VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ HIỀN TRANG BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƯ MÁU CỦA ENZYME L-ASPARAGINASE TÁI TỔ HỢP TỪ Erwinia chrysanthemi Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 42 01 07 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2019 Cơng trình hồn thành tại: Viện Cơng nghệ sinh học - Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam Người hướng dẫn khoa học:TS Đỗ Thị Tuyên Viện Công nghệ sinh học PGS TS Quyền Đình Thi Viện Cơng nghệ sinh học Phản biện 1: ……………………………… Phản biện 2: ……………………………… Phản biện 3: ……………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án phiên thức Họp tại: Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Vào hồi phút, ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia - Thư viện Viện Công nghệ sinh học - Webside: http://luanvan.moet.gov.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề L-asparaginase (EC.3.5.1.1; L-asparagine amino-hydrolase) enzyme phân hủy L-asparagine - chất dinh dưỡng quan trọng tế bào ung thư Lasparaginase thủy phân nguồn asparagine bên tế bào buộc tế bào dựa hoàn tồn vào chúng tự tổng hợp Tế bào bình thường gần khơng cần nhiều asparagine để tồn tự tổng hợp asparagine nhờ asparagine synthetase bị ảnh hưởng Trong tế bào ung thư ung thư máu khơng có asparagine synthetase để tổng hợp asparagine, chúng lại cần nhiều asparagine cho phát triển khổng lồ chúng chúng dễ dàng bị tiêu diệt điều trị L-asparaginase Ung thư máu loại ung thư phổ biến trẻ em với ba phần tư trường hợp bệnh loại bạch cầu lympho cấp Hiện L-asparaginase thuốc thiếu phác đồ hóa trị liệu bạch cầu cấp dòng lympho cho trẻ em người lớn Tuy nhiên L- asparaginase có nguồn gốc tự nhiên từ Escherichia coli sử dụng dẫn đến nhiều phản ứng mẫn trình điều trị Vì vậy, Lasparaginase từ Erwinia chrysanthemi dùng để thay trường hợp xuất phản ứng mẫn sản xuất kháng thể kháng L-asparaginse từ E coli Sử dụng công nghệ tái tổ hợp sản xuất L-asparaginase ngày quan tâm biết rõ đặc tính sinh học, gây tác dụng phụ, lực cao với chất độc tính thấp Các đặc tính động học cho thấy L-asparaginase tái tổ hợp kết hợp lợi L-asparaginase II từ Erw chrysanthemi E coli Chính đề tài “Biểu nghiên cứu hoạt tính ức chế tế bào ung thư máu enzyme L-asparaginase tái tổ hợp từ Erwinia chrysanthemi” chúng tơi tiến hành thực Mục đích nghiên cứu Biểu L-asparaginase tái tổ hợp từ Erw chrysanthemi có hoạt tính ức chế sinh trưởng với tế bào ung thư máu hệ biểu E coli với suất cao Nội dung nghiên cứu  Thiết kế hệ biểu gene aspg mã hóa L-asparaginase II từ Erw chrysanthemi E coli có hoạt tính L-asparaginase tái tổ hợp cao;  Tối ưu điều kiện biểu thành phần môi trường để suất sinh tổng hợp L-asparaginase tái tổ hợp đạt cao nhất;  Tinh L-asparaginase tái tổ hợp; nhận diện enzyme tái tổ hợp  Xác định số tính chất lý hóa L-asparaginase tái tổ hợp  Đánh giá khả ức chế sinh trưởng L-asparaginase tái tổ hợp số dòng tế bào ung thư;  Đánh giá ảnh hưởng L-asparaginase tới tế bào thường Những đóng góp luận án i Đã thiết kế, biểu thu nhận thành công E coli L-asparaginase tái tổ hợp có hoạt độ cao đạt 354 IU/mg dựa trình tự gene gốc có mã số X12746 GenBank mã hóa cho L-asparaginase II từ Erw chrysanthemi ii L-asparaginase tái tổ hợp thu có khả ức chế sinh trưởng sáu dòng tế bào ung thư máu nghiên cứu Trong dòng tế bào ung thư tủy xương chuột SP2/0-Ag14, P3X63Ag8 tế bào ung thư bạch huyết P388 giá trị IC 50 đạt xấp xỉ 50 µg/ml Nhạy cảm với dòng tế bào ung thư nguyên bào tủy cấp người HL60 với IC50 đạt 1,14 µg/ml mạnh chế phẩm thương mại ONCOGINASE Với dòng ung thư bạch cầu lympho người Jurkat enzyme thể hoạt tính ức chế sinh trưởng tương đương với chế phẩm thương mại ONCOGINASE Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Về khoa học: Kết nghiên cứu luận án cung cấp dẫn liệu khoa học nghiên cứu biểu L-asparaginase tái tổ hợp củng cố thêm sở khoa học hướng lựa chọn hệ vector điều kiện biểu thích hợp để enzyme tái tổ hợp đạt hoạt tính cao Về ý nghĩa thực tiễn: Những kết thu thành phần môi trường điều kiện biểu tối ưu giúp lên men lượng lớn sản xuất L-asparaginase tái tổ hợp, đặc điểm hóa sinh L-asparaginase tái tổ hợp giúp định hướng ứng dụng sử dụng L-asparaginase * Cấu trúc luận án: Luận án gồm 147 trang (cả tài liệu tham khảo), 18 bảng 55 hình chia thành chương, phần: Mở đầu (3 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu 32 trang; Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu (21 trang); Chương 3: Kết nghiên cứu (42 trang); Chương 4: Bàn luận (19 trang); Kết luận đề nghị (2 trang); Tóm tắt tiếng Anh (9 trang); Các cơng trình cơng bố liên quan đến luận án (1 trang); Tài liệu tham khảo (16 trang, gồm tài liệu tiếng Việt 181 tài liệu tiếng Anh); Phụ lục (15 trang) CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tham khảo tài liệu tiếng Việt 175 tài liệu tiếng Anh để tổng kết nội dung có liên quan, bao gồm: (1) Tổng quan L-asparaginase; (2) L- asparaginase điều trị ung thư máu; (3) Tình hình nghiên cứu trong, ngồi nước L-asparaginase (ASPG) (EC.3.5.1.1; L-asparagine amino-hydrolase) enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân L-asparagine thành aspatic acid L-asparaginase diện nhiều mô động vật, vi khuẩn, thực vật, huyết số động vật gặm nhấm, người L-asparaginase chia thành họ: L-asparaginase vi khuẩn, L-asparaginase thực vật L-asparaginase tương tự L-asparaginase Rhizobium etli asparaginase L-asparaginase từ vi khuẩn gồm hai dạng, dạng I tồn bào tương dạng II tồn khoang chu chất vi khuẩn có lực với asparagin cao so với dạng I Trình tự amino acid L-asparaginase dạng I dạng II tương tự nhau, hầu hết trình tự amino acid quanh trung tâm hoạt động bảo thủ Sự khác cấu trúc 3D L-asparaginase giải thích dạng I có lực với asparagine thấp so với dạng II Loại L-asparaginase khác dùng cho mục đích cơng nghiệp dược phẩm khác Trong thực phẩm, L-asparaginase I sử dụng để làm giảm hình thành acrylamide – chất nghi ngờ gây ung thư Trong dược phẩm, L-asparaginase II dùng để điều trị ung thư bạch cầu L-asparaginase tách từ E coli hoạt động tetramer tiểu đơn vị giống hệt nhau, gồm 222 đối xứng có vị trí hoạt động Mỗi đơn vị có trọng lượng phân tử khoảng 35,6 kDa Mặc dù L-asparaginase có từ nhiều nguồn có hai nguồn asparaginase sử dụng y tế L-asparaginas từ E coli Erw chrysanthemi asparaginase dẫn xuất chúng L-asparaginase từ Erw chrysanthermy dùng để thay trường hợp dị ứng với L-asparaginse từ E coli Việc phân lập sàng lọc loại vi khuẩn có khả sinh trưởng nhanh khơng độc với mơi trường, có tính chất miễn dịch học ngăn cản phản ứng q mẫn ln nhu cầu cần thiết Các chủng xạ khuẩn biển nguồn tiềm cho Lasparaginase hoạt tính cao Pradhan cộng phân lập lồi vi khuẩn Bacillus subtilis hswx88 từ suối nước nóng có khả sinh tổng hợp Lasparaginase ngoại bào từ có hoạt tính đạt 23,8 IU/mL Sun cộng tìm dạng L-aspraginase II từ vi Aquabacterium sp A7-Y gồm 319 amino acid, tương đồng 35% so với L-asparaginase II từ E coli, có hoạt tính đặc hiệu cao đạt 458,9 U/mg … L-asparaginase tái tổ hợp sản xuất ứng dụng sinh học phân tử kỹ thuật di truyền từ sớm Bahreini cộng nhân dòng Lasparaginase từ E coli K12 biểu E coli BL21 pLysS (DE3) enzyme tái tổ hợp tinh cho hoạt tính riêng đạt 116,9 U/mg Sindhu cộng nghiên cứu nhân dòng dạng L-asparaginase khác từ Pseudomonas fluorescens MTCC 8127 biểu E coli BL21(DE3 L-asparaginase tinh có hoạt tính riêng đạt 26 U/mg L-asparaginase từ B subtilis 11-06 biểu B subtilis 168 cho hoạt tính enzyme tái tổ hợp 9,98 U/ml Lasparaginase II từ chủng S cerevisiae nghiên cưú P pasptoris điều khiển promoter AOX1 L-asparaginase tái tổ hợp có hoạt tính ức chế sinh trưởng dòng tế bào ung thư máu K562 Cho đến Việt Nam có vài công bố L-asparaginase Nghiên cứu Ngô Kế Sương cộng sàng lọc hai chủng E coli tự nhiên có hoạt tính L-asparaginase 0,08 0,1 IU/mg tế bào Và nghiên cứu Nguyễn Thanh Ngọc cộng đã biểu thành cơng gene mã hóa L-asparaginase I A oryzae Pichia pastoris nhằm nghiên cứu quy trình sản xuất asparaginase tái tổ hợp, ứng dụng giảm lượng acrylamide tạo thành sản xuất bánh nướng Nghiên cứu phát triển theo hướng sản xuất L-asparaginase II tái tổ hợp từ Erw chrysanthemy E coli để ứng dụng sản xuất thuốc điều trị ung thư máu 2.1 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu hóa chất nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu L-asparaginase II từ Erw chrysanthemi Dựa trình tự gene gốc mã số X12746 GenBank mã hóa cho L-asparaginase