r VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ HIỀN TRANG BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƯ MÁU CỦA ENZYME L-ASPARAGINASE TÁI TỔ HỢP TỪ Erwinia chrysanthemi Luận án tiến sĩ sinh học Hà nội - 2019 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ HIỀN TRANG BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƢ MÁU CỦA ENZYME L-ASPARAGINASE TÁI TỔ HỢP TỪ Erwinia chrysanthemi Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 42 01 07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS ĐỖ THỊ TUYÊN Viện Công nghệ sinh học PGS.TS QUYỀN ĐÌNH THI Viện Cơng nghệ sinh học Hµ néi - 2019 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị Tun, Trưởng phòng Cơng nghệ sinh học Enzyme, Viện Cơng nghệ sinh học tận tình hướng dẫn, giúp đỡ thường xuyên giai đoạn trình nghiên cứu, sửa chữa luận án, báo tạo điều kiện hóa chất, thiết bị, kinh phí, thời gian để tơi hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, kính trọng tới cố PGS TS Quyền Đình Thi ngun Trưởng phòng Cơng nghệ sinh học Enzyme, ngun Phó Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn định hướng nghiên cứu bước đầu cho luận án Luận án thực kinh phí đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam “Nghiên cứu qui trình sản xuất L-asparaginase tái tổ hợp, thử nghiệm diệt dòng tế bào ung thư định hướng dùng hỗ trợ điều trị bệnh ung thư máu” cố PGS TS Quyền Đình Thi làm chủ nhiệm Tôi xin gửi lời cảm ơn tới nhóm nghiên cứu PGS TS Đỗ Thị Thảo, nhóm nghiên cứu TS Lã Thị Huyền_Viện Cơng nghệ sinh học, nhóm nghiên cứu PGS TS Hồng Thị Mỹ Nhung – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên nhóm nghiên cứu TS Đỗ Minh Trung- Học Viện Quân y phối hợp nghiên cứu tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận án Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Phòng Quản lý tổng hợp, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, cán sở đào tạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công Nghệ Việt Nam tạo điều kiện thời gian, trang thiết bị giúp đỡ thủ tục hành để luận án hồn thành Để hồn thành luận án tơi nhận nhiều giúp đỡ quý báu nhiệt tình tập thể cán Phòng Cơng nghệ sinh học Enzyme,Viện Công nghệ sinh học, động viên suốt q trình nghiên cứu Đồng thời tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè người thân động viên tinh thần giúp đỡ vật chất suốt trình thực luận án Hà nội, ngày tháng năm 2019 Nguyễn Thị Hiền Trang i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác; Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; Phần lại chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả NCS Nguyễn Thị Hiền Trang ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt ALL Acute AML Acute aspg Gene Gene maspg chỉnh rASPG L-asp CML Chron CCR Child CR Comp DEAE Dieth DNA Deoxi DMSO Dime DFCI Dana- DFS Disea DTT Dithio EDTA Ethyle EFS Event Huma HLA LB Lysog IPTG Isopro OD Optic PEG Polye POG Pedia SRB Sulfor TCA Trichl iii MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT - iii MỤC LỤC - iv DANH MỤC HÌNH - vii DANH MỤC BẢNG x MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU - 1.1 Tổng quan L-asparaginase…………………………………………………… 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Cấu trúc L-asparaginase 1.1.4 Cơ chế phản ứng L-asparaginase - 1.1.5 Các nguồn L-asparaginase 1.1.6 Ứng dụng - 1.2 L-asparaginase điều trị ung thƣ máu…………………………………….11 1.2.1 Tổng quan bệnh ung thư máu 11 1.2.2 Cơ chế hoạt động L-asparaginase điều trị ung thư - 14 1.2.3 Ứng dụng L-asparaginase điều trị bệnh nhân bị ung thư bạch cầu 17 1.2.4 Các dạng asparaginase sử dụng điều trị - 19 1.2.5 Các vấn đề liên quan đến ứng dụng lâm sàng asparaginase từ vi khuẩn - 20 1.2.6 Mẫn cảm với asparaginase từ Escherichia coli trì hiệu điều trị sau thay Erwinia-asparaginase 22 1.3 Tình hình nghiên cứu L-asparaginase………………………………………….23 1.3.1 Trên giới 23 1.