ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM –––––––––––––––––––––––– NGUYỄN MẠNH CƯỜNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS GÂY BỆNH Ở LỢN TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN VÀ CHẾ TẠO AUTOVACCINE PHÒNG BỆNH LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y THÁI NGUYÊN - 2019 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM –––––––––––––––––––––––– NGUYỄN MẠNH CƯỜNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS GÂY BỆNH Ở LỢN TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN VÀ CHẾ TẠO AUTOVACCINE PHÒNG BỆNH Ngành: Ký sinh trùng Vi sinh vật học thú y Mã số : 9.64.01.04 LUẬN ÁN TIẾN SĨ THÚ Y NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Tô Long Thành TS Nguyễn Văn Quang THÁI NGUYÊN - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng: Đây cơng trình nghiên cứu riêng tơi; số liệu, kết nghiên cứu luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc hoàn thành luận án cảm ơn, thông tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Thái Nguyên, tháng năm 2019 Tác giả luận án Nguyễn Mạnh Cường LỜI CẢM ƠN Trong q trình triển khai thực đề tài hồn thành luận án, nhận quan tâm, giúp đỡ thày, cô, bạn đồng nghiệp, quan cơng tác gia đình Tơi xin trân trọng cảm ơn Khoa Chăn ni - Thú y, Phòng Đào tạo, Trường đại học Nông Lâm, Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên; Trung tâm chẩn đoán Thú y trung ương - Cục Thú y, Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y, Chi cục Chăn ni - Thú y tỉnh Thái Ngun nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập, nghiên cứu thực đề tài luận án Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thày hướng dẫn khoa học là: PGS.TS Tô Long Thành - Giám đốc Trung tâm chẩn đoán Thú y trung ương, Cục Thú y TS Nguyễn Văn Quang - Nguyên Trưởng Khoa Chăn nuôi Thú y, Trường đại học Nông Lâm, Đại học Thái Nguyên trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu hồn thiện luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo tập thể cán Bộ môn Vi trùng Trung tâm chẩn đoán thú y trung ương - Cục Thú y, Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Công nghệ Phân tử - Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện, giúp đỡ hướng dẫn thực thí nghiệm đề tài luận án Nhân dịp này, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới thày, cô, bạn đồng nghiệp, học viên cao học, em sinh viên đặc biệt gia đình ln giúp đỡ, động viên, hỗ trợ tơi thời gian qua để hồn thành luận án Thái Nguyên, tháng năm 2019 Tác giả MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU .vii DANH MỤC CÁC BẢNG ix DANH MỤC CÁC HÌNH xi MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Những đóng góp đề tài: .3 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu bệnh liên cầu khuẩn chế tạo vaccine phòng bệnh lợn gây S suis nước 1.1.1 Tình hình nghiên cứu nước 1.1.2 Tình hình nghiên cứu nước 1.2 Vi khuẩn S suis 1.2.1 Phân loại khuẩn S suis 1.2.2 Hình thái tính chất nuôi cấy vi khuẩn S suis .8 1.2.3 Đặc tính sinh hố vi khuẩn S suis 1.2.4 Cấu trúc kháng nguyên vi khuẩn S suis 1.2.5 Các yếu tố độc lực vi khuẩn S suis .10 1.3 Bệnh liên cầu khuẩn lợn vi khuẩn S suis gây 13 1.3.1 Đặc điểm dịch tễ học 13 