II từ Erw chrysanthemi NCPBB1125, gene aspg tối ưu codon cho phù hợp với hệ biểu E coli tổng hợp GenScripGene USA Vector pET22b(+), pET21a(-) dùng cho biểu L-asparaginase E coli Chủng E coli DH10B dùng cho nhân dòng Chủng E coli BL21(DE3) (Invitrogen) sử dụng cho biểu Dòng tế bào thường NHI/3T3, ba dòng tế bào ung thư máu: tế bào ung thư bạch huyết chuột P388, tế bào ung thư tủy chuột P3X63Ag8 SP2/0Ag14 cung cấp từ phòng Thử nghiệm sinh học_Viện Công nghệ sinh học, tế bào ung thư nguyên bào tủy cấp người HL60 tế bào ung thư bạch cầu lympho người Jurkat cung cấp từ phòng Cơng nghệ tế bào động vật-Viện Cơng nghệ sinh học; tế bào ung thư tủy mãn người K562 (ATCC, Mỹ) Trường Đại Học Khoa học Tự nhiên cung cấp, tế bào ung thư quản người Hep2 (ATCC, Mỹ) Học Viên Quân Y cung cấp Các mồi tổng hợp Bioneer (Hàn Quốc) liệt kê Bảng 2.1 Hóa chất thí nghiệm dạng tinh khiết mua từ hãng hóa chất có uy tín Sigma, Invitrogen, Thermo (Mỹ), Qiagen, Bio basic (Canada), Merck (Đức) Các dung dịch đệm dùng cho thí nghiệm pha theo hướng dẫn thí nghiệm chuẩn Các thiết bị sử dụng làm thí nghiệm có độ xác cao thuộc Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Bảng 2.1 Các mồi dùng thiết kế plasmid Tên mồi L-ASP F L-ASP R 21 mASP -F LASP-nonhis R 2.2 Trình tự nucleotide 5’→3’ ATT GGA TCC GAT GGA ACG CTG AAG CTC GAG GTA GGT ATG GAA G GCC ATA TGG CCG ATA AAC TGC CGA 5’- AAG CTC GAG TCA GTA GGT ATG GAA G -3 Sản phẩm Gene aspg đầy đủ Gene maspg khơng có signal peptide Gene maspg có chứa mã kết thúc Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp vi sinh Dòng E coli tái tổ hợp mang gen aspg nuôi cấy biểu LB có bổ sung ampicillin cảm ứng IPTG Khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính L-asparaginase tái tổ hợp: nồng độ chất cảm ứng IPTG; nồng độ ampicillin trước cảm ứng; nồng độ giống; pH ban đầu môi trường biểu hiện; nguồn carbon bổ sung; nguồn khống bổ sung Qua chọn thông số nồng độ chất cảm ứng IPTG, tỉ lệ giống tỉ lệ KH2PO4 để tiếp tục tối ưu hoạt tính L-asparaginase tái tổ hợp phương pháp đáp ứng bề mặt 2.2.2 Phương pháp sinh học phân tử Phương pháp PCR; Điện di agarose;Tách chiết, tinh plasmid; Biến nạp plasmid hóa học, biến nạp xung điện; Các kỹ thuật cắt, nối DNA; tham khảo theo Sambrook Ruessell (2001) Giải trình tự phân tích gen theo Sanger (1975) 2.2.3 Phương pháp hóa sinh Tinh L-asparaginase tái tổ hợp sắc ký lực qua cột ProBond resin (Invitrogen), cột sắc ký lọc gel Sephacryl S-200, cột sắc ký trao đổi ion Sepharose DEAE; Chạy điện di gel polyacrylamide (SDS-PAGE) theo phương pháp Lemmli (1970); Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford (1975); Xác định hoạt tính L-asparaginase xác định theo phương pháp Mashburn Wriston 1964 Xác định số tính chất lý hóa enzyme (Động học phản ứng enzyme Ảnh hưởng nhiệt độ pH đến hoạt tính enzyme; Ảnh hưởng nhiệt độ pH đến độ bền enzyme; Ảnh hưởng nồng độ chất đến độ bền enzyme;); Định dạng protein phương pháp MALDI-TOF 2.2.4 Xác định hoạt tính ức chế sinh trưởng với dòng tế bào Nuôi cấy tế bào sử dụng phép thử sinh học theo phương pháp Monks (1991) phương pháp MTS xác định hoạt tính ức chế sinh trưởng tế bào 2.2.5 Phương pháp phân tích số liệu Phần mềm Microsoft Excel sử dụng để xử lý số liệu thu q trình thực nghiệm, tính giá trị tham số thống kê Phần mềm Dolphin 1D dùng để phân tích đánh giá mức độ biểu tinh protein/enzyme Chương trình DNA star dùng để kiểm tra trình tự nucleotide plasmid mang gene L-asparaginase C hương trình Design-Expert 7: xử lý số liệu tối ưu đáp ứng ma trận Phần mềm Table Cuvet sử dụng để tính IC50 3.1 CHƯƠNG KẾT QUẢ Nghiên cứu biểu L-asparaginase tái tổ hợp từ Erwinia chrysanthemi 3.1.1 Tối ưu trình tự gene Với mục tiêu sản xuất L-asparaginase II từ Erw chrysanthemi chúng tơi sử dụng trình tự đoạn gene có mã số X12746 Genebank mã hóa cho Lasparaginase II từ Erw chrysanthemi NCPBB1125 để nhân dòng, thiết kế vector biểu L-asparaginase tái tổ hợp E coli Để mức độ biểu protein tái tổ hợp E coli đạt cao có thể, trình tự X12476 tối ưu codon thuật toán OptimumGene TM Kết phân tích trình tự sau tối ưu cho thấy xu hướng sử dụng codon (codon usage) có số thích nghi codon (CAI: Codon Adaptation index) E coli trung bình đạt 0,87 Đặc