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 35 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 37 2.1 Vật liệu…………………………………………………………………………….37 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu - 37 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 37 2.1.3 Các plasmid mồi - 37 iv 2.1.4 Các chủng vi khuẩn tế bào 38 2.1.5 Môi trường nuôi cấy 39 2.1.6 Hóa chất - 39 2.1.7 Thiết bị thí nghiệm 41 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu… 41 2.2.1 Thiết kế plasmid biểu - 41 2.2.2 Nuôi biểu 44 2.2.3 Xác định hoạt tính L-asparaginase 45 2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố đơn lẻ tới sinh tổng hợp enzyme 46 2.2.5 Tối ưu phương pháp đáp ứng bề mặt - 48 2.2.6 Tinh protein tái tổ hợp 49 2.2.7 Nhận dạng protein tái tổ hợp phương pháp MALDI -TOF - 51 2.2.8 Đánh giá tính chất lý hóa enzyme 52 2.2.9 Xác định hoạt tính ức chế sinh trưởng với dòng tế bào ung thư - 53 2.2.10 Phương pháp xử lý số liệu 56 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU - 58 3.1 Nghiên cứu biểu L-asparaginase tái tổ hợp từ Erwinia chrysanthemi 58 3.1.1 Tối ưu trình tự gene - 58 3.1.2 Thiết kế plasmid pE22aspg biểu E coli - 61 3.1.3 Thiết kế plasmid pE21maspg biểu E coli - 64 3.1.4 Thiết kế plasmid pE21maspg-nonhis biểu E coli 67 3.2 Tối ƣu điều kiện biểu cho sinh tổng hợp L-asparaginase tái tổ hợp…… 70 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng IPTG - 71 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ tiếp giống 71 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ ampicillin trước cảm ứng - 72 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu môi trường biểu 73 3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon bổ sung - 74 3.2.6 Khảo sát ảnh hưởng ion khoáng bổ sung 74 3.2.7 Tối ưu hóa điều kiện biểu rASPG tái tổ hợp phương pháp đáp ứng bề mặt - 75 3.3 Đánh giá tính chất lý hóa rASPG khơng có 6xHis ……………………… 79 v 3.3.1 Tinh rASPG từ E coli/pE21maspg-nonhis 79 3.3.2 Nhận diện enzyme tái tổ hợp phân tích khối phổ MALDI-TOF - 81 3.3.3 Động học enzyme - 84 3.3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ pH phản ứng tới hoạt độ rASPG - 84 3.3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ pH tới độ bền rASPG - 86 3.3.6 Ảnh hưởng EDTA số ion kim loại lên hoạt tính rASPG 87 3.3.7 Ảnh hưởng chất hoạt động bề mặt tới hoạt tính rASPG 87 3.3.8 Ảnh hưởng Dithiothreitol tới hoạt tính rASPG - 88 3.4 Nghiên cứu hoạt tính ức chế tế bào ung thƣ rASPG…………………… 88 3.4.1 Ảnh hưởng rASPG tới tế bào ung thư bạch cầu lympho chuột P388 - 89 3.4.2 Ảnh hưởng rASPG tới tế bào ung thư tủy chuột P3X63Ag8 - 90 3.4.3 Ảnh hưởng rASPG tới tế bào ung thư tủy chuột SP2/0-Ag14 - 91 3.4.4 Ảnh hưởng rASPG tới tế bào ung thư tủy mãn người K562 - 92 3.4.5 Ảnh hưởng rASPG tới tế bào ung thư nguyên bào tủy cấp người HL60 - 93 3.4.6 Ảnh hưởng rASPG tới tế bào ung thư máu lympho người Jurkat 95 3.4.7 Ảnh hưởng rASPG tới tế bào ung thư quản người Hep2 - 97 3.4.8 Ảnh hưởng rASPG tới tế bào thường 98 CHƢƠNG BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU - 99 4.1 Nghiên cứu lựa chọn hệ vector biểu L-asparaginase…………………… 99 4.2 Nghiên cứu tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp rASPG ………………………103 4.3 Đánh giá tính chất enzyme ……………………………………………… 108 4.4 Hoạt tính ức chế sinh trƣởng rASPG số dòng tế bào ung thƣ 114 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ -118 NHỮNG CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI ……………………………………………………………………………………120 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH -121 TÀI LIỆU THAM KHẢO 131 PHẦN PHỤ LỤC - vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Phản ứng xúc tác enzyme L-asparaginase Hình 1.2 Phân loại L-asparaginase Hình 1.3 Cấu trúc tetramer (A) mononer (B) L-asparaginase Hình 1.4 Cơ chế phản ứng chung xúc tác L-asparaginase… Hình 1.5 Tế bào máu bình