BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chun ngành: Ni trồng thủy sản Mã ngành: 9620301 TRƯƠNG THỊ HOA NGHIÊN CỨU BỆNH DO Streptococcus iniae GÂY RA TRÊN CÁ CHẼM (Lates calcarifer) VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG BỆNH Cần Thơ, 2019 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn: PGS.TS Đặng Thị Hoàng Oanh Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: Vào lúc … … ngày … tháng … năm … Phản biện 1: …………………………………………………… Phản biện 2: ……………………………………………… Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Trương Thị Hoa, Nguyễn Ngọc Phước Đặng Thị Hoàng Oanh, 2018 Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic từ số lồi cá nước lợ có khả kháng vi khuẩn Streptococcus iniae gây bệnh xuất huyết cá chẽm (Lates calcarifer) Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nông thôn 338: 99 – 106 Trương Thị Hoa, Nguyễn Ngọc Phước Đặng Thị Hoàng Oanh, 2018 Nghiên cứu đặc điểm bệnh học vi khuẩn Streptococcus iniae cá chẽm (Lates calcarifer) Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 54(3B): 156-163 i Chương GIỚI THIỆU 1.1 Giới thiệu Trên cá chẽm, bệnh S iniae báo cáo lần vào năm 1999 Úc (Bromage et al., 1999), sau bệnh tiếp tục xuất cá chẽm nuôi Úc năm 2006 (Creeper Buller, 2006), Thái Lan năm 2010 (Suanyuk et al., 2010) Bệnh S iniae cá chẽm gây xuất huyết da, vây mắt lồi đục (Bromage et al., 1999) Một số dấu hiệu khác lở loét da hay xuất huyết gốc vây, nắp mang, hậu môn quan sát cá chẽm cá rô phi nhiễm S iniae (Suanyuk et al., 2010) Bệnh S iniae gây tỷ lệ chết lên đến 70% giai đoạn cá chẽm giống (Creeper Buller, 2006) Ở Việt Nam, bệnh S iniae báo cáo xuất cá chẽm ni Khánh Hòa vào năm 2013 (Trần Vĩ Hích, 2014) Tại Thừa Thiên Huế, từ năm 2007, để hạn chế dịch bệnh ô nhiễm môi trường nuôi thâm canh tôm thẻ chân trắng gây ra, tỉnh phát triển nuôi đối tượng cá nước mặn, lợ cá mú, cá hồng, cá dìa, cá chẽm…, để thay vùng ni tơm bị dịch bệnh Trong đó, cá chẽm người dân địa phương nuôi phổ biến mang lại hiệu kinh tế cao (Tôn Thất Chất ctv., 2010) Tuy nhiên, việc mở rộng diện tích mặt nước nuôi cá chẽm thiếu quy hoạch chặt chẽ làm nghề ni cá gặp nhiều khó khăn mơi trường dịch bệnh, bệnh xuất huyết cá chẽm phổ biến Thuốc kháng sinh thường sử dụng để trị bệnh vi khuẩn gây động vật thủy sản nuôi Việc sử dụng kháng sinh để trị bệnh vi khuẩn mang lại thành công định, làm gia tăng dòng vi khuẩn kháng thuốc (Weston, 1996; Tu Thanh Dung et al., 2008) Do nghiên cứu sử dụng vi khuẩn có khả kháng với vi khuẩn gây bệnh động vật thủy sản ngày quan tâm Trong có vi khuẩn lactic, có khả kháng vi khuẩn gây bệnh có lợi với sức khỏe vật chủ bổ sung đủ số lượng đường ruột (Nirunya et al., 2008) Vi khuẩn lactic sản xuất số chất kháng khuẩn axit