biệt tần suất sử dụng ba mức 91-100 đạt 66%.Hàm lượng GC trung bình gene sau tối ưu đạt 54,63 % nằm khoảng tối ưu phân bố đồng toàn gene Các cấu trúc Stem-Loop tác động lên ổn định mRNA bị phá vỡ Gene sau tối ưu khơng chứa trình tự cắt enzyme giới hạn hay sử dụng nhân dòng biểu hiện, đồng thời khơng có yếu tố CIS RBS (AGGAGG); Poly T (TTTTTT); PolyA (AAAAAAA); Chi (GCTGGTGG); T7-Cis (ATCTGTT); SD (GGRGGT) Trình tự gene tối ưu codon cho phù hợp với hệ biểu E coli tổng hợp Genscrip Đoạn gene đầy đủ dài 1044 nucleotide Trình tự 11 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ ampicillin trước cảm ứng Hình 3.9 Ảnh hưởng nồng độ ampicillin đến tổng hợp rASPG Kết hình 3.9 cho thấy tăng nồng độ ampicillin môi trường nuôi cấy chủng tái tổ hợp E coli/ pE21maspg-nonhis trước cảm ứng khơng ảnh hưởng đến hoạt tính L-asparaginase Nồng độ ampicillin 25 µg/ml mặc hoạt tính enzyme cao nhiên nồng độ thấp dẫn đến thối hóa chủng Do chúng tơi lựa chọn nồng độ ampicillin 100 µg/ml cho nghiên cứu 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng pH ban đầu môi trường biểu Kết khảo sát pH ban đầu khoảng từ 5-9, rõ ràng chủng tái tổ hợp thích hợp với pH kiềm 7, 8, 9, pH acid enzyme khơng có hoạt tính sinh trưởng E coli (Hình 3.10) Hình 3.10 Ảnh hưởng pH ban đầu tới tổng hợp enzyme 3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon bổ sung 12 Hình 3.11 Ảnh hưởng số nguồn carbon đến tổng hợp rASPG Kết khảo sát nguồn carbon cho thấy với điều kiện biểu hiện, nguồn carbon bổ sung thêm khơng làm tăng hoạt tính enzyme tái tổ hợp so với khơng bổ sung (Hình 3.11) 3.2.6 Khảo sát ảnh hưởng ion khoáng bổ sung Trong nguồn khoáng khảo sát K P có ảnh hưởng tích cực tới sinh tổng hợp enzyme Hoạt tính enzyme đạt cao có mặt KH 2PO4.(Hình 3.12) Hình 3.12 Ảnh hưởng số nguồn ion tới tổng hợp rASPG Tổng hợp lại yếu tố khảo sát, chọn mơi trường LB, pH bổ sung 100 µg/ml ampicillin điều kiện biểu cố định Yếu tố bổ sung KH2PO4, nồng độ IPTG nồng độ tiếp giống có ảnh hưởng khác đến hoạt tính enzyme tiếp tục tối ưu pháp đáp ứng bề mặt 3.2.7 Tối ưu điều kiện biểu ASPG tái tổ hợp phương pháp đáp ứng bề mặt Bài toán tối ưu sử dụng phần mềm Design–Expert xây dựng phương trình hồi quy mơ tả mối quan hệ hoạt tính L-asparaginase với biến mã hóa sau Y = 95,61 +7,99*A +7,9 *B -21,65*C + 5,56 *A*B + 6,04*B*C - 10,14*A2 Trong đó: Y hoạt tính L-asparaginase (IU/ml); A, B, C biến mã hóa cho nồng độ chất cảm ứng IPTG, tỉ lệ giống tỉ lệ KH2PO4 Trong thí nghiệm, hệ số hồi quy (R2) tính 0,9208, giá trị P < 0,05 (độ tin cậy 95% ) xem ảnh hưởng có ý nghĩa đến hoạt động Lasparaginase Giá trị mơ hình F = 25,19 với P < 0,0001 ngụ ý mơ hình có ý nghĩa Yếu tố thiếu phù hợp khơng có ý nghĩa, tức phản ứng thử nghiệm phù hợp với mơ hình Trong vùng khảo sát, phương trình hồi quy cho thấy hoạt tính enzyme tái tổ hợp chịu ảnh hưởng bậc ba nhân tố nghiên cứu A, B, C, chịu ảnh 13 hưởng đồng thời cặp nhân tố nồng độ chất cảm ứng – tỉ lệ giống (A*B), tỉ lệ giống – tỉ lệ khống KH2PO4 bổ sung (B*C) Mơ hình dự đoán hoạt độ L-asparaginase tái tổ hợp tối đa đạt 123,74 IU/ml giá trị yếu tố nồng độ chất cảm ứng IPTG (1,03 mM), tỷ lệ giống (3%), hàm lượng KH2PO4 bổ sung (0,5% w/v) Để kiểm tra kết mơ hình, tiến hành thí nghiệm với giá trị dự đốn để thu hoạt tính Lasparaginase cực đại Hoạt độ L-asparaginase nhận từ kết thực nghiệm 120 IU/ml, mức độ biểu rASPG tính tốn dựa phần mền Dolphin1D đạt 46 % protein tổng số (Hình 3.13- 1) Sự tương quan chặt chẽ hai kết tính tốn giúp khẳng định tính xác mơ hình tồn điểm tối ưu M kDa 112 66 45 35 25 Hình 3.13 SDS-PAGE mẫu biểu điểm tối ưu 1: E coli/pE21maspg-nonhis biểu điều kiện tối ưu , 2: E coli/pE21maspg-nonhis biểu điều kiện chưa tối ưu, M: Marker protein 3.3 Đánh giá tính chất lý hóa rASPG khơng có 6xHis 3.3.1 Tinh rASPG từ E coli/pE21maspg-nonhis Dịch siêu âm phá tế bào biểu E coli/pE21maspg-nonhis sau ly tâm loại cặn cho qua cột Sephacryl S-200 Các phân đoạn vùng có hàm lượng protein cao xác định hoạt tính enzyme, thu ba phân đoạn S9-S10-S11 có hoạt tính cao (Hình 3.14A ) tiếp tục tinh qua cột DEAE-Sepharose Kết cho thấy enzyme tập trung phân đoạn SD16 SD17 cho hoạt tính đặc hiệu enzyme đạt cao đồng thời kết điện di SDSPAGE cho thấy