiều biểu ngược chiều gen kháng kháng sinh, cắt kiểm tra enzyme NcoI (Hình 3.11.C) Các kết chứng minh vector pCB301_35S_SP_His_ HA trimeric_IgMFc thiết kế thành cơng Hình 11 Kết thiết kế vector pCB301_35S_SP_His_ HA trimeric_IgMFc (A): xử lý vector pCB301-Kan (1) RTRA_35S_SP_His_HA trimeric_IgMFc (2) HindIIIB): Cắt kiểm tra vector CB301_35S_SP_His_HA trimeric_IgMFc HindIII (C): Cắt kiểm tra vector pCB301_35S_SP_His_ HA trimeric_IgMFc NcoI 3.2 Tối ưu điểu kiện biểu tinh protein HA tái tổ hợp 3.2.1 Tối ưu điểu kiện biểu protein HA tái tổ hợp 3.2.1.1 Ảnh hưởng vector hỗ trợ Để đánh giá mức độ hoạt động vector mang gen mã hóa cho protein tái tổ hợp HA vector hỗ trợ mang gen mã hóa cho protein HcPro_PRSV ức chế bất hoạt gen hoạt động kiểm soát promotor CaMV35S, hai thí nghiệm khác thực đồng thời sử dụng chủng Agrobacterium tumefaciens mang vector hỗ trợ Ở thí nghiệm chủng vi khuẩn 12 mang gan mã hóa cho protein tái tổ hợp HA nuôi đến nồng độ khuẩn OD600 đạt 0,5 xâm nhiễm vào thuốc (4-6 tuần tuổi) phương pháp hút chân khơng Ở thí nghiệm thứ chủng vi khuẩn mang gan mã hóa cho protein tái tổ hợp HA nuôi đến nồng độ khuẩn OD 600 đạt 0,5 xâm nhiễm vào (4-6 tuần tuổi) với vector hỗ trợ pIBT/HC-Pro PRSV phương pháp hút chân không Mẫu thu sau ngày xâm nhiễm để tách protein Mức độ biểu HA khơng có vector hỗ trợ có vector hỗ trợ đánh giá phương pháp lai miễn dịch Kết thể Hình 3.12 Hình 3.12 Kết đánh giá biểu kháng nguyên HA (A): Dịch chiết protein không sử dụng vector hỗ trợ ; (B): Dịch chiết protein sử dụng vector hỗ trợ HcPro PRSV 3.2.1.2 Kết tối ưu quy trình biểu tạm thời kháng nguyên HA thuốc Biểu tạm thời protein tái tổ hợp nói chung kháng nguyên HA nói riêng thực vật phương pháp biểu tậm thời sử dụng máy hút chân không chưa tiến hành Việt Nam Mặc dù quy trình thực đơn giản có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả biểu protein tái tổ hợp như: Nồng độ chất dẵn dụ Acetone syringone (AS), nồng độ vi khuẩn cho xâm nhiễm, vị trí xâm nhiễm, thời gian thu mẫu Vì vậy, việc tiến hành xây dựng quy trình chuẩn cho biểu protein tái tổ hợp cần thiết Trong nghiên cứu này, tiến hành tối ưu bốn yếu tố ảnh hưởng đến biểu tạm thời HA điều kiện có hỗ trợ protein HC-pro là: Nồng độ chất dẫn dụ acetone syringone (AS), nồng độ khuẩn cho xâm nhiễm, vị trí xâm nhiễm thời gian thu mẫu Kết biểu HA điều kiện khác đánh giá lai miễn dịch (Hình 3.13) phân tích phần mềm ImageJ Số liệu xử lý Excel ảnh hưởng yếu tố đến biểu protein HA đánh giá phần mềm INOVA Hình 3.13 Kết biểu protein HA điều kiện thí nghiệm khác M: Marker; 1,2,3,4,5,6,7,8,9: Dịch chiết protein từ biểu protein cơng thức thí nghiệm L1,L2,L3,L4,L5,L6,L7,L8,L9; 10,11,12,13 là: 50,100,150,200 ng ScFv-cmyc;14: Đối chứng âm dịch chiết protein từ hút chân không với đệm MES 3.2.1.3 