thường tế bào máu ung thư 12 Hình 1.6 Cơ chế kháng tế bào ung thư L-asparaginase .15 Hình 1.7 Một số biệt dược L-asparaginase sử dụng 20 Hình 2.1 Đường chuẩn NH3 45 Hình 2.2 Đường chuẩn BSA .51 Hình 2.3 Đồ thị phụ thuộc tốc độ phản ứng vào nồng độ chất theo Lineweaver-Burk 52 Hình 2.4 Sơ đồ quy trình nghiên cứu 58 Hình 3.1 Biểu đồ số thơng số gene sau tối ưu 59 Hình 3.2 So sánh trình tự trước (X12746) sau tối ưu codon ( aspg) thuật toán OptimumGene TM 60 Hình 3.3 Trình tự amino acid suy diễn L-asparaginase .61 Hình 3.4 Thiết kế plasmid pE22aspg 62 Hình 3.5 Cấu trúc biểu pE22aspg 63 Hình 3.6 Biểu pE22aspg E coli BL21(DE3) 63 Hình 3.7 Thiết kế plasmid pE21maspg .64 Hình 3.8 Cấu trúc biểu pE21maspg 65 Hình 3.9 SDS-PAGE protein tổng số E coli tái tổ hợp mang plasmid pE21maspg 66 Hình 3.10 Tinh rASPG từ E coli/pE21maspg cột ProBond Nikel 66 Hình 3.11 Thiết kế plasmid pE21maspg-nonhis 68 Hình 3.12 Cấu trúc biểu pE21maspg-nonhis .68 vii Hình 3.13 Biểu pE21maspg-nonhis E coli BL21(DE3) 69 Hình 3.14 Điện di SDS_PAGE đánh giá mức độ biểu dạng tan rASPG…… 70 Hình 3.15 Ảnh hưởng nồng độ IPTG đến tổng hợp rASPG .71 Hình 3.16 Ảnh hưởng nồng độ tiếp giống đến tổng hợp rASPG .72 Hình 3.17 Ảnh hưởng nồng độ ampicillin đến tổng hợp rASPG .73 Hình 3.18 Ảnh hưởng pH ban đầu tới tổng hợp enzyme 73 Hình 3.19 Ảnh hưởng số nguồn Carbon đến tổng hợp rASPG 74 Hình 3.20 Ảnh hưởng số ion tới tổng hợp rASPG 74 Hình 3.21 Biểu đồ đường đông mức thể tương tác tham số 77 Hình 3.22 SDS-PAGE mẫu biểu điểm tối ưu 78 Hình 3.23 SDS_PAGE mẫu rASPG qua cột Sephacryl S-20 79 Hình 3.24 SDS-PAGE rASPG qua cột DEAE-Sepharose 81 Hình 3.25 Phổ khối ion phân đoạn peptide .82 Hình 3.26 So sánh độ tương đồng trình tự ba đoạn peptide thu (peptide) với L-asparaginase từ GenBank (WP-039108651) .83 Hình 3.27 Đồ thị biến thiên vận tốc phản ứng rASPG theo nồng độ chất L-asparagine 84 Hình 3.28 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt tính enzyme 85 Hình 3.29 Ảnh hưởng pH tới hoạt tính enzyme 85 Hình 3.30 Ảnh hưởng nhiệt độ tới độ bền enzyme 86 Hình 3.31 Ảnh hưởng pH tới độ bền enzyme 86 Hình 3.32 Ảnh hưởng ion kim loại tới hoạt độ enzyme 87 Hình 3.33 Mối tương quan nồng độ rASPG thử nghiệm % tế bào ung thư bạch cầu lympho chuột P388 sống sót sau 72 90 Hình 3.34 Mối tương quan nồng độ rASPG thử nghiệm % tế bào ung thư tủy P3X63Ag8 sống sót sau 72 .90 Hình 3.35 Mối tương quan nồng độ rASPG thử nghiệm % tế bào ung thư tủy SP2/0-Ag14 sống sót sau 72 91 viii Phụ lục Khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu môi trường nuôi cấy tới sinh tổng hợp rASPG pH Phụ lục Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon tới sinh tổng hợp rASPG, Nguồn C Lactose Fructose Glucose Maltose LB Phụ lục Khảo sát ảnh hưởng nguồn ion tới sinh tổng hợp rASPG, Khoáng KCl MgCl2 NaCl KH2PO4 Phụ lục 10 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt độ rASPG, Nhiệt độ 25 30 35 37 45 55 65 Phụ lục 11 Ảnh hưởng pH tới hoạt độ rASPG, Đệm Acetat Phosphat Tris-HCL Phụ lục 12 Ảnh hưởng nhiệt độ tới độ bền rASPG, Nhiệt độ (°C) 55 45 37 Phụ lục 13 Ảnh hưởng pH tới độ bền rASPG, pH Phụ lục 14 Ảnh hưởng EDTA ion kim loại tới hoạt độ rASPG Ion kim HT loại (U None 317 Mg2+ 335 Na+ 297 Ni2+ 276 EDTA 235 K+ 279 Fe3+ Ca2+ Fe2+ Ba2+ Cu2+ Al3+ Mn2+ Hg2+ Pb2+ Zn2+ Phụ lục 15 Ảnh hưởng chất hoạt động bề mặt tới hoạt độ rASPG Nồng Chất hoạt động độ bề mặt ĐC Tween 20 1% Tween 80 Trixton X100 Trixton X114 Tween 20 5% Tween 80 Trixton X100 Trixton X114 Phụ lục 16 Ảnh hưởng DTT tới hoạt độ enzyme DTT Chất Nồng thử độ 0,1 mM 0,5 mM mM mM Phụ lục 17 Đồ thị hàm lượng protein phân đoạn rASPG tinh qua cột Sephacryl S-200 Phụ lục 18 Đồ thị hàm lượng protein phân đoạn rASPG tinh qua cột DEAE-Sepharose 10 Điểm có ý nghĩa cho rASPG Phụ lục 19 Biểu đồ điểm số Mascot Điểm số Ion -10*Log (P), P sắc xuất tuyệt đối, Điểm số (score) > 44 có ý nghĩa (p