hai phân đoạn có độ cao, có băng kích thước 37 kDa (Hình 3.14B) 14 M kDa M kDa ← 45 ← 35 ← 45 ← 35 A B Hình 3.14 SDS_PAGE phân đoạn rASPG qua cột Sephacryl S-200 (A) DEAESepharose (B) 1- 4: phân đoạn S9-S12 ; 5-6 : phân đoạn SD16-SD17 Như vậy, rASPG tinh qua cột độ tăng lên 7,82 lần, hiệu suất thu hồi 28,96%, hoạt độ riêng đạt 354,23 IU/mg (Bảng 3.2) Bảng 3.2 Tinh rASPG qua cột Sephacryl S-200 DEAE-Sepharose HĐR Tổng hoạt Hiệu Độ Bước tinh HLPR (mg/ml) (IU/mg) tính (IU) suất (%) Dịch chiết tế bào ± 0,026 45 360 100 Sephacryl S-200 DEAE-Sepharose 0,52 ± 0,005 0,098 ±0,0015 95,34 ± 354,23±7,75 222,12 104,29 61,7 28,96 2,12 7,82 HLPr: Hàm lượng protein; HĐR: Hoạt độ riêng 3.3.2 Nhận diện enzyme tái tổ hợp Để xác định xác enzyme tái tổ hợp có phải L-asparaginase II, băng kích thước 37 kDa phân tích Quang phổ khối MALDI-TOF Kết phân tích MANDI-TOF đoạn peptide sau thủy phân protein trysin ba đoạn peptide tương đồng với L-asparaginase sở liệu NCBI với vị trí tương ứng GVMVVLNDR (vị trí 169-179), GRGVMVVLNDR (vị trí 171-179), TNATSLDTFR (vị trí 189-198) (Hình 3.15);.độ bao phủ chuỗi đạt 6% (relative RMS error =90 ppm), mascot PMF 147 Kết tổng hợp peptide nhận L-asparaginase II có khối lượng: 36777 Da, điểm protein: 117 Với điểm số protein cao, kết tốt có độ xác cao 15 Hình 3.15 So sánh độ tương đồng trình tự ba đoạn peptide thu (peptide) với L-asparaginase từ GenBank (WP-039108651) 3.3.3 Động học enzyme Mối quan hệ tốc độ phản ứng nồng độ chất thể Hình 3.16A sử dụng để xây dựng phương trình tuyến tính Với kết qủa phương trình tuyến tính xây dựng Hình 3.16B Thơng số động học xác định từ đồ thị Lineweaver-Burke Dựa phương trình, Km, Vmax, Kcat Kcat/Km rASPG Erw chrysanthemi biểu E coli với chất L-asparagine 0,5 mM, 500 U/mg, 14,9  103 s-1, 29,9  103 mM-1s-1 A B Hình 3.16 Đồ thị biến thiên vận tốc phản ứng rASPG theo nồng độ chất L-asparagine 3.3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ pH phản ứng tới hoạt độ rASPG Hoạt tính L-asparaginase tăng nhiệt độ tăng từ 25-45°C đạt tối ưu 45°, hoạt tính enzyme bắt đầu giảm nhiệt độ tăng tiếp lên 55-65°C (Hình 3.17A) 16 A B Hình 3.17 Ảnh hưởng nhiệt độ (A) pH (B) tới hoạt tính enzyme Khi nghiên cứu ba dải pH: acid (pH 4-6), trung tính (pH 6,5-8), bazơ (pH 810) nhận thấy L-aspsaraginase tái tổ hợp hoạt động tốt pH trung tính kiềm, đạt tối ưu pH 7,5 (Hình 3.17B) 3.3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ pH tới độ bền rASPG B A Hình 3.18 Ảnh hưởng nhiệt độ (A) pH (B) tới độ bền enzyme Kết kiểm tra độ bền cho thấy rASPG enzyme bền nhiệt Sau 100 phút ủ 37°C hoạt độ enzyme 77%, nhiệt độ tăng lên đến 45 55°C enzyme bền hơn, sau 100 phút hoạt độ enzyme 38,7 39,5% (Hình 3.18A) Với dải pH trung tính 6-7-8, hoạt tính enzyme tương đối bền sau 100 phút ủ pH 6, 7, enzyme trì 80% hoạt độ (Hình 3.18B) 3.3.6 Ảnh hưởng EDTA số ion kim loại lên hoạt tính rASPG Mẫu rASPG tinh ủ 30 phút 30°C với EDTA ion kim loại nồng độ 10 mM Kết cho thấy ion kim loại, Pb 2+, Mg2+, Ba2+, Fe2+, làm hoạt độ enzyme tăng nhẹ, ion Mn2+ làm hoạt độ enzyme tăng mạnh 23% hoạt độ Các ion kim loại Na+, K+, Fe3+, Ca2+, Ni+, Al3+, Cu2+, Hg2+ ức chế hoạt tính enzyme ion Hg+ ức chế mạnh làm giảm 27% hoạt độ EDTA làm giảm 28% hoạt độ enzyme (Hình 3.19) 17 Hình 3.19 Ảnh hưởng ion kim loại tới hoạt độ enzyme 3.3.7 Ảnh hưởng chất hoạt động bề mặt tới hoạt tính rASPG Với rASPG chất hoạt động bề mặt nghiên cứu làm giảm hoạt tính enzyme, nồng độ cao mức độ ức chế cao nồng độ thấp (Bảng 3.3) Bảng 3.3 Ảnh hưởng chất hoạt động bề mặt tới hoạt độ enzyme Chất hoạt động bề mặt Hoạt độ lại (%) nồng độ chất hoạt động bề mặt (%) 1% 5% Tween 20 87,65 ± Tween 80 54,35 ± Triton X-100 47,91 ± 31 ± 12 Triton X-114 45,76 ± 3.3.8 Ảnh hưởng Dithiothreitol tới hoạt tính rASPG Ở nồng độ thấp 0,1-0,5 mM DTT không ảnh hưởng tới hoạt độ enzyme, nồng độ mM, DTT làm hoạt độ enzyme tăng 46%, nhiên tăng nồng độ DTT lên đến mM hoạt độ enzyme tăng 11% (Bảng 3.4) Bảng 3.4 Ảnh hưởng DTT tới hoạt độ rASPG Nồng độ DTT (mM) Hoạt độ L- asparaginase lại (%) 0,1 98,10 ± 1,39 0,5 109,89 ± 4,17 146,57 ± 11,58 119,06 ± 9,73 18 3.4 Xác định hoạt tính ức chế sinh trưởng rASPG với dòng tế bào Chúng tơi kiểm tra ảnh hưởng rASPG dòng tế bào ung thư