hữu cơ, hợp chất kháng nấm bacteriocin để ức chế phát triển mầm bệnh (Ringo et al., 2005; Gatesoupe, 2007) Vi khuẩn lactic phân lập từ nhiều nguồn khác từ sản phẩm lên men, từ ruột gia súc loài động vật thủy sản Một số nghiên cứu vi sinh vật đường ruột cá môi trường sống khác cho thấy vi khuẩn lactic tồn ruột cá không chiếm ưu hệ vi sinh đường ruột (Ringo et al., 2010) Do đó, bổ sung vi khuẩn lactic vào phần ăn cá để ức chế vi khuẩn gây bệnh nâng cao sức đề kháng bệnh cho cá (Lauzon Ringo, 2011) Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu ảnh hưởng việc bổ sung vi khuẩn lactic vào thức ăn đến tiêu miễn dịch không đặc hiệu cá chẽm Xuất phát từ thực tiễn đó, thực đề tài “Nghiên cứu bệnh Streptococcus iniae gây cá chẽm (Lates calcarifer) biện pháp phòng bệnh” nhằm cung cấp thông tin bệnh vi khuẩn S iniae cá góp phần phát triển nghề ni cá chẽm bền vững 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chung: Cung cấp thông tin bệnh vi khuẩn S iniae gây cá chẽm làm sở khoa học cho việc quản lý dịch bệnh góp phần phát triển nghề ni cá chẽm bền vững Mục tiêu cụ thể: Xác định đặc điểm gây bệnh vi khuẩn S iniae cá chẽm đề xuất giải pháp phòng bệnh làm sở cho việc chẩn đốn phòng bệnh xuất huyết cá chẽm 1.3 Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu tập trung tìm hiểu bệnh xuất huyết vi khuẩn S iniae gây cá chẽm nuôi tỉnh Thừa Thiên Huế, tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả đối kháng vi khuẩn S iniae từ ruột cá dìa, cá chẽm cá rô phi, đồng thời xác định số tiêu huyết học khả kháng vi khuẩn S iniae cá chẽm giai đoạn giống 1.4 Nội dung nghiên cứu Đặc điểm gây bệnh vi khuẩn S iniae cá chẽm Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả đối kháng vi khuẩn S iniae từ ruột số loài cá nước lợ Xác định ảnh hưởng việc bổ sung chủng vi khuẩn lactic vào thức ăn đến số tiêu huyết học khả ức chế vi khuẩn S iniae huyết cá chẽm 1.5 Ý nghĩa nghiên cứu Kết nghiên cứu luận án cung cấp thông tin bệnh vi khuẩn cá, đặc biệt bệnh xuất huyết vi khuẩn S iniae gây cá chẽm Đồng thời đánh giá ảnh hưởng vi khuẩn lactic phân lập từ ruột số loài cá nước lợ đến số tiêu miễn dịch không đặc hiệu cá chẽm Kết luận án có ý nghĩa việc sử dụng vi khuẩn lactic có tính đối kháng với mầm bệnh vi khuẩn S iniae tạo chế phẩm sinh học phòng bệnh xuất huyết cá Bên cạnh ý nghĩa khoa học ứng dụng thực tiễn, luận án giúp nâng cao kiến thức, lực nghiên cứu cho người tham gia nguồn tài liệu tham khảo bổ sung cho nghiên cứu giảng dạy sinh viên trường đại học 1.6 Điểm luận án Bệnh xuất huyết S iniae nghiên cứu mô tả đặc điểm bệnh học cá chẽm nuôi Thừa Thiên Huế Đã định danh lưu giữ ba chủng vi khuẩn Lactobacillus fermentum từ ruột cá dìa cá chẽm có khả đối kháng mạnh với vi khuẩn S iniae gây