BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ NGUYỄN THỊ THƠM NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH ĐỆM Chuyên ngành : Hóa sinh Mã số : 62720112 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2019 Cơng trình hồn thành tại: TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS ĐẶNG THỊ NGỌC DUNG Phản biện 1: PGS.TS Nguyễn Thị Hà Phản biện 2: PGS.TS Đồng Văn Hệ Phản biện 3: PGS.TS Đồng Văn Quyền Luận án bảo vệ Hội đồng chấm luận án Tiến sĩ Y học cấp trường tổ chức Trường Đại học Y Hà Nội Vào hồi: ngày tháng năm 2019 Luận án tìm thấy tại: - Thư viện Quốc gia - Thư viện Trường Đại học Y Hà Nội ĐẶT VẤN ĐỀ U nguyên bào thần kinh đệm (UNBTKĐ) phát triển từ tế bào thần kinh đệm chưa biệt hóa biệt hóa thấp não, 100% ác tính WHO xếp vào nhóm u ác tính độ IV; tỷ lệ mắc hàng năm khoảng 3,2/100000 dân, chiếm tỷ lệ cao loại u não ác tính nguyên phát (46,6%), bệnh tiến triển nhanh, người mắc UNBTKĐ có thời gian sống trung bình tháng đến năm điều trị tích cực, tỷ lệ sống sau năm thấp khoảng 5,5% Cơ chế sinh bệnh UNBTKĐ biết đến đa phần đột biến gen, gây rối loạn thông tin di truyền tế bào, tế bào tăng sinh, không ngừng phân chia phát sinh khối u, ung thư Sinh bệnh UNBTKĐ có liên quan đến đột biến nhiều gen: gen kháng ung thư gen TP53, PTEN, gen sinh ung thư như: EGFR, FGFR, IDH, MGMT, ATRX, TERT, xóa 1p/19q…, tập trung nghiên cứu đột biến số gen gen TP53, EGFR, FGFR, đột biến gen TP53, EGFR, FGFR ngồi có tỷ lệ đột biến cao chứng minh đóng vai trò quan trọng chế sinh bệnh phân tử định hướng điều trị bệnh u nguyên bào thần kinh đệm Nghiên cứu đột biến gen TP53, EGFR, FGFR… sở cho nghiên cứu điều trị đích bệnh UNBTKĐ, cần thiết với thầy thuốc lâm sàng để đưa tiên lượng hướng điều trị tốt cho người bệnh u nguyên bào thần kinh đệm Tại Việt nam chưa thấy có nghiên cứu vấn đề Xuất phát từ lý trên, thực đề tài, với mục tiêu: Xác định đột biến gen TP53, EGFR, FGFR bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm Phân tích số đặc điểm người bệnh u nguyên bào thần kinh đệm phát thấy đột biến gen Bố cục luận án Luận án có 137 trang, bao gồm: Đặt vấn đề: 03 trang; Chương 1-Tổng quan: 48 trang; Chương 2- Đối tượng phương pháp nghiên cứu: 11 trang; Chương - Kết nghiên cứu: 39 trang; Chương - Bàn luận: 33 trang; Kết luận: 02 trang; Hướng nghiên cứu tiếp: 01 trang Kết luận án trình bày 32 bảng, 41 hình Luận án sử dụng 106 tài liệu tham khảo tiếng Việt, 97 tiếng Anh Chương TỔNG QUAN Tổng thể điều tra mắc UNBTKĐ giới chưa đồng đều, ví dụ Mỹ năm có nghiên cứu báo cáo tình hình mắc bệnh, hay Anh, Phần lan, Đan mạch thường năm báo cáo lần…, song châu lục khác, châu Á hay châu Phi, thống kê bệnh lẻ tẻ Qua báo cáo cho thấy tỷ lệ mắc UNBTKĐ không giống châu lục, nước Châu Âu Mỹ có tỷ lệ mắc cao nước châu Á, Mỹ tỉ lệ mắc hàng năm 3,2/100000 dân, tỷ lệ mắc cao Anh (4,64/100.000 dân/năm), nước Bắc Âu số người mắc bệnh giao động từ 3,3 - 5,1/100.000 nam giới 2,1-3,5/100.000 phụ nữ Tỷ lệ mắc bệnh thấp Hàn quốc 0,66/100000 dân/năm, người da trắng có tỷ lệ mắc bệnh cao người da màu Tại Việt Nam chưa thấy có báo cáo tỷ lệ mắc u nguyên bào thần kinh đệm nước, theo thống kê Lê Xuân Trung Nguyễn Như Bằng năm 1975, u nguyên bào thần kinh đệm chiếm 18% 408 ca mổ u não bệnh viện Việt Đức Nghiên cứu Kiều Đình Hùng (2006), loại u thần kinh đệm ác tính UNBTKĐ chiểm tỷ lệ cao 62,7% Theo Dương Chạm Uyên, Dương Đại Hà (2013), u tế bào thần kinh đệm chiếm 39,2% (trong UNBTKĐ nhiều nhất), cao loại u não thần kinh trung ương Nhìn chung bệnh u nguyên bào thần kinh đệm ngày gia tăng, gặp nhiều tuổi trung niên trở lên, nam mắc bệnh cao nữ, ác tính tỉ lệ sống thường thấp, khoảng 5,5% sống qua năm Có nhiều yếu tố cho gây UNBTKĐ, có đột biến số gen Tp53, EGFR, FGFR