Bảng Bảng 3.5 Các dòng tế bào ung thư tiến hành thử nghiệm hoạt tính rASPG STT Loại tế bào ung thư Ung thư tủy mãn người (chronic myelogenous leukemia) Ung thư nguyên bào tủy cấp người (acute promyelocytic leukemia) Ung thư bạch cầu lympho người Ung thư bạch huyết chuột (lymphoma cell line) Ung thư tủy xương chuột (myeloma cell line) Ung thư tủy xương chuột (myeloma cell line) Ung thư quản người Dòng K562 HL60 Jurkat P388 P3X63Ag8 SP2/0-Ag14 Hep2 3.4.1 Ảnh hưởng rASPG tới tế bào ung thư bạch cầu lympho chuột P388 rASPG thử nghiệm dòng tế bào ung thư máu chuột P388 với nồng độ: 0,4; 2; 10; 50 µg/ml Kết thử nghiệm với dòng tế bào ung thư bạch cầu lympho chuột P388 cho thấy với nồng độ 0,4 µg/ml rASPG khơng gây ảnh hưởng tới tế bào ung thư P388, nồng độ µg/ml rASPG làm ức chế 8,23% tế bào P388,và nồng độ 10 µg/ml rASPG mật độ tế bào giảm rõ ràng tương ứng 19,45% tế bào bị ức chế Ở nồng độ cao 50 µg/ml rASPG tế bào bị ức chế 48,22% 3.4.2 Ảnh hưởng rASPG tới tế bào ung thư tủy chuột P3X63Ag8 Kết thử nghiệm với tế bào ung thư tủy chuột P3X63Ag8 cho thấy rASPG ức chế sinh trưởng tế bào ung thư P3X63Ag8 với mức độ khác nhau, số tế bào bị chết tăng dần bổ sung rASPG với nồng độ tăng dần.; nồng độ 50 µg/ml rASPG mật độ tế bào giảm rõ rệt 53,68 % tế bào bị ức chế Từ nồng độ rASPG thử dòng tế bào P3X63Ag8, giá trị IC 50 rASPG với dòng tế bào P3X63Ag8 xác định 41,67 µg/ml 3.4.3 Ảnh hưởng rASPG tới tế bào ung thư tủy chuột SP2/0-Ag14 Với nồng độ 0,4 µg/ml rASPG gây ảnh hưởng không đáng kể tới tế bào ung thư tủy SP2/0-Ag14 Tại nồng độ µg/ml rASPG ức chế 8,23% tế bào Khi nồng độ tăng lên đến 10 µg/ml rASPG mật độ tế bào bắt đầu giảm tương ứng với 19,45 % tế bào bị ức chế, nồng độ 50 µg/ml rASPG mật độ tế bào giảm rõ 19 rệt 51,22 % tế bào bị ức chế Giá trị IC 50 rASPG với dòng tế bào SP2/0-Ag14 xác định 48,09 µg/ml 3.4.4 Ảnh hưởng rASPG tới tế bào ung thư tủy mãn người K562 L-asparaginase tái tổ hợp tiến hành thử nghiệm dòng tế bào ung thư máu K562 với dải nồng độ 2,656 đến 85 µg/ml để so sánh hiệu tác động.Ở nồng độ thấp 2-21 µg/ml rASPG ức chế 7-15% tế bào, nồng độ cao bắt đầu quan sát thấy số lượng tế bào giảm rõ rệt, nhiên mức ức chế thấp nồng độ 85 µg/ml rASPG hiệu ức chế đạt 25% so với đối chứng Đối chứng âm rASPG nồng độ 85 µg/ml Hình 3.20 Hình ảnh tế bào K562 thử nghiệm rASPG sau 72 Độ phóng đại 560x Hình ảnh tế bào cho thấy hình dạng tế bào khơng bị thay đổi mật độ tế bào mẫu có bổ sung rASPG giảm rõ so với mẫu đối chứng không bổ sung rASPG (Hình 3.20) 3.4.5 Ảnh hưởng rASPG tới tế bào ung thư nguyên bào tủy cấp người HL60 Tế bào ung nguyên bào tủy cấp người HL60 thử nghiệm với rASPG, đồng thời thử nghiệm đối chứng dương sản phẩm thuốc L-asparaginase từ E coli -ONCOGINASE theo nồng độ tăng dần từ 6,25; 12,5; 25; 50; 100; 200 µg/ml Hình ảnh tế bào cho thấy mật độ tế bào mẫu bổ sung rASPG giảm rõ rệt so với mẫu nuôi cấy không bổ sung enzyme (Đối chứng âm) Kết xác định tỉ lệ ức chế sinh trưởng sau 72h cho thấy dải nồng độ từ 0-50 µg/ml rASPG ức chế tế bào HL60 với hiệu tương đương sản phẩm thuốc ONCOGINASE (Hình 3.21) Từ nồng độ ức chế xác định giá trị IC 50 rASPG với dòng HL60 1,14 µg/ml, ONCOGINASE 32,82 µg/ml 20 A B C Hình 3.21: Tác động rASPG tới dòng tế bào HL60 A: Tế bào HL60 đối chứng âm; B: Tế bào HL60 sau 72h ủ với 50 µg/ml rASPG (độ phóng đại 100x); C: mối tương quan nồng độ rASPG ONCOGINASE thử nghiệm % tế bào ung thư máu HL60 sống sót sau 72 3.4.6 Ảnh hưởng rASPG tới tế bào ung thư bạch cầu lympho người Jurkat rASPG tiến hành thử nghiệm đồng thời với ONCOGINASE dòng tế bào ung thư máu Jurkat với nồng độ 6,26; 12,5; 25; 50 100 µg/ml Tại nồng độ 6,25 µg/ml rASPG ức chế 34% tế bào, ONCOGINASE ức chế 25% tế bào so với mẫu không bổ sung Khi nồng độ rASPG ONCOGINASE tăng lên đến mức 100 µg/ml cho tỉ lệ tế bào bị ức chế 38,59 39,58 % (Hình 3.22 C) Trên hình ảnh tế bào thử nghiệm quan sát rõ mật độ tế bào mẫu bổ sung rASPG giảm hẳn so với mẫu tế bào nuôi cấy bình thường khơng bổ sung enzyme (Đối chứng âm) (Hình 3.22 A_B) C A B Hình 3.22: Tác động rASPG tới dòng tế bào Jurkat A: Tế bào Jurkat đối chứng âm; B: Tế bào Jurkat sau 72h ủ với 50 µg/ml rASPG (độ phóng đại 100x) ; C: mối tương quan nồng độ rASPG ONCOGINASE