bệnh xuất huyết cá chẽm Sử dụng chủng vi khuẩn L fermentum (C21) bổ sung vào thức ăn cho cá chẽm làm tăng cường số tiêu miễn dịch không đặc hiệu giúp nâng cao khả đề kháng vi khuẩn S iniae gây bệnh xuất huyết cá chẽm Chương PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu Vi khuẩn Streptococcus iniae phân lập từ cá chẽm (Lates calcarifer) bệnh xuất huyết Vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá chẽm (Lates calcarifer), cá dìa (Siganus guttatus) cá rơ phi (Oreochromis niloticus) Cá chẽm (Lates calcarifer) 3.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu từ tháng 12/2014 đến tháng 8/2018 Các thí nghiệm tiến hành phân tích phòng thí nghiệm khoa Thủy sản, trường Đại học Nông Lâm – Đại học Huế 3.4 Phương pháp nghiên cứu 3.4.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm gây bệnh vi khuẩn S iniae cá chẽm 3.4.1.1 Phân lập định danh vi khuẩn S iniae gây bệnh xuất huyết cá chẽm Phương pháp thu mẫu Tổng số có 87 mẫu cá chẽm bị bệnh xuất huyết thu 10 hộ nuôi lồng, nuôi đơn cá chẽm tỉnh Thừa Thiên Huế thời gian từ tháng 01/2016 đến tháng 12/2016 Mẫu cá thu có dấu hiệu xuất huyết da, mắt cá bị lồi, mờ đục xuất huyết Cá giữ thùng xốp sau thu vận chuyển phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập vi khuẩn Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn xác định đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa vi khuẩn Ni cấy phân lập vi khuẩn gây bệnh cá chẽm tiến hành theo phương pháp Frerichs Millar, (1993) Định danh bằng phương pháp giải trình tự gen đặc hiệu Phương pháp định danh vi khuẩn S iniae tiến hành phương pháp khuếch đại đoạn gen đặc hiệu (PCR) với cặp mồi Sin 1: CTAGAGTACACATGTAGCT(AGCT)AAG Sin 2: GGATTTTCCACTCCCATTAC kích thước sản phẩm 300 bp (Zlotkin et al., 1998) Thành phần phản ứng PCR phát S iniae thực theo qui trình Zlotkin et al (1998) gồm 1X dung dịch đệm 10X; 1,5mM MgCl2; 200μM dNTPs; 2,5 U Taq DNA polymerase; 0,5μL mồi xuôi (Sin1); 0,5μL mồi ngược (Sin 2) 500 ng mẫu DNA Chu kì nhiệt PCR 94°C phút; sau 94°C 60 giây; 55°C 60 giây; 72°C 90 giây; lặp lại chu kì 35 lần; 72°C 10 phút Sản phẩm khuếch đại đặc hiệu vị trí 300 bp Sản phẩm PCR sau tinh kít KIT Isolate II PCR Gel (BioLine, Đức) gửi đến phòng thí nghiệm Macrogen – Hàn Quốc để tiến hành giải trình tự axit nucleic 3.4.1.2 Xác định khả gây bệnh thực nghiệm vi khuẩn S iniae Chuẩn bị cá thí nghiệm Cá thí nghiệm giai đoạn giống, có chiều dài trung bình 6,6±0,4 cm/con, khối lượng trung bình 7,2±0,5 g/con Cá khỏe mạnh, ni điều kiện thí nghiệm 14 ngày để quen với mơi trường thí nghiệm cho ăn thức ăn Nanolis C (Ocialis, Việt Nam) lần/ngày vào lúc 17 giờ, lần cho ăn 8% khối lượng thân Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1: Xác định độc lực vi