1.3.2 Cơ chế sinh bệnh 15 1.3.3 Triệu chứng lâm sàng bệnh tích .17 1.3.4 Miễn dịch lợn chống vi khuẩn S suis .19 1.3.5 Chẩn đoán 23 1.3.6 Phòng bệnh 27 1.3.7 Điều trị kháng sinh 31 Chương 2: NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Nội dung nghiên cứu 35 2.1.1 Nghiên cứu tình hình bệnh viêm phổi, viêm khớp lợn ni Thái Nguyên vi khuẩn S suis gây 35 2.1.2 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng S suis gây viêm phổi viêm khớp lợn Thái Nguyên .35 2.1.3 Nghiên cứu chế tạo thử nghiệm Autovaccine vô hoạt keo phèn từ chủng S suis phân lập 35 2.1.4 Nghiên cứu thử nghiệm biện pháp phòng, trị bệnh S suis gây lợn .35 2.2 Đối tượng, nguyên liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 36 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu .36 2.2.2 Nguyên vật liệu 36 2.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 37 2.3.1 Địa điểm nghiên cứu 37 2.3.2 Thời gian nghiên cứu 37 2.4 Phương pháp nghiên cứu .37 2.4.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ 37 2.4.2 Phương pháp thu thập mẫu .39 2.4.3 Phương pháp nuôi cấy phân lập vi khuẩn S suis .39 2.4.4 Phương pháp kiểm tra hình thái vi khuẩn nhuộm Gram 39 2.4.5 Phương pháp thực phản ứng sinh hóa (Nhận biết cấp I) 39 2.4.6 Phương pháp thực Kit sinh hóa API 20 Strep (Nhận biết cấp II) 40 2.4.7 Phương pháp PCR để xác định serotype gây bệnh thông thường gen mã hoá số yếu tố độc lực vi khuẩn S suis 41 2.4.8 Phương pháp tính liều gây chết 50% (LD50) vi khuẩn S suis 42 2.4.9 Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn 42 2.4.10 Phương pháp xác định độc lực chủng vi khuẩn S suis phân lập động vật thí nghiệm 42 2.4.11 Phương pháp xác định khả mẫn cảm với kháng sinh chủng vi khuẩn S suis phân lập 43 2.4.12 Xây dựng phác đồ điều trị lợn mắc viêm phổi, viêm khớp 43 2.4.13 Phương pháp chế tạo thử nghiệm Autovaccine vô hoạt keo phèn từ chủng vi khuẩn S suis phân lập .44 2.4.14 Kiểm tra vơ trùng, an tồn hiệu lực Autovaccine thử nghiệm phòng bệnh liên cầu khuẩn (chi tiết trình bày phụ lục 10) 45 2.4.15 Kiểm tra đáp ứng miễn dịch lợn sau tiêm Autovaccine 45 2.4.16 Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể lợn tiêm Autovaccine phản ứng IHA 45 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 46 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 47 3.1 Tình hình lợn mắc chết viêm phổi, viêm khớp từ năm 2015 – 2017 tỉnh Thái Nguyên 47 3.1.1 Tỷ lệ lợn mắc chết viêm phổi, viêm khớp từ năm 2015 - 2017 47 3.1.2 Tỷ lệ lợn mắc chết viêm phổi, viêm khớp huyện, thành thuộc tỉnh Thái Nguyên 49 3.1.3 Tỷ lệ lợn mắc chết viêm phổi, viêm khớp theo mùa vụ 52 3.1.4 Tỷ lệ lợn mắc chết viêm phổi, viêm khớp theo lứa tuổi 53 3.2 Kết nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng S suis phân lập .56 3.2.1 Kết phân lập vi khuẩn S suis từ lợn mắc viêm phổi viêm khớp Thái Nguyên 56 3.2.2 Kết giám định số đặc tính sinh vật, hóa học chủng vi khuẩn S suis phân lập 58 3.2.3 Kết xác định số đặc tính sinh vật, hố học chủng vi khuẩn S suis phân lập Kit sinh hóa API 20 Strep 60 3.2.4 Kết xác định tính mẫn cảm kháng sinh chủng S suis phân lập 62 3.2.5 Kết xác định serotype chủng S suis phân lập kỹ thuật PCR 63 3.2.6 Kết xác định gen mã hóa yếu tố