thử nghiệm % tế bào ung thư 21 máu Jurkat sống sót sau 72 3.4.7 Ảnh hưởng rASPG tới tế bào ung thư quản người Hep2 Tế bào ung thư quản Hep2 thử nghiệm cách bổ sung rASPG nồng độ 40, 50, 60, 70, 80 µg/ml 72 Kết cho thấy sau 72 mật độ tế bào Hep2 mẫu thí nghiệm khơng khác không khác so với đối chứng Như qua dòng tế bào ung thư bạch cầu thử nghiệm chứng tỏ rASPG có hoạt tính ức chế phát triển dòng tế bào Kết sử dụng phần mềm Table cuvet để xác định giá trị IC 50 cho thấy rASPG thể hoạt tính hai dòng tế bào ung thư máu SP2/0-Ag14 P3X63Ag8 với giá trị IC50 48,09 41,67 µg/ml tương ứng 17 IU/ml 14,75 IU/ml Với dòng P388, HL60, K562 IC50 > 50 µg/ml Với dòng tế bào ung thư quản Hep2 không xác định IC50 3.4.8 Ảnh hưởng rASPG tới tế bào thường Kết cho thấy rASPG không gây độc cho tế bào NIH/3T3, nồng độ nghiên cứu cao 50 µg/ml rASPG ức chế 18,2% tế bào, tức có ảnh hưởng nhẹ tới tế bào thường Kết kiểm tra hình ảnh tế bào cho thấy rASPG ảnh hưởng khơng đáng kể tới tế bào thường, hình ảnh tế bào không thay đổi nhiều so với đối chứng âm CHƯƠNG BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Trong q trình nghiên cứu chúng tơi thiết kế ba hệ thống plasmid (1) pE22aspg: vector biểu pET22b(+) mang gene aspg nguyên vẹn; (2) pE21maspg: vector biểu pET21a(+) mang gene maspg mã hóa cho ASPG trưởng thành khơng mang đoạn signal peptide; (3): pE21maspg-nonhis: vector biểu pET21a(+) mang gene maspg protein tái tổ hợp không chứa đuôi 6xhis vector Kết khơng tìm thấy biểu L-asparaginase chủng tái tổ hợp tức đoạn gene aspg đầy đủ không biểu E coli BL21(DE3) Sau cắt signal peptide, đoạn gene maspg chèn vào vector pET21a(+) biểu thành công E coli BL21(DE3) với mức độ biểu rASPG cao đạt 75% protein tổng số Như việc loại bỏ signal peptide cần thiết để ASPG biểu Tuy nhiên hoạt tính enzyme thấp đạt IU/mg protein tổng số chúng tơi thiết kế hệ biểu pE21maspg-nonhis có điểm kết thúc trước đuôi Histag, enzyme tái tổ hợp thu có hoạt tính tăng vượt mức 30 lần đạt 22 30 IU/mg protein tổng số Như việc loại bỏ histag cần thiếu để enzyme trở dạng hoạt động Do enzyme tái tổ hợp khơng mang His sử dụng cho nghiên cứu Các yếu tố nồng độ giống, nồng độ chất cảm ứng IPTG tỉ lệ khoáng KH2PO4 bổ sung vào mơi trường có ảnh hưởng đến suất sản xuất L-asparaginase tối ưu phương pháp đáp ứng bề mặt thiết lập phương trình tối ưu Nồng độ chất cảm ứng có ảnh hưởng tích cực bậc hoạt tính L-asparaginase tái tổ hợp lại có ảnh hưởng tiêu cực bậc hoạt tính enzyme Tỉ lệ KH2PO4 bổ sung có ảnh hưởng tiêu cực lớn hoạt tính enzyme Tỉ lệ giống có ảnh hưởng tích cực hoạt tính L-asparaginase tái tổ hợp Trong vùng khảo sát cặp yếu tố nồng độ chất cảm ứng – tỉ lệ giống (A*B), tỉ lệ giống – tỉ lệ khống KH2PO4 bổ sung (B*C) có ảnh hưởng tích cực tới hoạt tính enzyme Do enzyme tái tổ hợp khơng mang His nên q trình tinh phải sử dụng cột lọc gel Sephacryl S-200 cột trao đổi ion DEAE-Sepharose Enzyme sau tinh qua hai bước có hoạt tính riêng đạt 354 IU/mg, hiệu suất thu hồi 28,96%, độ 7,82 lần so với dịch thô Các thông số động học enzyme với chất L-asparagine cho thấy enzyme đặc hiệu với chất L-asparaginase có tác dụng ức chế sinh trưởng dòng tế bào ung thư máu ung thư thể rắn, nhiên dòng tế bào ung thư máu nhạy cảm với Lasparaginase so với dòng tế bào ung thư thể rắn Trong nghiên cứu chúng tơi L-asparaginase thể hoạt tính tốt với dòng tế bào ung thư HL60 giá trị IC50 đạt 1,14 µg/ml (~ 0,4 IU/ml) cao chế phẩm thuốc L-asparaginase tự nhiên từ E coli - ONCOGINASE có giá trị IC 50 tương ứng đạt 32,825 µg/ml, với hai dòng tế bào ung thư tủy chuột SP2/0-Ag14 P3X63Ag8 với giá trị IC50 tương ứng 48,09 µg/ml (~17 IU/ml) 41,67 µg/ml (~14 IU/ml Với dòng tế bào Jurkat, K562, P388 rASPG thể hoạt tính hơn, nồng độ 50 µg/ml rASPG ức chế 39,67% tế bào Jurkat; nồng độ 80 µg/ml rASPG ức chế 25% tế bào ung thư tủy mãn người K562, 50 µg/ml rASPG ức chế 48,22% P388 Bởi L-asparaginase khơng có tác dụng gây độc làm tế bào chết mà làm cho tế bào ngừng phần chia khơng có đủ L-asparagine cần cho trình tổng hợp protein pha G1 nên enzyme có hiệu với tế bào ung thư bị thiếu hoạt động asparagine synthase Hơn không kiểm tra dư lượng L-asparagine trình ni cấy Dẫn đến kết có khác mức độ hoạt tính ức chế sinh trưởng