khuẩn Thí nghiệm xác định độc lực vi khuẩn tiến hành theo phương pháp Dilok (2012) Thí nghiệm bố trí gồm 11 nghiệm thức, có 10 nghiệm thức thí nghiệm cảm nhiễm với 10 chủng vi khuẩn S iniae với mật độ 109 CFU/mL vào xoang bụng cá Những chủng vi khuẩn S iniae gây chết cá ngày thí nghiệm xem chủng có độc lực sử dụng cho thí nghiệm Thí nghiệm 2: Xác định liều gây chết 50% (LD50 Lethal dose 50) Thí nghiệm xác định liều gây chết 50% tiến hành theo phương pháp Reed Muench (1938) Thí nghiệm tiến hành 14 ngày, kiểm tra cá lần/ngày để theo dõi số lượng cá chết Liều gây chết 50% xác định dựa tỉ lệ chết tích lũy nghiệm thức sau kết thúc thí nghiệm Thí nghiệm 3: Xác định khả gây bệnh thực nghiệm vi khuẩn Xác định khả gây bệnh thực nghiệm vi khuẩn tiến hành theo phương pháp Dilok (2012), (Bảng 3.4) Bảng 3.4: Thiết kế thí nghiệm xác định khả gây bệnh chủng HTA1 HTA3 cá chẽm Chủng vi Lơ thí Cá thí nghiệm Mật độ vi khuẩn Số lần khuẩn nghiệm (con/bể) (CFU/mL) lặp lại HTA1 10 LD50 HTA3 10 LD50 ĐC 10 NMSL Thí nghiệm 14 ngày, kiểm tra cá lần/ngày để theo dõi tình trạng sức khỏe cá thu cá có dấu hiệu bệnh lý để phân lập lại vi khuẩn nghiên cứu mô bệnh học 3.4.1.3 Xác định đặc điểm mô bệnh học cá chẽm cảm nhiễm S iniae Mẫu cá chẽm giống có biểu bệnh cá khỏe thu từ thí nghiệm để phân tích mơ học Mẫu mơ gan, lách, thận, não cá bệnh cá khỏe cố định dung dịch formalin 4% Sau bảo quản mẫu làm tiêu theo phương pháp Mohamed (2009) Quan sát tiêu kính hiển vi nhận dạng bệnh tích dựa vào số thay đổi cấu trúc mô 3.4.2 Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic từ ruột số loài cá nước lợ có khả ức chế S iniae 3.4.2.1 Phân lập chủng vi khuẩn lactic từ ruột cá chẽm, cá dìa cá rơ phi Thu mẫu Chọn cá rơ phi, cá dìa cá chẽm đánh bắt từ tự nhiên, cá có kích cỡ thương phẩm, cá khỏe mạnh dấu hiệu bệnh lý Cá sau thu mang phòng thí nghiệm, giải phẫu lấy mẫu vi khuẩn ruột để phân lập vi khuẩn lactic Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic Tiến hành phân lập nuôi cấy chủng vi khuẩn lactic ruột cá chẽm, dìa rơ phi theo phương pháp Nirunya et al (2008) Phương pháp xác định đặc điểm hình thái, sinh lý vá sinh hóa vi khuẩn lactic Tiến hành nhuộm Gram, thử phản ứng catalase, oxidase, kiểm tra khả di động, khả sinh bào tử vi khuẩn; khả phân giải CaCO3 khả làm dịch hóa gelatin Vi khuẩn lactic xác định theo cẩm nang Cowan Steels (Barrow Feltham, 1993) 3.4.2.2 Xác định khả đối kháng với vi khuẩn S iniae vi khuẩn lactic Thử nghiệm khả đối kháng với vi khuẩn S iniae vi khuẩn lactic theo phương pháp Hamza et al (2012) Sử dụng phương pháp khuếch tán giếng thạch để xác định khả đối kháng với chủng S iniae HTA1 chủng vi khuẩn lactic phân lập Xác định khả kháng khuẩn chủng vi khuẩn lactic theo phương pháp Galindo (2004) 3.4.2.3 Định danh chủng vi khuẩn lactic có khả đối kháng mạnh với vi khuẩn S iniae Phương pháp định danh vi khuẩn lactic tiến (NT 1)): Không bổ sung vi khuẩn L fermentum vào thức ăn không cảm nhiễm vi khuẩn S iniae vào xoang bụng cá; Nghiệm thức đối chứng dương (nghiệm thức (NT 2)): Không bổ sung vi khuẩn L fermentum vào thức ăn cảm nhiễm vi khuẩn S iniae vào xoang bụng cá sau 14 ngày thí nghiệm với liều tiêm 1,9x105 CFU/mL/cá; Nghiệm thức thí nghiệm (nghiệm thức (NT 3)): Bổ sung vi khuẩn L fermentum vào thức ăn, mật độ 109 CFU/g thức ăn không cảm nhiễm vi khuẩn S iniae; Nghiệm thức thí nghiệm (nghiệm thức (NT 4)): Bổ sung vi khuẩn L fermentum vào thức ăn, mật độ 109 CFU/g thức ăn cảm nhiễm vi khuẩn S iniae vào xoang bụng cá sau 14 ngày cho ăn với liều tiêm 1,9x105 CFU/mL/cá Theo dõi thí nghiệm 28 ngày, tiến hành lấy máu động mạch vào ngày thí nghiệm 1; 14; 21 28 nghiệm thức (mỗi lần thu mẫu lấy 03 con/bể) để xác định số lượng tế bào máu, khả ức chế S iniae huyết hoạt tính lysozyme huyết 3.4.3.4 Phương pháp xác định tiêu huyết học Định lượng hồng cầu: Số lượng hồng cầu máu cá xác định theo phương pháp Natt Herrick (1952) Định lượng tổng bạch cầu Chuẩn bị tiêu máu lame nhuộm mẫu máu theo Humason, 1979 (trích dẫn Rowley, 1990) Số lượng tổng bạch cầu loại bạch cầu máu cá xác định theo phương pháp Chinabut et al (1991) Hrubec et al (2000) 3.4.3.5 Xác định khả ức chế vi khuẩn S iniae huyết Khả ức chế vi khuẩn S iniae huyết cá chẽm xác định theo phương pháp Phuong et al (2007) Số vi khuẩn S iniae bị ức chế (Suc (%)) huyết cá chẽm tính theo công thức: Suc (%) = OD mẫu - OD blank OD control - OD bank x 100 Trong đó: Suc (%): Tỷ lệ (%) vi khuẩn bị ức chế huyết thanh; OD- Optical Density - Mật độ quang 3.4.3.6 Xác định hoạt tính lysozyme huyết Hoạt tính lysozyme huyết cá chẽm xác định theo phương pháp Kumar et al (2007) Hoạt tính lysozyme xác định đơn vị/phút/mg protein huyết Một đơn vị lysozyme (U) xác định lượng lysozyme làm giảm độ hấp thụ bước sóng 450 nm với 0,001 đơn vị hấp phụ/phút/mg (U/phút/mg) 3.4.3.7 Phương pháp xác định tỷ lệ sống cá Theo dõi thí nghiệm, xác định tổng số cá sống sau 14 ngày cảm nhiễm S iniae Tỷ lệ sống cá xác định theo công thức (Kumar et al., 2007): Tỷ lệ sống (%) = Số cá sống sau cảm nhiễm S iniae Số cá cảm nhiễm S iniae x 100 Hiệu sử dụng vi khuẩn L fermentum bổ sung vào thức ăn đánh giá tỉ lệ bảo hộ (relative percentage of survival - RPS) (%) theo công thức (Ellis, 1988) 3.5 Xử lý số liệu Số liệu thơ thí nghiệm nhập xử lý sơ phần mềm Microsoft Excel 2016, sau phân tích phương sai (ANOVA) theo mơ hình tuyến tính tổng quát (General Linear Model) phần mềm SPSS version 20 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Đặc điểm gây bệnh vi