HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LÊ QUỐC VIỆT NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KIT CHẨN ĐOÁN NHANH STREPTOCOCCUS SUIS TYPE Ở LỢN LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LÊ QUỐC VIỆT NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KIT CHẨN ĐOÁN NHANH STREPTOCOCCUS SUIS TYPE Ở LỢN Chuyên ngành: Mã số: Người hướng dẫn khoa học NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận án cám ơn, thơng tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày… tháng… năm 2019 Tác giả luận án Lê Quốc Việt ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hồn thành luận án, tơi nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy cô giáo, giúp đỡ, động viên bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận án, cho phép tơi bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc PGS.TS Đinh Thị Bích Lân PGS.TS Bùi Trần Anh Đào tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam Viện Công nghệ Sinh học – Đại học Huế tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán viên chức Viện Công nghệ Sinh học – Đại học Huế giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt trình thực đề tài Đặc biệt, tơi xin chân thành cám ơn tác giả Hồng Thị Thùy Nhung, Đinh Thị Bích Lân, Đặng Thanh Long, Huỳnh Văn Chương, Lê Công Thịnh, Phùng Thăng Long, Nguyễn Xuân Hòa, Lê Đức Thạo Bùi Trần Anh Đào cho phép sử dụng kết nghiên cứu công bố vào phần nội dung luận án Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận án./ Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Nghiên cứu sinh Lê Quốc Việt iii MỤC LỤC Lời cam đoan ii Lời cảm ơn iii Mục lục iv Danh mục chữ viết tắt vii Danh mục bảng viii Danh mục hình ix Trích yếu luận án xi Thesis abstract xiii Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu đề tài 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Những đóng góp đề tài 1.5 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 1.5.1 Ý nghĩa khoa học 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu 2.1.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis nước giới 2.2 Một số đặc tính liên cầu khuẩn lợn 2.2.1 Đặc điểm hình thái 2.2.2 Đặc tính ni cấy sinh hóa 2.2.3 Sức đề kháng 10 2.2.4 Cấu trúc kháng nguyên 11 2.2.5 Khả gây bệnh 13 2.3 Triệu chứng bệnh tích bệnh vi khuẩn S Suis gây 14 2.3.1 Triệu chứng bệnh tích vi khuẩn S suis gây lợn 14 2.3.2 Triệu chứng bệnh tích vi khuẩn S suis gây người 16 2.4 Chẩn đoán 17 iv 2.4.1 Chẩn đoán phương pháp PCR 18 2.4.2 Chẩn đoán phương pháp ELISA 19 2.5 Điều trị 19 2.5.1 Điều trị thuốc kháng sinh 19 2.5.2 Điều trị bệnh huyết 20 2.6 Giới thiệu hạt nano vàng kỹ thuật sắc ký miễn dịch 20 2.6.1 Tổng quan hạt nano vàng 20 2.6.2 Kỹ thuật sắc ký miễn dịch 20 Phần Vật liệu phương pháp nghiên cứu 26 3.1 Vật liệu nghiên cứu 26 3.2 Nội dung nghiên cứu 26 3.2.1 Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên Streptococcus suis type 26 3.2.2 Nghiên cứu chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng Streptococcus suis type 27 3.2.3 Nghiên cứu chế tạo conjugate-kháng thể kháng Streptococcus