chứng minh nhiều nghiên cứu Ngày nay, nhà khoa học nhận thấy TP53 đóng vai trò quan trọng tất dạng ung thư người Đột biến gen TP53 tìm thấy 50% bệnh nhân ung thư toàn giới Ở bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm, đột biến gen TP53 có tỷ lệ cao, khoảng 81% gặp thể thứ phát 27% thể nguyên phát Trong đó, đột biến hay gặp u nguyên bào thần kinh đệm đột biến điểm từ exon đến exon gen TP53, đa số đột biến sai nghĩa; tập trung chủ yếu ba mã hoá codon -175, -248, -273, -282 Các dạng đột biến chứng minh có vai trò quan trọng q trình tiến triển xâm lấn ung thư Theo nghiên cứu Wang cộng sự, đột biến gen TP53 có liên quan đến đáp ứng với thuốc temozolomid (loại thuốc thường sử dụng điều trị u não) [8] Do đó, việc xác định đột biến gen TP53 bệnh u nguyên bào thần kinh đệm có ý nghĩa quan trọng chẩn đoán, tiên lượng điều trị nhằm kéo dài thời gian sống cho người bệnh Khoảng 40% 50% bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm có đột biến gen EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), đột biến gen EGFR có liên quan đến tỷ lệ sống bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm, hay gặp đột biến xóa đoạn từ exon đến exon đột biến điểm exon Tỉ lệ đột biến điểm exon đến gen EGFR người mắc UNBTKĐ khoảng 14,4%, đột biến exon 0,8% ; exon 3,8%, exon 5,3%, exon 1,5% ; exon 15 2,2% ; exon 21 0,8% Các đột biến chứng minh phát sinh khối u thử nghiệm chuột, ghi nhận tăng tính nhạy cảm với số thuốc điều trị Temozolomid,… Đột biến xóa đoạn từ exon đến exon (xóa đoạn dạng EGFRvIII) gen EGFR thường gặp bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm, bệnh nhân mang đột biến dạng có thời gian sống thấp người bệnh khơng có đột biến, lại nhạy với hóa chất điều trị (Temozolomide) Do xác định đột biến gen EGFR cần thiết cho dự đoán thời gian sống bệnh nhân UNBTKĐ, lựa chọn điều trị sau phẫu thuật cho bệnh nhân mắc u nguyên bào thần kinh đệm Gen FGFR (Fibroblast Growth Factor Receptor) mã hóa cho protein có chức thụ thể màng tế bào có nguồn gốc biểu mơ, trung mơ Các protein đóng vai trò quan trọng suốt trình phát triển trưởng thành tế bào Hai đột biến hay gặp gen FGFR1 đột biến điểm xảy exon 12 exon 13 gây thay đổi acid amin vị trí N546K R576W phân tử protein FGFR Các đột biến làm tăng lực thuốc điều trị với thụ thể trở thành đích tác dụng thuốc điều trị ức chế hoạt tính tyrosine kinase bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm Và để điều trị có hiệu quả, việc xác định đột biến gen liên quan đến tính đáp ứng thuốc, đóng vai trò quan trọng định thành cơng phương pháp Như vậy, xét nghiệm gen thiếu bác sỹ lâm sàng triển khai liệu pháp điều trị bệnh nhân Trong khuôn khổ nghiên cứu đề tài, tập trung xác định đột biến exon 7+8 gen TP53, exon đến exon gen EGFR exon 12, 13 gen FGFR, đột biến gặp nhiều exon Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu: 70 bệnh nhân chẩn đoán xác định u nguyên bào thần kinh đệm Bệnh viện Việt Đức dựa đặc điểm lâm sàng kết giải phẫu bệnh 2.2 Phương pháp nghiên cứu: - Cách tiến hành chọn mẫu nghiên cứu + Lập danh sách người bệnh từ khoa Giải Phẫu Bệnh, Bệnh viện Việt Đức (từ hệ thống phần mềm bệnh viện) → Lựa chọn tiêu mô bệnh học mẫu mô đúc paraffin tương ứng với danh sách lập → Soi tiêu mô bệnh học xác định vùng lấy mô, đục lấy mô khoanh vùng khối mô đúc paraffin, tương ứng vùng soi tiêu có hình ảnh tế bào u rõ, tổ chức hoại tử (do Bác sĩ Trưởng khoa Giải Phẫu Bệnh, Bệnh viện Việt Đức thực dựa vào tiêu chuẩn phân loại mô bệnh học u NBTKĐ WHO năm 2007), cho vào ống eppendorf đậy nắp kín → Đánh mã số cho mẫu mô nghiên cứu sau lấy mẫu mô → Lưu trữ bảo quản nhiệt độ phòng + Chọn bệnh án phòng lưu trữ bệnh án theo số mẫu mơ chọn trước đó, lấy thơng tin nghiên cứu khác từ bệnh