khuẩn S iniae cá chẽm 4.1.1 Kết phân lập vi khuẩn S iniae cá chẽm 4.1.1.1 Kết phân lập vi khuẩn Tổng số mẫu cá thu để phân lập vi khuẩn 87 Cá bị bệnh xuất huyết có dấu hiệu bệnh lý giảm ăn, 10 bơi lờ đờ mặt nước, màu sắc da tối; xuất huyết thân vây; mắt cá bị lồi, mờ đục xuất huyết; xoang bụng có chứa dịch nhầy, nội tạng bị xuất huyết, thận sưng, não xuất huyết (Hình 4.1) Hình 4.1 Cá chẽm bị bệnh xuất huyết vi khuẩn (A-mắt cá bị lồi xuất huyết; B- mắt lồi mờ đục, xoang bụng chứa dịch nhầy) Từ mẫu cá chẽm bị bệnh xuất huyết thu vùng nuôi phân lập 42 chủng vi khuẩn Streptococcus từ não, thận, lách gan cá Trong có 20 chủng phân lâp từ não, chiếm tỷ lệ 47,6%, chủng thận (21,4%), chủng lách (16,7%) chủng gan (14,3%) 4.1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa chủng vi khuẩn gây bệnh xuất huyết cá chẽm Hình 4.2: Hình dạng khuẩn lạc nhuộm Gram vi khuẩn S iniae (A- Hình dạng khuẩn lạc S iniae môi trường TSA+; B - Hình dạng vi khuẩn S iniae sau nhuộm Gram (100X)) Kết thu mẫu, phân lập nuôi cấy vi khuẩn cho thấy môi trường TSA+, sau 24 đến 48 nuôi cấy nhiệt độ 28oC, vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc nhỏ có đường kính khoảng 0,7 – mm, màu trắng đục, rìa đều, không sinh sắc tố Kết nhuộm Gram xác định vi 11 khuẩn Gram (+), có dạng hình cầu liên cầu (Hình 4.2) Kết nghiên cứu đặc điểm sinh hóa cho thấy chủng vi khuẩn phân lập không di động, phản ứng catalase oxidase âm tính, phản ứng lysin decarboxylase âm tính; phản ứng dương tính với bile esculin, huyết tương thỏ đơng khơ; chủng vi khuẩn có khả thủy phân tinh bột, không phát triển môi trường TSB có bổ sung 6,5% NaCl mơi trường TSA không bổ sung NaCl Kết xác định kiểu huyết phương pháp ngưng kết miễn dịch cho thấy 42 chủng vi khuẩn phân lập âm tính với kiểu huyết A, B, C, D, F, G nhóm Lancefield Trên mơi trường BA+, khuẩn lạc vi khuẩn tạo vòng dung huyết β Kết định danh kít API 20 Strep cho thấy 42 chủng Streptococcus thủy phân esculin không thủy phân hippurate Các chủng cho phản ứng pyrrolidonyl arylamidase, β-Glucuronidase, alkaline phosphatase, arginine dihydrolase leucine arylamidase dương tính, phản ứng Voges-Proskauer, α-Galactosidase, β-Galactosidase âm tính Dựa vào kết xác định tiêu sinh hóa so sánh với kết nghiên cứu Bromage et al (1999) Rahmatullah et al (2017), 42 chủng vi khuẩn phân lập định danh S iniae 4.1.2 Khả gây bệnh thực nghiệm S iniae cá chẽm 4.1.2.1 Kết xác định độc lực vi khuẩn Kết xác định độc lực vi khuẩn cho thấy chủng gây chết cá (100%) ngày thí nghiệm HTA1 HTA3 Do chủng HTA1 HTA3 chọn để xác định giá trị LD50 cá chẽm 4.1.2.2 Kết xác định LD50 S iniae cá chẽm Giá trị LD50 chủng HTA1 HTA3 cách tiêm vào xoang bụng cá chẽm 1,9x105 CFU/mL 1,5x105 CFU/mL 4.1.2.3 Kết gây bệnh thực nghiệm