dòng tế bào ung thư khác nghiên cứu Tuy nhiên với dòng tế bào HL60 lại có khác biệt chế tác dụng nghiên cứu Abakumova cộng dòng tế bào ung thư máu nghiên cứu với dòng HL60 L-asparaginase làm 23 tăng số tế bào chết theo chu kỳ Dòng tế dòng tế bào ung quản Hep2 dòng tế bào ung thư rắn nên nhạy cảm với rASPG, không thấy khác nồng độ rASPG đối chứng Đặc biệt thử nghiệm so sánh rASPG với sản phẩm thương mại ONCOGINASE hai dòng HL60 Jurkat cho thấy xu tác dụng rASPG tương tự ONCOGINSE tức dòng tế bào nhạy cảm với rASPG nhạy cảm với ONCOGINASE hiệu ức chế sinh trưởng rASPG tốt ONCOGINASE KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã biểu thành công L-asparaginase tái tổ hợp từ Erw chrysanthemi đạt hoạt tính cao E coli - Lựa chọn hệ biểu E coli/pE21maspg-nonhis biểu rASPG hoàn chỉnh cắt signal peptide không mang đuôi 6xhis cho hoạt độ enzyme tái tổ hợp cao đạt 30 IU/mg protein tổng số - Điều kiện biểu tối ưu cho sinh tổng hợp L-asparaginase tái tổ hợp với môi trường biểu LB pH bổ sung 100 µg/ml ampicillin, 0,5% (w/v) KH2PO4, tiếp giống 3% (v/v) cảm ứng 1,03 mM IPTG Hoạt tính enzyme thu điểm tối ưu phương trình hồi quy đạt 120 IU/ml - L-asparaginase tái tổ hợp tinh nhận diện xác Lasparaginase II phương pháp MALDI-TOF - L-asparaginase tái tổ hợp có kích thước khoảng 37 kDa, hoạt độ riêng đạt 354 IU/mg với Km, Vmax, Kcat Kcat/Km 0,5 mM, 500 U/mg, 14,9  103 s-1 29,9  103 mM-1s-1 Enzyme hoạt động tối ưu 45°C; pH 7,5; bền pH 6, 7, 8; bền với nhiệt, bị ức chế chất hoạt động bề mặt Tween 20, Tween 80, Trixton X100 Trixton X114, DTT lại có khả làm tăng hoạt tính enzyme Đã xác định hoạt tính ức chế số dòng tế bào ung thư Lasparaginase tái tổ hợp thu - Với dòng tế bào ung thư người Enzyme thể hoạt tính ức chế sinh trưởng tốt dòng tế bào ung thư nguyên bào tủy cấp HL60 với IC50 đạt 1,14 µg/ml , hoạt tính tương đối tốt với tế bào tủy mãn K562 ung thư bạch cầu lympho Jurkat với IC50 >50 µg/ml Với tế bào ung thư quản Hep2 chưa thấy hoạt tính ức chế sinh trưởng 24 - Với dòng tế bào ung thư chuột: enzyme có hoạt tính tốt hai dòng tế bào ung thư tủy xương SP2/0-Ag14 P3X63Ag8 với giá trị IC50 tương ứng 48,09 µg/ml 41,67 µg/ml Dòng tế bào ung thư bạch huyết P388 với giá trị IC50 >50 µg/ml - Với dòng tế bào thường: enzyme ảnh hưởng khơng đáng kể tới dòng tế bào thường NIH/3T3 Kiến nghị Nghiên cứu L-asparaginase tái tổ hợp sở ban đầu cho nghiên cứu chuyên sâu Việt Nam Để hiểu rõ tác dụng L-asparaginase tái tổ hợp liên quan đến điều trị: liều, liệu trình, thời gian sống chủ thể… Tác giả có số kiến nghị sau: Đánh giá tác dụng L-asparaginase tái tổ hợp mơ hình động vật Tiến hành thử nghiệm độc tính cấp, độc tính bán trường diễn CÁC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyen Thi Hien Trang, Do Thi Tuyen, Quyen Dinh Thi (2014) Expression of L-asparaginase gene in Escherichia coli The 3rd acdemic conference on Natural science for master and PhD students from Asean Countries, November-2013, Phnom Penh, Cambodia: 307-316 Nguyễn Thi Hiền Trang, Đỗ Thị Tuyên, Quyền Đình Thi (2014) Biểu hiện, tinh L-asparaginase tái tổ hợp E coli thử nghiệm độc tính dòng tế bào ung thư Tạp chí Y học Việt Nam 421: 13-17 Trang Thi Hien Nguyen, Cuong Tien Nguyen, Thanh Sy Le Nguyen and Tuyen Thi Do (2016) Optimization, purification and characterization of recombinant L-asparaginase II in Escherichia coli African Journal of Biotechnology 15(31):1681-1691 Nguyen Thi Hien Trang, Le Thanh Hoang, Do Thi Tuyen (2018) Optimization of L-asparaginase production from Escherichia coli using response suface methodology Tạp chí Cơng nghệ sinh học 16(4): 765-775 ... L-asparaginase tái tổ hợp kết hợp lợi L-asparaginase II từ Erw chrysanthemi E coli Chính đề tài Biểu nghiên cứu hoạt tính ức chế tế bào ung thư máu enzyme L-asparaginase tái tổ hợp từ Erwinia chrysanthemi ... mức độ hoạt tính ức chế sinh trưởng dòng tế bào ung thư khác nghiên cứu Tuy nhiên với dòng tế bào HL60 lại có khác biệt chế tác dụng nghiên cứu Abakumova cộng dòng tế bào ung thư máu nghiên cứu. .. Mục đích nghiên cứu Biểu L-asparaginase tái tổ hợp từ Erw chrysanthemi có hoạt tính ức chế sinh trưởng với tế bào ung thư máu hệ biểu E coli với suất cao Nội dung nghiên cứu  Thiết kế hệ biểu gene