án → Thu thập thông tin đặc điểm thời gian sống chết bệnh nhân hỏi người thân bệnh nhân qua điện thoại - Kỹ thuật tách DNA: mẫu mô sau lấy, loại bỏ paraffin xylen, sau tách DNA theo phương pháp phenol:chloroform Nồng độ độ tinh DNA tách chiết xác định máy Nano-Drop, mẫu DNA đạt giá trị OD 260nm /OD 280nm từ 1,8 dến 2,0 nồng độ ≥ 25 ng/µl sử dụng để phân tích - Kỹ thuật PCR: PCR sử dụng để nhân exon nghiên cứu gen TP53, EGFR, FGFR với cặp mồi đặc hiệu: Bảng Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu Gen Exo n TP53 7+8 EGF R Trình tự mồi Kích thước sản Hãng phẩm sản base pair xuất (bp) Mồi xuôi 5′- GGTTGGGAGTAGATGGAGCC3′ 495 Mồi ngược 5′-ATGCCCCAATTGCAGGTAAA -3′ IDT Mỹ Mồi xuôi 5′- GG ACC TTG AGG GAT TGT TT-3′ 312 Mồi ngược 5′- CTT CAA GTG GAA TTC TGC CC-3′ IDT Mỹ Mồi xuôi 5′- TTAGGGTTCAACTGGGCGTC- 321 3′ Mồi ngược: 5′AGCCTTCTCCGAGGTGGAAT-3′ IDT Mỹ Mồi xuôi 5′-GCT TTC TGA CGG GAG TCA AC-3′ 296 Mồi ngược 5′-AGA CAG AGC GGG AAC AGG AT-3′ IDT Mỹ Mồi xuôi 5′-CT TCC ATC ACC CCT CAA GA3′ 261 Mồi ngược 5′-CTC AGC AGC CGA GAA CAA-3′ IDT Mỹ Bộ 10 Các mồi exon 2,3,4,5,6,7,8,13,16,23 kit exon MRC Hà Lan 12 Mồi xuôi 5´-GCAGATGCATCCAGATGGTA-3 ´ 617 Mồi ngược 5´-TCTCCATTCATGGCCACATA3´ IDT Mỹ 13 Mồi xuôi TGTGAAGAAGAACAAGCCTGC-3´ Mồi ngược AGAACTCCGTGAGATCGTGC-3´ IDT Mỹ FGF R 5´5´- 527 - Nguồn gốc mồi: cặp mồi nhân exon 2, 3, 7, gen EGFR; exon 12, 13 gen FGFR Trung tâm Gen - Protein Trường Đại học Y Hà Nội thiết kế, mồi nhân exon 7+8 gen TP53 dựa theo công thức mồi nghiên cứu Roger H Frankel (1992), mồi nhân gen dạng EGFRvIII hãng MRC Hà Lan thiết kế + Thành phần phản ứng PCR (thể tích 10 μl) gồm: μl Taq polymerase; 0,5μl mồi xuôi; 0,5μl mồi ngược; 1,0 μl DNA μl H2O + Chu trình nhiệt phản ứng PCR: 94 oC/5 phút, 35 chu kỳ [95oC/30 giây, 55oC/30 giây, 72oC/5 phút], 72oC/5 phút Bảo quản mẫu 15oC - Kỹ thuật giải trình tự gen Sau nhân bản, sản phẩm PCR tinh sạch, sau giải trình tự phương pháp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster city, USA) Trình tự gen đối chiếu so sánh với trình tự gen EGFR GeneBank xác định đột biến điểm exon gen nghiên cứu phần mềm CLC Main Workbench 6.0.1 - Kỹ thuật MLPA: sử dụng để xác định xoá đoạn gen dạng EGFRvIII, dùng cặp mồi đặc hiệu để nhân exon cần nghiên cứu, sau sử dụng điện di mao quản để xác định số exon Phân tích kết cơng cụ Coffalyser chun biệt (được cung cấp hãng MRC - Hà lan): dựa vào số lượng exon nhân được, để xác định có xóa đoạn EGFRvIII, cần tính trung bình cộng số lượng exon 2+3+4+5+6+7 chia cho trung bình cộng số lượng exon 1+8+13+16+23 gen EGFR (gọi tỷ lệ EGFRvIII) Tỷ lệ EGFRvIII 0,8 coi chứa biến thể xóa đoạn EGFRvIII 2.3 Phương pháp xử lý số liệu: * Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê y học dựa vào phần mềm SPSS 19.0 Sử dụng Test T-student: bảng có n > 5; Test Fisher Exact: bảng có n ≤ 2.4 Đạo đức nghiên cứu: Đề tài thông qua Hội đồng Đạo đức Trường Đại học Y Hà Nội, theo định số 187/HĐĐĐĐHYHN tháng 2/2016 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 10 3.1 Kết xác định đột biến gen TP53, EGFR, FGFR * Kết đột biến vị trí p.R282W exon gen TP53 A) B) Hình Hình ảnh kết giải trình tự đoạn exon gen TP53 có chứa đột biến điểm p.R282W A) Mẫu đại diện có đột biến bệnh nhân UNBTKĐ mã số GB31 B) Mẫu đại diện khơng có đột biến bệnh nhân UNBTKĐ mã số GB5 Kết giải trình tự rõ nét, đỉnh tín hiệu rõ ràng, khơng bị nhiễu, tín hiệu thấp Tại vị trí 846 gen đỉnh C xuất đỉnh T, chứng tỏ có đột biến dị hợp tử thay nucleotid 846C>T dẫn đến vị trí codon thứ 282 ba CGG mã hóa cho Arginine chuyển thành ba TGG mã hóa cho Tryptophan, ký hiệu p.R282W * Kết đột biến vị trí p.G42D exon gen EGFR A) 15 + Kết phân tích số exon từ đến gen EGFR A) B) Hình Kết phân tích xác định đột biến xóa