Tối ưu nồng độ PEG cho tinh protein HA có gắn đuôi ELP Kháng nguyên tái tổ hợp cần tinh cho nghiên cứu đặc tính kháng nguyên, khả gây miễn dịch động vật Trong nghiên cứu này, đưa phương pháp đơn giản để tinh protein tái tổ hợp dựa gắn đuôi ELP Sự chuyển pha nghịch đảo protein gắn ELP phụ thuộc vào nhiệt độ nồng độ muối Sự tăng nồng độ muối nhiệt độ dẫn đến hình thành protein không tan, phân tử protein tách khỏi dung dịch ly 13 tâm nhiệt độ định Protein gắn ELP không tan hòa tan lại đệm lạnh nồng độ ion thấp Meyer cộng quan sát thấy nguyên nhân gây chuyển pha nghịch đảo hình thành khối kết tụ kích thước nhỏ protein gắn ELP Những khối kết tụ gắn màng Đây sở cho thí nghiệm tinh HA mono_ELP HA trimeric_ ELP màng lọc dựa chuyển pha nghịch đảo (mITC) Tuy nhiên, trình tinh qua màng ES 0,2 µm cho dịch protein muối NaCl 2M nhiệt độ thường dịch không qua màng Nguyên nhân có nhiều protein tạp chưa bị loại bước li tâm qua màng PES 0,22 µm Vì vậy, để loại bớt protein tạp bổ sung PEG 8000 vào dịch protein sau li tâm Nồng độ PEG tối ưu nhằm thu lại nhiều HA tạp Kết tối ưu nồng độ PEG thể qua (Hình 3.14) Hình 3.14 Kết tối ưu nồng độ PEG cho protein HA trimeric _ ELP (A): đánh giá SDS-PAGE; (B): lai miễn dịch 3.2.2 Kết biểu tinh protein HA 3.2.2.1 Kết biểu tinh protein HA trimeric IMAC Protein tái tổ hợp HA sau biểu thuốc tiến hành tách chiết tinh để sử dụng cho thí nghiệm gây đáp ứng miễn dịch chuột Trong nghiên cứu chúng tơi có sử dụng phương pháp tinh protein sắc ký lực Nhằm loại bỏ ảnh hưởng protein không đặc hiệu đến hoạt tính sinh học kháng nguyên đích HA Đây phương pháp hiệu để tinh protein tái tổ hợp liên kết với His-tag Phương pháp dựa xu hướng tự nhiên histidine tạo thành phức hợp với kim loại hóa trị II (ví dụ niken) pH trung tính Sự biểu kháng nguyên HA trimeric kết tinh kiểm tra điện di SDS-PAGE phương pháp Western-blot (Hình 3.15.A,B) Hình 15 Kết biểu hiện, tinh đánh giá hoạt tính protein HA trimeric (A): Kết biểu HA trimeric đánh giá lai miễn dịch WT: Mẫu protein tách chiết từ không chuyển gen sử dụng làm đối chứng âm (B): Kết tinh protein HA trimeric đánh giá điện di SDS-page lai miễn dịch M: marker, RE: Dịch thô, FL: Dịch qua cột, W: Dịch rửa cột, P: Dịch thu protein HA trimeric tinh 3.2.2.2 Kết biểu tinh kháng nguyên HA trimeric-IgMFc IMAC Kết biểu protein HA trimeric IgM-Fc đánh giá Western blot 14 Coomassie-blue (Hình 3.16) cho thấy có vạch băng có kích thước khoảng 100 kDa 33 kDa tương ứng với HA trimeric dung hợp IgM-Fc Hình 3.16 Kết western blot chứng tỏ biểu kháng nguyên HA dung hợp IgM-Fc trimeric dung hợp IgM-Fc sử dụng kháng thể kháng c-myc M: Marker protein 10-170 kDa; 1: Dịch chiết protein chứa kháng nguyên HA dung hợp IgM-Fc; (2): Dịch chiết protein chứa trimeric Kết tinh kiểm tra điện di SDS-PAGE