suistype .27 3.2.4 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu KIT chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 27 3.3 Phương pháp nghiên cứu 27 3.3.1 Phương pháp sản xuất kháng nguyên Streptococcus suis type .27 3.3.2 Phương pháp chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng S suis type 33 3.3.3 Phương pháp nghiên cứu chế tạo conjugate - kháng thể kháng Streptococcus suis type 37 3.3.4 Phương pháp đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu KIT chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 38 3.3.5 Phương pháp phân tích số liệu 40 Phần Kết thảo luận 41 4.1 Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên Streptococcus suis type 41 4.1.1 Tình hình nhiễm Streptococcus suis type lợn giết mổ 41 4.1.2 Phân lập xác định đặc tính sinh học phân tử vi khuẩn S suis type 44 4.1.3 Chế tạo kháng nguyên thô từ vi khuẩn S suis type 55 4.2 Kết nghiên cứu sản xuất kháng thể đa dòng kháng S Suis type 57 4.2.1 Kết xác định tính sinh miễn dịch kháng nguyên 57 v 4.2.2 Kết xác định lượng kháng nguyên thích hợp cho khả đáp ứng miễn dịch chuột SA 60 4.2.3 Kết xác định chất bổ trợ thích hợp cho khả sinh miễn dịch chuột SA 63 4.2.4 Chế tạo, tách chiết định lượng kháng thể IgG kháng S suis type .66 4.2.5 Xác định hiệu giá kháng thể sau tinh chế 71 4.3 Kết nghiên cứu chế tạo Conjugate – kháng thể kháng S Suis type 72 4.3.1 Xác định pH dung dịch gold colloid thích hợp để gắn kháng thể với hạt vàng nano 72 4.3.2 Xác định nồng độ kháng thể kháng S suis type tối ưu để gắn với hạt vàng nano 74 4.3.3 Kết chế tạo kháng thể cộng hợp 77 4.4 Kết đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu kit chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 79 4.4.1 Kết xác định nồng độ kháng thể bắt vi khuẩn thích hợp 79 4.4.2 Kết xác định độ nhạy độ đặc hiệu KIT 81 Phần Kết luận kiến nghị 87 5.1 Kết luận 87 5.2 Kiến nghị 88 Danh mục cơng trình cơng bố liên quan đến luận án 89 Tài liệu tham khảo 90 Phụ lục 103 vi Chữ viết tắt 6PGD ADN ARN Bp dNTP E coli ELISA ICT IPTG kb kDa NC PBS PCR S suis SDS X-gal vii DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang 3.1 Thành phần phản ứng PCR phát S suis type 29 3.2 Chu trình nhiệt cho PCR phát mẫu dương tính 29 3.3 Thành phần PCR nhân đoạn gene 6PGD 30 3.4 Chu trình nhiệt cho phản ứng nhân gene 6PGD 31 3.5 Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tạo dòng 31 3.6 Bố trí thí nghiệm xác định lượng kháng nguyên thích hợp để gây tối miễn dịch 34 3.7 Bố trí thí nghiệm xác định chất bổ trợ thích hợp để gây tối miễn dịch 34 3.8 Xác định độ nhạy độ đặc hiệu KIT chẩn đoán nhanh 39 4.1 Tỷ lệ nhiễm liên cầu lợn type lợn số lò mổ địa bàn Thừa Thiên Huế 42 4.2 Kết sinh hóa chủng vi khuẩn THHSS2 50 4.3 Sự sai khác gene 6PGD vi khuẩn S suis type chủng TTHSS2 phân lập với gene 6PGD vi khuẩn S suis type chủng SC 19 ngân hàng gene 54 4.4 Kết đánh giá khả sinh miễn dịch kháng nguyên 58 4.5 Ảnh hưởng liều lượng kháng nguyên đến đáp ứng miễn dịch chuột SA 61 4.6 Ảnh hưởng chất bổ trợ đến đáp ứng miễn dịch chuột SA 64 4.7 Kết chế tạo kháng