đoạn từ exon đến exon gen EGFR A) Mẫu đại diện có đột biến bệnh nhân UNBTKĐ mã số GB49 B) Mẫu đại diện đột biến bệnh nhân UNBTKĐ mã số GB43 Các cột màu xanh biểu thị số exon Ở mẫu bệnh GB2, GB49 có trung bình cộng số exon 2+3+4+5+6+7 gen EGFR nhỏ 0,8 so với trung bình cộng số exon 1+8+13+16+23 gen EGFR, chúng tỏ có xóa đoạn gen mẫu bệnh GB2, GB49 70 mẫu bệnh UNBTKĐ sau phân tích, kết có mẫu phát có đột biến xóa đoạn gen (tỉ lệ 8,6%), 5/6 mẫu có xóa đoạn EGFRvIII (chiếm 7,2%), có 1/6 mẫu có xóa đoạn từ exon đến exon (chiếm 1,4%) 16 * Kết đột biến vị trí p.N546K exon 12 gen FGFR A) B) Hình Hình ảnh kết giải trình tự đoạn exon 12 gen FGFR chứa đột biến điểm p.N546K A) Mẫu đại diện có đột biến bệnh nhân UNBTKĐ mã số GB48 B) Mẫu đại diện khơng có đột biến bệnh nhân UNBTKĐ mã số GB49 Đột biến vị trí g.56504C>T bên tín hiệu đỉnh C, có xuất tín hiệu đỉnh A, đột biến làm thay đổi mã ba AAA mã hóa cho acid amin Asparasine, thành AAC mã hóa cho acid amin Lysine phân tử protein vị trí p.N546K Mẫu GB49 khơng phát thấy đột biến dạng * Kết đột biến vị trí p.R576W exon 13 gen FGFR A) B) Hình Hình ảnh kết giải trình tự đoạn exon 13 gen FGFR chứa đột biến điểm p.R576W 17 A) Mẫu đại diện có đột biến bệnh nhân UNBTKĐ mã số GB52 B) Mẫu đại diện khơng có đột biến bệnh nhân UNBTKĐ mã số GB48 Tại vị trí g.57837C>T exon 13 gen FGFR, tín hiệu đỉnh C, có xuất tín hiệu đỉnh T chứng tỏ có đột biến nucleotid C thành T, làm thay đổi mã ba CGG mã hóa cho acid amin Arginine, thành TGG mã hóa cho Triptophan, codon 576 phân tử protein, kí hiệu p.R576W Giải trình tự 70 mẫu xác định đột biến điểm exon 12 exon 13 gen FGFR, kết 5/70 (7,1%) mẫu phát thấy đột biến gen FGFR, dạng đột biến chiếm cao R576W exon 13 (60%), 01 đột biến dạng A575V exon 13 (20%), 01 đột biến dạng N546K exon 12 (20%) * Tổng hợp đột biến gen nghiên cứu: TP53, EGFR, FGFR Hình Tỷ lệ đột biến gen nghiên cứu Phát thấy 7,1% đột biến exon 12 exon 13 gen FGFR; 38,6% đột biến exon từ đến gen EGFR; 2,9% đột biến exon gen TP53 4.3 Một số đặc điểm người bệnh u nguyên bào thần kinh đệm phát thấy đột biến gen Bảng Phân bố giới người bệnh UNBTKĐ phát thấy đột biến gen Nam Nữ Nam Tình trạng gen Đột biến n % 20,0 80,0 22 81,5 Không đột biến n % 44 67,7 21 32,3 23 53,5 Nữ 18,5 20 46,5 Nam Nữ 0,0 100,0 45 23 66,2 33,8 Loại gen Giới FGF R EGF R TP53 p 0,05 0,02 0,12 Giới nữ phát thấy đột biến gen FGFR cao nam giới, khác biệt có ý nghĩa thống kê, (p = 0,05) Giới nam phát thấy 18 đột biến gen EGFR cao nữ giới, (p < 0,05) Cả trường hợp đột biến exon gen TP53 nữ giới, chưa thấy nam giới Bảng Tỷ lệ thể bệnh nguyên phát thứ phát Thể bệnh n % Nguyên phát 64 91,4 Thứ phát 8,6 Tổng 70 100 91,4 % u nguyên bào thần kinh đệm thuộc thể nguyên phát 8,6% thứ phát Khi khảo sát thông tin thời gian sống chết bệnh nhân, có 45 người bệnh có đầy đủ thơng tin này, từ bảng 6, tổng số bệnh nhân phân tích 45 người Bảng Thời gian trung bình từ phát bệnh đến phẫu thuật (A); thời gian sống trung bình sau phẫu thuật (B); thời gian sống trung bình từ phát bệnh đến chết (C) thể nguyên phát thể thứ phát Min Max Thời gian Thể bệnh n ( ± SD) Phát bệnh trước phẫu thuật (A) Nguyên phát Thứ phát 39 3,0 ± 3,8 - 16 Chung 45 13,2 ± 14,1 4,3 ± 6,9 - 41 - 41 Sống sau phẫu thuật (B) Nguyên phát Thứ phát Chung Nguyên phát Thứ phát 39 9,7 ± 8,4 45 39 13,2 ± 5,8 10,1 ± 8,2 12,6 ± 8,6 - 35 Chung 45 26,5 ± 11,5 14,5 ± 10,1 17 - 49 - 49 Phát bệnh đến chết (C) - 33 - p 0,00 0,14 - 19 - 33 0,00 19 Thể nguyên phát so với thứ phát: thời gian trung bình từ phát bệnh đến phẫu thuật (A) ngắn hơn, p < 0,001; thời gian sống trung bình sau phẫu thuật (B) ngắn hơn, nhiên chưa có ý nghĩa thống kê, p > 0,05; thời gian sống trung bình từ phát bệnh đến chết (C) ngắn hơn, p < 0,001 Bảng