lai miễn dịch (Hình 3.17) cho thấy HA trimeric-IgMFc xuất băng mầu nâu có kích thước khoảng 100 kDa Điều chứng tỏ HApII trimeric-IgMFc tinh bàng phương pháp sắc ký ion cố định kim loại với hiệu suất thu hồi 72,6% độ tinh 89,6% Hình 3.17 Kết tinh HA trimeric-IgMFc sắc ký lực (IMAC) 3.2.2.3 Kết tinh proten HA mono_ELP mITC Kết cho thấy lượng protein giảm nhiều cho nồng độ PEG 2%,và nồng độ PEG 10% protein nhiều bao gồm protein HA protein tạp Tuy nhiên, kết lai miễn dịch lại hai nồng độ PEG 2%,và nồng độ PEG 10% cho thấy gần khơng protein tạp Phân tích hình ảnh phần mềm Image J cho thấy nồng độ 2% PEG 8000 có băng đậm (Hình 3.18) Hình 3.18 Kết tối ưu nồng độ PEG cho tinh protein HA trimeric _ ELP đánh giá SDS-PAGE (A) lai miễn dịch (B) 3.3.2.1 Kết tinh protein HA mono_ELP mITC 15 Kết kiểm tra (Hình 3.19.A) cho thấy giếng số (Dịch chiết thô trước xử lý) xuất nhiều băng protein có băng vạch đậm có kích thước khoảng 108 kDa Ở giếng số khơng xuất băng vạch (dịch chiết không chuyển gen), giếng số đối chứng dương ScFv-Cmyc Điều cho thấy protein HA mono biểu thành công mô thuốc Kết chạy điện di mẫu sau bước tinh gồm dịch chiết thô trước xử lý, dịch khỏi màng sau đưa dịch thô qua màng dịch tinh protein HA tách rửa khỏi màng nước lạnh cho thấy protein tái tổ hợp có gắn ELP giữ lại cách chọn lọc màng protein khác qua khỏi màng thể băng vạch tương ứng với kích thước xác HA mono_ELP, vạch băng protein giống dịch thô dịch qua màng trừ băng tương ứng với kích thước với protein tái tổ hợp gắn ELP Gel nhuộm Coomassie blue cho thấy protein tinh phương pháp mITC có độ tinh nồng độ cao (Hình 3.19.B) Mức độ tinh sạch, kích thước protein đánh giá SDS-PAGE lai miễn dịch (Hình 3.19) A Hình 3.19 Đánh giá kết tinh protein HA mono_ELP SDSPAGE lai miễn dịch (A) 1: Dịch chiết thô chứa protein HA mono_ELP, 2: dịch chiết từ không chuyển gen, 3: đối chứng dương ScFv-Cmyc; M:Marker (B).1,4: Dịch chiết thô chứa protein HA mono_ELP trước xử lý; 2,3: Dịch chiết từ không chuyển gen; 6,7: Dịch rửa màng sau khi đưa dịch thô qua màng 5,8; Dịch tách rửa HA mono_ELP khỏi màng nước lạnh 3.2.2.4 Kết tinh protein HA trimeric_ELP mITC Kết kiểm tra (Hình 3.22 A) cho thấy giếng số 1và (Dịch chiết thô trước xử lý) xuất nhiều băng protein có hai băng vạch đậm có kích thước khoảng 108 kDa 72 kDa Điều cho thấy protein HA trimeric_ELP biểu thành công mô thuốc Kết chạy điện di mẫu sau bước tinh gồm dịch chiết thô trước xử lý, dịch khỏi màng sau đưa dịch thô qua màng dịch tinh protein HA tách rửa khỏi màng nước lạnh cho thấy protein tái tổ hợp có gắn ELP giữ lại cách chọn lọc màng protein khác qua khỏi màng thể băng vạch tương ứng với kích thước xác HA trimeric_ELP khoảng 108 kDa (Hình 3.20.B) vạch băng protein giống dịch thô dịch qua màng trừ băng tương ứng kích thước