Kết gây bệnh thực nghiệm chủng HTA1 HTA3 cá chẽm cho thấy sau 48 cảm nhiễm với chủng HTA1 HTA3, cá chẽm có dấu hiệu bơi lờ đờ 12 mặt nước, xuất huyết da gốc vây, mắt lồi xuất huyết Sau 72 giờ, cá bắt đầu chết tỉ lệ chết tích lũy cao sau ngày 76,7% (chủng HTA1) 80% (chủng HTA3), (Hình 4.6) Trong lô đối chứng, cá dấu hiệu bệnh lý, không chết không phân lập vi khuẩn S iniae Tỷ lệ chết tích lũy (%) 100.0 80.0 60.0 40.0 20.0 HTA1 HTA3 ĐC 0.0 10 11 12 13 14 Ngày sau cảm nhiễm S iniae (ngày) Hình 4.6: Tỷ lệ chết tích lũy cá chẽm 14 ngày cảm nhiễm hai chủng S iniae HTA1 HTA3 Kết theo dõi tỷ lệ chết tích lũy cá chẽm thí nghiệm xác định khả gây bệnh thực nghiệm hai chủng HTA1 HTA3 cho thấy cá chết sau 72 cảm nhiễm tỷ lệ chết nghiệm thức thí nghiệm 20% Sau ngày thí nghiệm, tỷ lệ chết tích lũy cá chẽm cảm nhiễm hai chủng HTA1 HTA3 cao nhất, 76,7% 80%, nhiên khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê hai nghiệm thức (p>0,05); đến ngày thứ 9, khơng xuất cá chết lơ thí nghiệm Trong đó, cá lơ đối chứng khơng chết 14 ngày thí nghiệm 4.1.2.4 Đặc điểm mơ bệnh học cá chẽm cảm nhiễm S iniae Kết nghiên cứu mô học cá chẽm cảm nhiễm S iniae điều kiện thực nghiệm cho thấy vi khuẩn S iniae gây biến đổi cấu trúc mô gan, thận, lách não cá Vi khuẩn S iniae gây xuất huyết hoại tử mô gan, thận, lách não cá 13 Hình 4.7: Mơ gan cá chẽm cảm nhiễm vi khuẩn S iniae ((nhuộm H&E), (100X); (vi khuẩn S iniae mô gan cá chẽm sau ngày cảm nhiễm (mũi tên)) Hình 4.8: Mơ thận cá chẽm cảm nhiễm vi khuẩn S iniae ((nhuộm H&E), (100X); (a-trung tâm đại thực bào sắc tố mô thận (mũi tên); b-cấu trúc ống thận bị biến đổi (mũi tên)) Hình 4.9: Mơ lách cá chẽm cảm nhiễm vi khuẩn S iniae ((nhuộm H&E), (100X), (trung tâm đại thực bào sắc tố tập trung nhiều mô lách (mũi tên)) 14 Hình 4.10: Mơ não cá chẽm cảm nhiễm vi khuẩn S iniae ((nhuộm H&E), (100X); (vi khuẩn S iniae mô não cá chẽm sau ngày cảm nhiễm (mũi tên)) 4.1.2.5 Kết định danh phương pháp giải trình tự nucleotide đoạn gen 16S rRNA hai chủng HTA1 HTA3 Kết định danh chủng HTA1 HTA3 phương pháp khuếch đoạn gen đặc hiệu giải trình tự đoạn gen khuếch đại, xác định chủng S iniae 4.2 Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả đối kháng vi khuẩn S iniae từ ruột số loài cá nước lợ 4.2.1 Kết phân lập chủng vi khuẩn lactic Kết nghiên cứu phân lập 61 chủng vi khuẩn lactic Các chủng vi khuẩn vi khuẩn Gram dương, hình que hình cầu, khơng hình thành bào tử, không di động, phản ứng catalase oxidase âm tính, có khả phân giải CaCO3 khơng làm tan chảy gelatin (Bảng 4.7) Bảng 4.7: Kết phân lập vi khuẩn lactic từ cá chẽm, cá rô phi cá dìa Số lượng Cơ quan Số chủng vi Loài cá (con) phân lập khuẩn lactic Cá chẽm 50 Ruột 27 Cá rơ phi 50 Ruột 19 Cá dìa 50 Ruột 15 15 Bảng 4.8 