Phân bố thời gian sống sau phẫu thuật thể nguyên phát thể thứ phát Thời gian (tháng) ≤6 > – 12 > 12 - 24 > 24 - 36 > 36 Tổng P Nguyên phát n % Thứ phát n % Chung n % 16 10 39 0,016 1 0 17 11 13 45 37,8 24,4 28,9 8,9 0,0 100,0 41,0 25,6 23,1 10,3 0,0 100,0 16,7 16,7 66,6 0,0 0,0 100,0 Thể thứ phát có 16,7% trường hợp chết trước tháng sau phẫu thuật rõ rệt so với thể nguyên phát có tới 41% chết trước tháng sau phẫu thuật Có 66,6% thể thứ phát sống từ 12 đến 24 tháng sau phẫu thuật nhiều rõ rệt so với 23,1% thể nguyên phát (p = 0,016) Bảng Phân bố thời gian sống người bệnh sau phẫu thuật phát thấy đột biến gen, có điều trị xạ trị, hóa chất Thời gian (tháng) Đột biến gen Có điều trị Khơng điều trị Chung n n n % % % 20 ≤6 0,0 69,2 42,9 > - 12 50,0 23,1 33,3 > 12 - 24 37,5 0,0 14,3 > 24 – 36 12,5 7,7 9,5 > 36 0,0 0,0 0,0 Tổng 100,0 13 100,0 21 100,0 p 0,001 Người bệnh mang đột biến gen FGFR, gen EGFR, gen TP53 có điều trị so với người mang đột biến không điều trị: thời gian sống sau phẫu thuật dài hơn, (p = 0,001) Chết trước tháng hơn: 0% so với 69,2% (p = 0,001); sống kéo dài từ đến 12 tháng nhiều hơn: 50% so với 23,1% (p = 0,001) Chương BÀN LUẬN 4.1 Tình trạng đột biến gen TP53, EGFR, FGFR 4.1.1 Đột biến gen TP53 Nghiên cứu phát thấy đột biến điểm R282W exon gen TP53, giống kiểu đột biến mà nghiên cứu Shoji Shiraishi M.D công bố; kiểu đột biến khác R273C, R267W nghiên cứu Shoji Shiraishi M.D, kiểu đột biến C275Y nghiên cứu Roger H Frankel, chưa phát được, lại xác định kiểu đột biến R306X Điều đột biến exon gen bệnh UNBTKĐ khơng hồn tồn giống người bệnh sống vùng địa lý, kinh tế, xã hội khác Hoặc số mẫu nghiên cứu chưa nhiều, nên chưa xác định đầy đủ kiểu đột biến nghiên cứu khác công bố Số lượng đột biến 2/70 (2,9%), so với nghiên cứu Shoji Shiraishi M.D 21 công bố năm 2002, với đột biến chung gen TP53 bệnh UNBTKĐ 31%, 7,3% đột biến exon 8, có kiểu đột biến R273C, R267W, R282W; nghiên cứu Roger H Frankel (1992), báo cáo kết có 15/37 (40,5%) trường hợp UNBTKĐ xuất đột biến gen TP53, 5,4% có đột biến exon 8, trường hợp đột biến exon có kiểu đột biến p.C275Y Đột biến gen TP53 UNBTKĐ thường xảy người UNBTKĐ thứ phát, gặp UNBTKĐ nguyên phát, kết đột biến gen TP53 người bệnh UNBTKĐ nghiên cứu chúng tơi với cơng bố giới, chủ yếu người bệnh UNBTKĐ nghiên cứu nguyên phát, tỷ lệ đột biến gặp phù hợp, nhiên trường hợp có đột biến gen TP53 thuộc nhóm ngun phát, số UNBTKĐ thứ phát gặp 8,6% nên chưa thấy có đột biến; tượng tự kết luận Ohgaki H cộng sự: xác định tần số biến đổi gen, hiệu điều trị với thời gian sống bệnh nhân UNBTKĐ: 715 người mắc UNBTKĐ chẩn đoán, đột biến TP53 UNBTKĐ thứ phát chiếm 57% codon 248 273, UNBTKĐ nguyên phát, đột biến phân phối đồng hơn, với tỷ lệ 4.1.2 Đột biến từ exon đến exon gen EGFR Bằng kỹ thuật giải trình tự gen, 10 dạng đột biến điểm gen EGFR người bệnh UNBTKĐ phát bao gồm đột biến sai nghĩa (G42D, L62I, G87D, K129N, P272S, T274M, A289T, K284N); đột biến không làm thay đổi acid amin phân tử protein (D262D) đột biến vơ nghĩa (K293X) Trong đó, bốn dạng đột biến điểm chiếm tỷ lệ cao K284N (exon 7), K129N (exon 3), G42D (exon 2), P272S (exon 7) A289T (exon 7) Đột biến A289T công bố nghiên cứu Jeffrey C Lee cộng (2006) với tần suất đột biến cao kết hợp với nhiều kiểu đột biến xảy codon 289 A289V; A289D Các dạng đột biến lại phát nghiên cứu đột biến Vị 22 trí đột biến thay đổi có khác biệt so với nghiên cứu Jeffrey C Lee (p.G42D so với p.D46N p.L62I so với p.G63R) Sự khác biệt chủng tộc, màu da hay vị trí địa lý nguyên nhân gây nên sai khác vị trí đột biến kiểu đột biến exon 2, exon exon gen EGFR bệnh u nguyên bào thần kinh đệm, đột biến thường mang tính cá thể, khác vị trí đột biến gen cá thể ghi nhận qua nhiều nghiên cứu, tính đáp ứng cá thể với tác nhân gây bệnh khác nhau, nên bệnh đột biến gen thường thấy đột biến nhiều gen nhiều vị trí khác gen Gen EGFR, gen có chức chung mã hóa thụ thể bề mặt tế bào, nhận tín hiệu để hoạt hóa hoạt động tế bào, tổn thương tương ứng vùng khác gây sai lạc nhóm tế bào đặc hiệu phận thể: ung thư phổi hay ung thư vú đột biến hay gặp vùng mã hóa protein EGFR vùng nội bào, UNBTKĐ đột biến hay xảy vùng mã hóa cho protein EGFR ngoại bào Các vị trí đột biến L858R exon 21 gen EGFR hay gặp ung thư phổi, ung thư vú, ung thư vú gặp kiểu đột biến khác G719S, G719A, G719C, S768I, L861Q… Hoặc người bệnh UNBTKĐ, exon gen EGFR thấy nhiều đột biến nhiều vị trí khác nhau, T263P, A289V, A289D, A289T, đột biến quan sát thấy có tương quan chặt chẽ với nhân lên mức protein EGFR, qua xác định nhuộm hố mơ miễn dịch Ngồi ra, kỹ thuật MLPA, nghiên cứu xác định dạng đột biến xóa đoạn từ exon đến exon gen EGFR bệnh nhân UNBTKĐ Việt Nam, kết nghiên cứu tương đồng với báo cáo nghiên cứu cơng bố, đột biến xóa đoạn hay gặp với gen EGFR xóa từ exon đến exon 7, Cùng sử dụng phương pháp MLPA để xác định xóa đoạn gen EGFR nhau, kết nghiên cứu chúng tơi có tỉ lệ xóa đoạn thấp so với nghiên cứu Judith Jeuken: 16,3% (17/104) 23 trường hợp mắc UNBTKĐ có xóa đoạn gen dạng EGFRvIII, số mẫu nghiên cứu chúng tơi hơn, nên có kết đột biến xóa đoạn thấp Như vậy, tỷ lệ đột biến gen EGFR chung 38,6%; tính riêng rẽ (vì số mẫu mang đột biến kép, đột biến exon khác nhau) đột biến exon gặp nhiều (20,0%); thứ hai đột biến điểm exon (10,0%), đột biến xóa đoạn gen (8,6%), thấp đột biến điểm exon (5,7%), kết phù hợp cơng bố Jeffrey C Lee: gen EGFR có đột biến điểm exon cao Kết tỷ lệ đột biến gen EGFR nghiên cứu thấp so với kết nghiên cứu Naoki Shinojima, tỉ lệ đột biến EGFR bệnh nhân UNBTKĐ 46% tỉ lệ đột biến EGFRvIII 45%, lý giải số mẫu nghiên cứu chưa đủ lớn, đặc điểm đột biến địa dư khác khác lượng kiểu đột biến 4.1.3 Đột biến gen FGFR Nghiên cứu bước đầu xác định hai loại đột biến điểm N546K tương ứng vùng mã hóa exon 12 R576W tương ứng vùng mã hóa exon 13 gen FGFR với tỷ lệ 7,1%, chứng tỏ bệnh nhân mắc UNBTKĐ Việt Nam phát thấy đột biến gen FGFR tương đồng với nghiên cứu giới Đột biến gen FGFR thường gặp số bệnh ung thư như: ung thư vú, đại tràng, phổi …và u nguyên bào thần kinh đệm Trong số điểm đột biến gen FGFR1 tìm thấy u nguyên bào thần kinh đệm N546K, N544K, R576W, R574W; Việc tìm đột biến tương đồng gen FGFR bệnh nhân UNBTKĐ Việt Nam, với đột biến bệnh nhân UNBTKĐ giới thuận lợi lớn cho việc áp dụng thành công nghiên cứu điều trị bệnh UNBTKĐ nước giới với bệnh nhân mắc u nguyên bào thần kinh đệm Việt Nam; xác định đột biến gen giúp bác sĩ lâm sàng định hướng tốt điều trị tiên lượng quản lý bệnh nhân Tuy tỉ lệ 24 phát thấp, số mẫu nghiên cứu chủng tộc khác nhau, nên tỷ lệ đột biến khác nhau, sở để tiếp tục nghiên cứu tình trạng đột biến gen FGFR bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm, từ nghiên cứu thử nghiệm tính đáp ứng với thuốc điều trị có đột biến gen FGFR, mục đích cuối kéo dài thời gian sống cho người bệnh Tóm lại, phương pháp giải trình tự gen phương pháp MLPA, nghiên cứu bước đầu xác định số đột biến gen FGFR, EGFR TP53 người mắc u nguyên bào thần kinh đệm Việt Nam, đột biến gặp nhiều gen EGFR với tỷ lệ 38,6%: (chủ yếu đột biến điểm, đột biến xóa đoạn chiếm 8,6%), thứ hai đột biến gen FGFR với tỷ lệ 7,1%; thấp đột biến gen TP53 với 2,9% 4.2 Một số đặc điểm người bệnh u nguyên bào thần kinh đệm phát thấy đột biến gen Kết nghiên cứu chủ yếu gặp UNBTKĐ nguyên phát (91,4 %), gặp trường hợp u thứ phát (8,6%) tổng số 70 bệnh nhân, kết phù hợp với phân loại WHO năm 2016 u nguyên bào thần kinh đệm nguyên phát chiếm 90% tổng số u nguyên bào thần kinh đệm, u