thể kháng S suis type 67 4.8 Kết phát vi khuẩn S suis type nồng độ kháng thể bắt khác 81 4.9 Ngưỡng phát KIT phát nhanh vi khuẩn S suis type .83 4.10 Đánh giá độ đặc hiệu KIT 85 4.11 Kết xác định độ đặc hiệu độ nhạy KIT 86 viii DANH MỤC HÌNH TT Tên hình Trang 2.1 Hình ảnh nhuộm gram vi khuẩn S suis 2.2 Cấu trúc KIT chẩn đoán nhanh 22 2.3 Cơ chế hoạt động KIT chẩn đoán nhanh 24 3.1 4.1 Cấu trúc vector pGEM -T Easy Vector Systems (Promega) 32 Kết PCR kiểm tra mẫu dương tính với S suis type 42 4.2 Kết phân lâp vi khuẩn Streptococcus suis mơi trường thạch máu ® cừu 5% 44 4.3 Kết nhuộm Gram vi khuẩn Streptococcus suis từ khuẩn lạc 45 4.4 Kết nhuộm Gram vi khuẩn Streptococcus suis từ canh khuẩn 46 4.5 Kết kiểm tra Streptococcus spp môi trường Bile Esculin agar .47 4.6 Kết lên men đường glucose lactose vi khuẩn S suis 48 4.7 Kết kiểm tra tính di động vi khuẩn 48 4.8 Kiểm tra khả sinh indol vi khuẩn S suis 49 4.9 Kết PCR kiểm tra chủng vi khuẩn TTHSS2 50 4.10 Kết PCR nhân đoạn gen 6PGD chủng TTHSS2 51 4.11 Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli Top 10 52 4.12 Kết PCR nhân gen 6PGD trực tiếp từ khuẩn lạc trắng kết khuẩn lạc trắng PCR cặp mồi M13 53 4.13 So sánh mức độ tương đồng amino acid mã hóa từ đoạn gene 6PGD chủng TTHSS2 đoạn gene công bố WP_012028448.1 54 4.14 Kết cấy vi khuẩn TTHSS2 bất hoạt cấy môi trường thạch máu cừu 5% 56 4.15 Kết đánh giá tính an tồn kháng ngun TTHSS2 59 4.16 So sánh đáp ứng chuột tiêm kháng nguyên S suis type với liều khác 62 4.17 Đáp ứng miễn dịch chuột tiêm kháng nguyên S suis type phối trộn với chất bổ trợ khác 65 4.18 Gel nhuộm màu Coomassie Blue SDS-PAGE mẫu kháng thể tinh 68 ix 101 113 Zhou Yang J., M Jin, J Chen, Y Yang, P Zheng, A Zhang, Y Song, H and H Chen (2007) Development and evaluation of an immunochromatographic strip for detection of Streptococcus suis type antibody J Vet Diagn Invest Vol 19 (4) pp 355-361 114 Yu H., H Jing, Z Chen, H Zheng, X Zhu, H Wang, S Wang, L Liu, R Zu, L Luo, N Xiang, H Liu, X Liu, Y Shu, S.S Lee, S.K Chuang, Y Wang, J Xu and W Yang (2006) Human Streptococcus suis outbreak, Sichuan, China Emerg Infect Dis Vol 12 (6) pp 914-920 115 Zaytseva N.V., R.A Montagna, E.M Lee and A.J Baeumner (2004) Multi-analyte single-membrane biosensor for the serotype-specific detection of Dengue virus Analytical and bioanalytical chemistry Vol 380 (1) pp 46-53 116 Zhang C.P., Y.B Ning, Z.Q Zhang, L Song, H.S Qiu, H.Y Gao and X.Z Fan (2009) Distributions of pathogenic capsular types and in vitro antimicrobial susceptibility of different serotypes of Streptococcus suis isolated from clinically healthy sows from 10 provinces in China Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi Vol 30 (3) pp 235–238 102 PHỤ LỤC Phụ lục Phương pháp tinh sản phẩm PCR Sau thực phản ứng PCR, số lượng lớn phân tử ADN vùng cần nghiên cứu nhân lên Sản phẩm tinh dùng để giải trình trình tự trực tiếp dòng hóa vào plasmid vector với hiệu suất tiếp nhận cao Tiến hành tinh sản phẩm PCR sử dụng hóa chất hãng Promega ® (Wizard SV Gel and PCR CleanUp System) Bước 1: Thêm dung dịch