Một số đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa chủng vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá dìa, cá chẽm cá rơ phi Chỉ tiêu sinh hóa Màu sắc khuẩn lạc Hình dạng tế bào Hình que Hình cầu Gram Di động Sinh bào tử Catalase Oxidase Phân giải CaCO3 Dịch hóa Gelatin Kết thử sinh hóa chủng vi khuẩn lactic Cá chẽm Cá rô phi Cá dìa (n = 27) (n = 19) (n = 15) Trắng đục Trắng đục Trắng đục 18 + + - 14 + + - 13 + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + MRS agar bổ sung 1% NaCl 1,5% NaCl 2% NaCl TSA bổ sung 1,5% NaCl 2% NaCl TSA bổ bổ sung 1,5% NaCl Nhiệt độ 4oC Nhiệt độ 28oC Nhiệt độ 37oC Ghi chú: (+) phản ứng dương tính; (-) phản ứng âm tính Hình 4.13 Hình dạng vi khuẩn lactic sau nhuộm Gram (100X), (A - Vi khuẩn có dạng hình que; B – Vi khuẩn có dạng hình cầu) 16 4.2.2 Kết xác định khả đối kháng với vi khuẩn S iniae vi khuẩn lactic Kết thử nghiệm khả đối kháng chủng vi khuẩn lactic với S iniae cho thấy 61 chủng vi khuẩn lactic có 28 chủng có khả kháng S iniae, chủng C21, D1 D7 có khả kháng mạnh (đường kính vòng kháng khuẩn lớn 20 mm) (Bảng 4.9) Bảng 4.9: Kết xác định khả đối kháng với vi khuẩn S iniae HTA1 chủng vi khuẩn lactic Chủng vi khuẩn D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14 D15 C1 C2 C3 C4 C5 C6 Khả kháng S iniae +++ ++ + +++ + ++ + + + + + ++ Chủng vi khuẩn C7 C8 C9 C10 C11 C12 C13 C14 C15 C16 C17 C18 C19 C20 C21 C22 C23 C24 C25 C26 C27 Khả Chủng vi Khả kháng S khuẩn kháng S iniae iniae R1 + R2 ++ R3 ++ R4 ++ R5 + R6 R7 R8 R9 R10 + + R11 R12 + R13 + R14 +++ R15 R16 + + R17 + R18 ++ R19 + + - Ghi chú: Ký hiệu thể khả kháng sau: (-): không kháng, d20 mm 17 4.2.3 Kết định danh chủng vi khuẩn lactic có khả đối kháng mạnh với vi khuẩn S iniae Kết điện di sản phẩm PCR đoạn gen 16S rRNA tách chiết từ 03 chủng C21, D1 D7 ghi nhận vạch 345 bp, đặc hiệu cho Lactobacillus fermentum Kết định danh chủng C21, D1 D7 phương pháp khuếch đoạn gen đặc hiệu, giải trình tự đoạn gen khuếch đại xây dựng phát sinh thể mối quan hệ di truyền xác định chủng Lactobacillus fermentum 4.3 Ảnh hưởng việc bổ sung chủng vi khuẩn lactic vào thức ăn đến số tiêu huyết học khả ức chế vi khuẩn S iniae huyết cá chẽm 4.3.1 Kết xác định tiêu huyết học cá chẽm Các tiêu huyết học khả kháng S iniae huyết cá chẽm đánh giá vào 1, 14, 21 28 ngày thí nghiệm Kết nghiên cứu cho thấy số lượng tế bào hồng cầu tổng bạch cầu cá NT (bổ sung vi khuẩn L fermentum vào thức ăn không cảm nhiễm vi khuẩn S iniae) NT (bổ sung vi khuẩn L fermentum vào thức ăn cảm nhiễm vi khuẩn S iniae) vào ngày thứ 21 cao so với NT (không bổ sung vi khuẩn L fermentum vào thức ăn không cảm nhiễm vi khuẩn S iniae) NT (không bổ sung vi khuẩn L fermentum vào thức ăn cảm nhiễm vi khuẩn S iniae), (p