nguyên bào thần kinh đệm thứ phát chiếm 10% Trung bình tuổi mắc thể thứ phát thấp thể nguyên phát, tương đương với công bố WHO, người mắc UNBTKĐ thứ phát hay gặp lứa tuổi trẻ hơn, khác biệt tuổi hai thể chưa có ý nghĩa thống kê (p > 0,05), số lượng thể thứ phát nghiên cứu Khi nghiên cứu phân bố thời gian sống chết bệnh nhân, khảo sát 45 bệnh nhân có đủ thơng tin nghiên cứu, kết cho thấy có khác biệt rõ thời gian tiến triển bệnh, thời gian sống từ mắc bệnh đến chết hai thể bệnh nguyên phát thứ phát Thời gian trung bình từ phát mắc bệnh đến phẫu thuật thể bệnh nguyên phát 3,0 ± 3,8 tháng, ngắn có ý nghĩa thống kê so với thể bệnh thứ phát 13,2 ± 14,1 25 tháng (với p = 0,000); tương đồng với kết công bố WHO năm 2016, thời gian tiến triển lâm sàng bệnh UNBTKĐ thể nguyên phát ngắn thể thứ phát, nhiên kết với thể nguyên phát thấp (3,0 ± 3,8 tháng so với tháng), thể thứ phát thấp (13,2 ± 14,1 tháng so với 15 tháng) Sự phân bố thời gian sống sau phẫu thuật cho thấy: thể thứ phát có 16,7% trường hợp chết khoảng tháng sau phẫu thuật rõ rệt so với thể nguyên phát có tới 41% chết thời gian sau phẫu thuật; có 66,6% thể thứ phát sống từ 12 đến 24 tháng sau phẫu thuật nhiều rõ rệt so với 23,1% thể nguyên phát (p = 0,016) Điều chứng tỏ kết điều trị bệnh UNBTKĐ nước ta có nhiều tiến bộ, cập nhật phương pháp điều trị mới, ý thức điều trị người bệnh tốt hơn, nên thời gian sống kéo dài nhiều Qua phân bố thời gian sống người có đột biến gen điều trị nghiên cứu cho thấy, tác động điều trị bổ trợ sau phẫu thuật xạ trị hay hóa chất hai đáng kể với người mắc UNBTKĐ, thời gian sống kéo dài tỷ lệ người sống khoảng thời gian tháng đến 12 tháng cao hơn, số người bệnh sống năm sau phẫu thuật hạn chế, thời gian sống sót tổng thể tính từ mắc bệnh đến chết người UNBTKĐ kéo dài tỷ lệ sống kéo dài cao Khơng có người bệnh có đột biến gen điều trị xạ trị hóa chất chết trước tháng sau phẫu thuật Mặc dù kết điều trị thời gian sống sau điều trị người bệnh UNBTKĐ phụ thuộc vào nhiều yếu tố vị trí khối u nông sâu, sức đề kháng bệnh theo lứa tuổi trẻ hay già… Nicola Montano công bố: bệnh nhân UNBTKĐ mang đột biến dạng EGFRvIII phẫu thuật sau xạ trị kèm dùng thuốc Temozolomid (TMZ) bổ trợ có kết tỷ lệ sống sót dài đáng kể so với người không mang đột biến này, nghiên cứu phần chứng tỏ người mang đột biến gen UNBTKĐ có đáp ứng tốt với xạ trị 26 hóa chất điều trị, với kết người phát đột biến gen điều trị có thời gian sống kéo dài so với người thấy đột biến gen mà không điều trị, có ý nghĩa thống kê Kết nghiên cứu đột biến gen TP53, EGFR, FGFR bệnh UNBTKĐ chúng tơi giúp ích cho người bệnh việc áp dụng phương pháp điều trị thành công giới vào điều trị cho người bệnh Việt Nam, giúp bác sỹ lâm sàng lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp tiên lượng cho người bệnh, ngồi có ý nghĩa sở cho nghiên cứu đột biến gen khác người UNBTKĐ đột biến gen IDH, MGMT mà chúng tơi chưa có điều kiện để nghiên cứu, nghiên cứu điều trị đích có triển vọng KẾT LUẬN Nghiên cứu tiến hành 70 người bệnh u nguyên bào thần kinh đệm sau phẫu thuật bệnh viện Việt Đức, sử dụng phương pháp giải trình tự gen xác định đột biến điểm phương pháp nhân gen đầu dò đa mồi xác định đột biến xố đoạn gen mẫu mô sau phẫu thuật người mắc UNBTKĐ, nghiên cứu xác định tình trạng đột biến gen TP53, EGFR, FGFR 70 bệnh nhân, từ kết thu chúng tơi có số kết luận: Đột biến gen TP53, EGFR, FGFR người mắc u nguyên bào thần kinh đệm Tính tổng số 70 bệnh nhân, nghiên cứu phát so với nghiên cứu công bố giới: + Đột biến exon gen TP53 thấp (2,9%): với kiểu đột biến p.R282W giống công bố, kiểu đột biến p.R306X phát + Đột biến exon đến exon gen EGFR thấp (38,6%): đột biến điểm chiếm 32,9%; đột biến xoá đoạn gen chiếm 8,6% Kiểu đột biến