Membrane Binding Solution (MBS) vào sản phẩm PCR theo tỷ lệ 1:1 trộn Bước 2: Chuyển toàn dung dịch lên màng cột lọc, ủ phút, ly tâm 13.000 vòng/phút phút, đổ bỏ dịch phía cột lọc Bước 3: Thêm 700 µl dung dịch Membrane Wash Solution (WB), ly tâm 13.000 vòng/phút phút, đổ bỏ dịch Bước 4: Lặp lại bước với 500 µl WB, ly tâm 13.000 vòng/phút phút Bước 5: Chuyển cột sang ống Eppendorf mới, thêm 50 µl Nuclease Free Watervào màng lọc, để nhiệt độ phòng phút, ly tâm 13.000vòng/phút phút, thu sản phẩm PCR tinh Ký hiệu bảo quản -20 C sử dụng 103 Phụ lục Tách ADN plasmid tái tổ hợp Sử dụng hóa chất tách chiết plasmid tái tổ hợp hãng Invitrogene ® (PureLink Quick Plasmid ADN Miniprep Kits) sử dụng Tách chiết ADN plasmid thực nhờ dung dịch có khả làm ly giải tế bào vi khuẩn, loại bỏ ADN hệ gene vi khuẩn khỏi ADN plasmid loại muối vơ có dung mơi Kit Sau dung dịch chứa ADN palsmid chuyển sang cột lọc, có cấu tạo màng lọc tích điện dương (+), giữ lại ADN plasmid tích điện âm (-), qua nhiều lần ly tâm Các bước tiến hành tách ADN plasmid tái tổ hợp (phương pháp Hãng sinh phẩm Invitrogene Chuyển dịch nuôi cấy sang ống Eppendorf 1,5 ml, ly tâm 8000 vòng/phút phút để thu tế bào Sau ly tâm bỏ dịch bên trên, giữ cặn tế bào bên (dùng pipet hút hết dịch giữ lại cặn tế bào) Thêm 250 µl dung dịch (R3) vào để hòa tan cặn, dùng pipet hút nhẹ lên xuống vài lần cho Thêm 250 µl dung dịch (L7) vào hỗn dịch để phá màng tế bào, đậy nắp, nhẹ nhàng trộn cách lắc xi ngược tồn vài lần, ủ nhiệt độ phòng phút Thêm 350 µl dung dịch (N4), trộn nhẹ nhàng, sau đem ly tâm 13000 vòng/phút 10 phút, nhiệt độ C Chuyển toàn phần dịch bên lên màng cột lọc Ly tâm 13000 vòng/phút phút, bỏ dịch Thêm 500 µl dung dịch (W10) lên màng lọc, để nhiệt độ phòng phút, sau ly tâm 13000 vòng/phút phút, bỏ dịch bên Thêm 700 µl dung dịch (W9) lên màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút phút, bỏ dịch Ly tâm lại để làm khô cột - Chuyển cột lọc sang ống eppendorf mới, thêm 75 µl dung dịch TE lên màng lọc, để nhiệt độ phòng phút, ly tâm 13000 vòng/phút phút, bỏ cột lọc thu dịch chứa ADN plasmid Ký hiệu mẫu bảo quản - 20 C 104 Phụ lục Tách chiết tinh kháng thể Econo-Pac protein A kit Sử dụng dụng cụ Econo-Pac protein A Kit (Bio-Rad) với mục đích tinh tất phân lớp kháng thể IgG, kể IgG1 Việc chuẩn bị mẫu đơn giản hóa cách sử dụng cột tách muối Econo-Pac 10DG Quá trình gắn, tách rửa, thu sản phẩm hồn tất với cột lượng dung dịch đệm định cho bước, tạo nên quy trình nhanh dễ dàng Thành phần KIT bao gồm: Cột Econo-Pac protein A (chứa 2ml thạch Affi-Gel protein A), Cột tách muối Econo-Pac 10DG, dung dịch đệm để gắn protein (Binding bufer), dung dịch tách rửa (Elution buffer), dung dịch rửa hoàn nguyên (Regeneration buffer, rửa cột để tái sử dụng) Chuẩn bị đệm + Binding buffer: hòa tan 37,68g binding buffer với nước cất, định mức 120 ml Khuấy 10 phút, lọc qua lọc nylon 0,22 µm pH ± 0,2 + Elution buffer: hòa tan 2,64g Elution buffer với nước cất, định mức 120ml pH 3,0 ± 0,2 + Bước 1: Loại bỏ dung dịch đệm (phía trên) cột Econo-pac 10DG + Bước 2: Cho ml dung dịch đệm gắn (binding buffer) vào cột (đổ từ phía trên) bẻ gãy phần nhọn đáy để dòng chảy cột lưu thơng + Bước 3: Cho ml huyết vào cột Nếu lượng mẫu ml cho thêm dung dịch đệm để đạt thể tích cuối 3ml + Bước 4: Đợi để huyết chảy hết vào cột Loại bỏ ml dung dịch tách rửa + Bước 5: Cho vào cột ml dung dịch đệm gắn (binding buffer), thu ml dịch từ cột + Bước 6: Rửa cột Econo-pac 10DG với 20 ml đệm gắn để sử dụng lại lần sau, rửa với 20 ml nước chứa 0.02% sodium azide để bảo quản lâu dài + Bước 7: Loại bỏ dung dịch đệm (phía trên) cột Econo-pac protein A + Bước 8: Cho vào cột 10 ml đệm gắn Để cho đệm rút từ từ khỏi mặt cột + Bước 9: Cho mẫu (đã chuẩn bị bước trên) vào cột Thể tích mẫu tối đa 2ml + Bước 10: Cho vào cột 20 ml dung dịch đệm gắn (binding buffer) + Bước 11: Cho vào cột 10 ml dung dịch đệm tách rửa, hứng dịch chảy qua cột vào cốc dịch chứa IgG (Sử dụng thêm 20 ml dung dịch đệm tách rửa đảm bảo trình tách rửa triệt để Tuy nhiên, hầu hết IgG tách rửa với 10 ml dung dịch đệm ban đầu) 105 + Bước 12: Chuẩn bị cột Econo-pac 10DG (mới, chưa sử dụng) cân trước với 20 ml PBS đệm thích hợp để bảo quản globulin miễn dịch + Bước 13: Cho ml IgG thu bước 11 vào cột Econo-pac 10DG chuẩn bị bước 12 Loại bỏ ml dịch + Bước 14: Cho tiếp vào cột Econo-pac 10DG ml PBS, thu (hứng vào cốc) ml dịch chảy từ cột Đây dung dịch chứa IgG Làm nhắc lại hết dịch mẫu Sau thu dung dịch chứa IgG, tiến hành điện di SDS-PAGE để kiểm tra độ huyết sau tinh chế 106 Phụ lục Mức độ tương đồng trình tự nucleotic đoạn gene mã hóa kháng nguyên 6PGD phân lập từ chủng vi khuẩn TTHSS2 với trình tự nucleotic đoạn gene mã hóa kháng nguyên 6PGD công bố Genebank 107 108 Phụ lục Một số Kết ELISA 0.001 0.004 0.002 0.003 0.001 0.003 0.004 0.005 0.001 0.090 0.095 0.005 0.001 0.004 0.003 0.001 0.002 2.321 0.135 0.001 0.003 0.003 0.004 0.004 5.1 Xác định tính sinh miễn dịch 0.001 0.005 0.002 0.003 0.003 0.003 2.333 2.256 2.455 2.232 0.002 0.003 0.159 0.143 0.122 0.132 0.003 0.004 0.002 0.001 0.002 0.001 0.034 0.004 0.003 0.043 0.003 0.001 0.003 0.005 0.001 0.004 0.002 0.003 0.004 0.002 0.003 0.004 0.004 0.022 0.002 0.002 0.003 0.002 0.002 0.002 0.005 0.001 0.001 0.001 0.002 0.001 0.003 0.002 0.003 0.003 0.001 0.002 0.004 0.001 0.002 0.003 0.002 0.002 0.003 0.003 0.002 0.003 0.003 0.002 0.005 0.003 0.186 1.442 2.311 2.299 2.310 2.315 2.321 0.001 0.187 1.442 2.331 2.301 2.343 2.349 2.351 0.003 5.2 Xác định liều lượng kháng nguyên thích hợp 0.181 1.520 2.661 2.521 2.628 2.629 2.624 0.000 0.180 1.514 2.610 2.534 2.642 2.635 2.638 0.001 0.189 1.635 2.601 2.512 2.615 2.621 2.632 0.000 0.211 1.612 2.639 2.504 2.599 2.629 2.639 0.001 0.178 1.557 2.620 2.492 2.611 2.628 2.634 0.002 0.219 1.550 2.632 2.512 2.638 2.634 2.632 0.001 0.185 1.551 2.641 2.528 2.599 2.614 2.621 0.001 0.184 1.548 2.642 2.523 2.639 2.642 2.642 0.001 0.183 1.432 2.313 2.225 2.312 2.333 2.403 0.001 0.192 1.423 2.301 2.291 2.318 2.341 2.351 0.003 Kiểm tra sai khác nhóm thí nghiệm t-Test: Paired Two Sample for Means nhóm nhóm Mean Variance Observations Pearson Correlation Hypothesized Mean Difference df t Stat P(T