với protein tái tổ hợp gắn ELP Gel nhuộm Coomassie blue cho thấy protein tinh phương pháp mITC có độ tinh nồng độ cao (Hình 3.20.B) Mức độ tinh sạch, kích thước protein đánh giá SDS-PAGE lai miễn dịch thể (Hình 3.20) 16 B A Hình 3.20 Đánh giá kết tinh protein HA trimeric_ELP SDS-PAGE lai miễn dịch (A) M:Marker; 1, 2: Dịch chiết thô chứa protein HA trimeric_ELP, (B) M: Marker; 1: Dịch chiết thô chứa protein HA trimeric_ELP trước tinh sạch; 2: Dịch đối chứng dương ScFv-Cmyc; 3: Dịch rửa màng sau khi đưa dịch thô qua màng; 4: Dịch tách rửa HA trimeric_ELP khỏi màng nước lạnh 3.2.3 Kết đánh giá khả hình thành oligomer protein HA trimeric phản ứng liên kết ngang Kết lai miễn dịch cho thấy protein HA trimeric HA trimeric_ELP tinh điều kiện biến tính khơng xử lý BS3 cho băng tương ứng kích thước monomer HA trimeric khoảng 72 kDa HA trimeric_ ELP 108 kDa Trong đó, protein HA trimeric HA trimeric_ELP xử lý BS3 hình thành cấu trúc trimer tương ứng với kích thước khoảng 200 kDa 300 kDa (Hình 3.21) Hình 3.21 Kết kiểm tra khả hình thành oligomer protein HA trimeric (A) HA trimeric_ELP (B) phản ứng crosslinking sử dụng BS3 lai miễn dịch +BS3: Protein xử lý với BS3; -BS3: Protein không xử lý với BS3 3.3 Kết tạo phức hệ, khả gây ngưng kết hồng cầu kháng nguyên HA phức hệ HA trimeric:ND 3.3.1 Kết tạo phức hệ kháng nguyên HA trimeric:ND 3.3.1.1 Kết tổng hợp đặc điểm hạt ND Kết phân tích phân bố kích thước ảnh TEM hạt NDs thể Hình 3.24 Kết cho thấy hạt NDs H 2O có kích thước không khác nhiều dao động 5-50nm, trong PBS 1X hạt NDs có xu hướng kết tủa lại với thành hạt có kích thước lên đến 2000 độ đồng (Hình 3.22.A) Ảnh TEM (Hình 3.22.B) chụp NDs H2O cho thấy hạt nano gắn kết với có bề mặt khơng tròn Hình 3.22 Kết tổng hợp đặc điểm hạt NDs (A): Sự phân bố kích thước hạt NDs H2O 1X PBS; (B): Ảnh TEM ND H2O 3.3.1.2 Kết tổng hợp phức hệ HA trimeric:ND 17 Phức hệ HA trimeric-ND tạo thành cách siêu âm hỗn hợp hạt NDs với protein HA trimeric Mẫu hòa H 2O deion PBS1X để đo kích thước hạt zeta potential Kết thể Hình 3.23 Hình 3.23 Kết tổng hợp tính chất vật lý HA trimeric-ND ( A): Kích thước hạt NDs trước sau gắn HA trimeric H 2O deion (B): PBS1X Zeta potential HA trimeric-ND; (C): ND 3.3.1.3 Kết sàng lọc tỷ lệ trộn protein HA trimeric hạt ND Một ứng dụng quan trọng vật liệu nano kim cương cố định protein lên bề mặt giúp tăng độ bền hoạt tính protein Trong nghiên cứu này, protein HA trimeric gắn lên toàn bề mặt hạt ND tạo cấu trúc tương tự hạt virus nhằm tăng độ bền kháng nguyên tinh tăng hoạt tính sinh học kháng ngun Bởi vì, khả kích thích kháng thể vật chủ kháng nguyên phụ thuộc nhiều vào đặc điểm cấu trúc kháng nguyên Chính vậy, việc gắn kháng nguyên HA lên hạt ND giúp tăng khả kích thích đáp ứng miễn dịch vật chủ Bên cạnh đó, hiệu tăng độ bền cho protein tinh ưu điểm ND Tuy nhiên, nồng độ, tỷ lệ hạt ND trộn với kháng nguyên để hiệu bám kháng nguyên hoạt tính sinh học HA cao cần đánh giá Các tỷ lệ trộn protein với hạt ND bao gồm 1:1, 1:3, 1:5, 1:7, 1:9,1:12, 1:15 (g protein : g hạt) thử nghiệm Kết thể Hình 3.24 Hình 3.24 Kết sàng lọc tỷ lệ trộn HA trimeric hạt ND đánh giá lai miễn dịch với kháng thể kháng cmyc (A) phản ứng ngưng kết hồng cầu (B) 5µg HA trimeric tinh trộn ND theo tỷ lệ khác nhau( 1:1, 1:3, 1:5, 1:7, 1:9,1:12, 1:15 , w/w) Sản phẩm rửa nước pha PBS cho lai miễn dịch phản ứng ngưng kết hồng cầu 3.3.2 Đánh giá khả ngưng kết hồng cầu protein tinh HA trimeric-IgMFc 18 Hoạt tính sinh học kháng nguyên tinh HA trimeric-IgMFc trimeric-IgMFc xác định phản ứng ngưng kết hồng cầu Phản ứng dựa tương tác protein HA với thụ thể có mặt tế bào hồng cầu Quá trình tương tác tạo thành mạng lưới, gây ngưng kết hồng cầu Nếu khơng có q trình tương tác protein với thụ thể, hồng cầu không bị ngưng kết, tế bào hồng cầu bị kéo xuống hình thành giọt máu đáy giếng chữ V (Hình 3.25) Hình 3.25 Kết phản ứng gây ngưng kết hồng cầu kháng nguyên trimericIgMFc HA trimeric-IgMFc PBS sử dụng làm đối chứng âm Virus bất hoạt chủng H5N1/Vietnam/2004 sử dụng làm đối chứng dương 3.3.3 Đánh giá khả gây ngưng kết hồng cầu protein tinh HA mono ELP HA trimeric ELP Kết ngây ngưng kết hồng cầu cho thấy protein HA trimeric_ELP HA trimeric có khả gây ngưng kết hồng cầu với µg protein, PBS dịch chiết protein từ không chuyển gen HA mono_ELP tinh khơng có khả gây ngưng kết hồng cầu (Hình 3.26) Hình 3.26 Kết ngưng kết hồng cầu Hemagglutinin HA Đối chứng dương virus bất hoạt H5N1-2004; protein HA trimeric_ELP; protein HA trimeric; protein HA mono_ELP; WT- không chuyển gen; PBS- đối chứng âm 3.4 Đánh giá khả kích thích đáp ứng miễn dịch kháng nguyên HA phức hệ HA trimeric:ND động vật 3.4.1 Kết thí nghiệm gây đáp ứng miễn dịch chuột Trong thí nghiệm chuột, tính sinh miễn dịch kháng nguyên HA trimeric_ELP, HA trimeric HA trimeric trộn hạt ND tỷ lệ 1:12 đánh giá Các lô chuột tiêm da ba lần, lần tiêm cách 14 ngày, khoảng 200 µl Huyết từ máu chuột thu vào ngày thứ sau lần tiêm thứ thứ 3, sử dụng kháng thể 1cho việc tìm kháng thể đặc hiệu ELISA lai miễn dịch Sơ đồ thí nghiệm thể (Hình 3.27) 19 Hình 3.27 Sơ đồ thí nghiệm gây miễn dịch chuột Kết (Hình 3.28 ) cho thấy HA trimeric HA trimeric:ND kích thích sinh kháng thể đặc hiệu với H7 sau lần tiêm thứ thứ thể vạch màu nâu tương đương kích thước H7 khoảng 60 kDa giống đối chứng dương đối chứng âm không xuất băng vạch Hình 3.28 Kết kiểm tra kháng thể IgG đặc hiệu với H7 lai miễn dịch Kết cho thấy đáp ứng kháng thể tìm thấy tất chuột tiêm HA trimeric HA trimeric:ND thể sai khác giá trị ELISA nhóm với nhóm đối chứng tiêm PBS:ND có ý nghĩa thống kê (P