p.A289T giống cơng bố, lại kiểu đột biến 27 p.G42D, p.L62I, p.G87D, p.K129N, p.D262D, p.P272S, p.T274M, p.K284N, p.K293X phát + Đột biến exon 12 exon 13 gen FGFR thấp (7,1%); kiểu đột biến p.N546K, p.R576W giống với công bố, kiểu p.A575V phát Đặc điểm người bệnh phát thấy đột biến gen + Tính tổng số mẫu 70 bệnh nhân: phát 91,4% UNBTKĐ nguyên phát; 8,6% u thứ phát; + Tính tổng số 45 bệnh nhân có đủ thông tin thời gian sống chết điều trị: Thời gian trung bình từ phát mắc bệnh đến phẫu thuật thể bệnh nguyên phát ngắn so với thể bệnh thứ phát (3,0 ± 3,8 tháng so với 13,2 ± 14,1 tháng, p = 0,000) Thời gian sống trung bình từ phát bệnh đến chết thể bệnh thứ phát dài so với thể bệnh nguyên phát (là 26,5 ± 11,5 tháng so với 12,6 ± 8,6 tháng, p = 0,001) Có 16,7% thể thứ phát chết trước tháng sau phẫu thuật đáng kể so với 41% thể nguyên phát; 66,6% thể thứ phát sống từ 12 đến 24 tháng sau phẫu thuật nhiều rõ rệt so với 23,1% thể nguyên phát, (p = 0,016) Người bệnh phát mang đột biến gen FGFR, gen EGFR, gen TP53 sau phẫu thuật điều trị xạ trị hố chất hai, có thời gian sống dài người bệnh mang đột biến không điều trị, (p = 0,001) Người UNBTKĐ phát thấy đột biến điều trị so với thấy đột biến không điều trị: Có ý nghĩa thống kê, (p = 0,001) + Chết trước tháng : 0% so với 69,2% + Sống kéo dài từ đến 12 tháng : 50% so với 23,1% + Sống từ 12 đến 24 tháng : 37,5% so với 0% - Chưa tìm thấy mối liên quan gen đột biến người UNBTKĐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP 28 Nghiên cứu tiến cứu dọc bệnh nhân UNBTK từ bắt đầu vào viện, phẫu thuật, xác định đột biến gen, điều trị sau phẫu thuật, tư vấn điều trị, đánh giá hiệu điều trị phương pháp: xạ trị, hố trị Telomozid tồn quốc DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Thị Thơm, Trần Quốc Đạt, Trần Huy Thịnh, Đặng Thị Ngọc Dung, Trần Vân Khánh, Tạ Thành Văn, Kiều Đình Hùng (2017) Xác định đột biến gen EGFR bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm, Tạp chí Y học Việt Nam, Số đặc biệt tháng năm 2017, tr 131 - 135 Nguyễn Thị Thơm, Trần Quốc Đạt, Trần Huy Thịnh, Đặng Thị Ngọc Dung, Trần Vân Khánh, Tạ Thành Văn, Kiều Đình Hùng (2017) Xác định đột biến exon 12 exon 13 gen FGFR bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm, Tạp chí Y học Việt Nam, Số tháng 11 năm 2017, tr 178-181 Nguyễn Thị Thơm, Trần Quốc Đạt, Trần Huy Thịnh, Đặng Thị Ngọc Dung, Hà Xuân Hợp, Trần Vân Khánh, Tạ Thành Văn, Kiều Đình Hùng (2018) Xác định đột biến exon gen EGFR bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm, Tạp chí Y học Việt Nam, Số tháng năm 2018, tr 79-82 Kiều Đình Hùng, Nguyễn Thị Thơm, Trần Quốc Đạt, Đặng Thị Ngọc Dung, Trần Huy Thịnh, Trần Vân Khánh, Tạ Thành Văn (2019) Mutation analysis of EGFR FGFR gen in glioblastoma patients in Viet Nam, Tạp chí Y dược học Quân sự, Số tháng năm 2019, 46 – 51 Nguyễn Thị Thơm, Trần Quốc Đạt, Trần Vân Khánh, Tạ Thành Văn, Kiều Đình Hùng, Phùng Thị Phương Chiêm, Đặng Thị Ngọc Dung (2019) Xác định đột biến xoá đoạn gen EGFR bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm, Tạp chí Y học Việt Nam, Số tháng 04 năm 2019, tr 15-18 ... liên quan gen đột biến người UNBTKĐ HƯỚNG NGHIÊN C U TIẾP 28 Nghiên c u tiến c u dọc bệnh nhân UNBTK từ bắt đ u vào viện, ph u thuật, xác định đột biến gen, đi u trị sau ph u thuật, tư vấn đi u trị,... hợp u thứ phát (8,6%) tổng số 70 bệnh nhân, kết phù hợp với phân loại WHO năm 2016 u nguyên bào thần kinh đệm nguyên phát chiếm 90% tổng số u nguyên bào thần kinh đệm, u nguyên bào thần kinh đệm. .. giới Ở bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm, đột biến gen TP53 có tỷ lệ cao, khoảng 81% gặp thể thứ phát 27% thể nguyên phát Trong đó, đột biến hay gặp u nguyên bào thần kinh đệm đột biến điểm