độc lực chủng vi khuẩn S suis phân lập 66 3.2.7 Kết nghiên cứu ổn định số đặc tính sinh học chủng S suis phân lập lợn Thái Nguyên 69 3.3 Kết nghiên cứu chế tạo thử nghiệm Autovaccine từ chủng S suis phân lập 75 3.3.1 Chọn chủng vi khuẩn S suis để chế tạo thử nghiệm Autovaccine 75 3.3.2 Chế tạo thử nghiệm Autovaccine phòng bệnh S suis lợn 76 3.3.3 Kết kiểm nghiệm Autovaccine phòng bệnh S suis lợn 79 3.3.4 Kết xác định đáp ứng miễn dịch lợn sau tiêm Autovaccine thử nghiệm phòng bệnh S suis lợn 84 3.4 Kết thử nghiệm biện pháp phòng trị viêm phổi, viêm khớp cho lợn S suis gây 94 3.4.1 Kết xác định hiệu lực Autovaccine phòng viêm phổi viêm khớp cho lợn 94 3.4.2 Kết thử nghiệm số phác đồ điều trị lợn mắc viêm phổi viêm khớp 96 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 101 KẾT LUẬN 101 ĐỀ NGHỊ 102 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC 103 TÀI LIỆU THAM KHẢO .104 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ADH AMD ARA BHI CFU CPS cs EF ELISA ESL GAL GLYG: GUR HIP ICAM IHA INU LAP LAC LD MAN MRP NAG NAM NIN PAL PBS PCR PYRA QCVN RAF RIB RR S suis SLY SOR STSS TCCS TCVN TRE TSA TSB TYE : Arginine Dihydrolase : amidon : arabinose : Brain Heart Infusion : Colony Forming Unit : Capsule polysaccharide : cộng : Extracellular factor : Enzyme - linked Immunosorbert Assay : Esculin : Galactosidase : glycogen : Glucuronidase : acid Hippuric : Intercellular adhension molecule : Indirect Haemaglunation test : đường inulin : Leucine AminoPeptidase : đường lactose : Lethal dose : đường mannitol : Muramidase - released protein : N-acetylgluco acid : N-acetylmuramic acid : Ninhydrin : Alkaline Phosphatase : Phosphate-buffered solution : Polymerase Chain Reaction : Pyrrolidonyl Arylamidase : quy chuẩn Quốc Gia : đường raffinose : đường ribose : Relative Risk : Streptococcus suis : Suilysin : đường sorbitol : Streptococcus toxic shock syndrome : tiêu chuẩn sở : tiêu chuẩn Quốc Gia : trehalose : Tryptone soya agar : Tryptone soya broth : Tryptone Yeast Extract Broth VP VCAM YE : Voges Proskauer : Vascular cell adhension molecule : Yeast Extract Phổi lợn Dịch cuống họng Sơ đồ 1: Quy trình phân lập vi khuẩn S suis (Viện Thú y Quốc gia) PHỤ LỤC Phương pháp PCR để xác định serotype gây bệnh thơng thường gen mã hố số yếu tố độc lực vi khuẩn S suis - Nguyên tắc: Phương pháp PCR để xác định gen mã hóa số yếu tố độc lực serotype gây bệnh thông thường (1, 2, 7, 9) vi khuẩn S suis thực theo (Wisselink H.J cs (2002b) [131]; Silva L.M cs (2006) [114] Đỗ Ngọc Thúy Lê Thị Minh Hằng (2009a) [31] - Phản ứng PCR để xác định serotype 1, 2, vi khuẩn S suis Bốn serotype S suis gây bệnh thường gặp lợn xác định phản ứng PCR - Mồi phản ứng: Các cặp mồi dùng để xác định serotype 1, 2, S suis lựa chọn dựa vào chuỗi gen mã hoá trình sinh tổng hợp thành phần polysaccharide giáp mô (cps), gồm cặp mồi: cps 1J - F cps 1J - R để xác định serotype 1, cps 2J - F cps 2J - R để xác định serotype 2, cps 7H - F cps 7H- R để xác định serotype 7, cps 9H - F cps 9H - R để xác định serotype Trình tự mồi sản phẩm tương ứng chúng tạo trình bày bảng: Trình tự mồi phản ứng PCR dùng để xác định serotype vi khuẩn S suis Gen Ký hiệu đích primers Kích cỡ Chuỗi primers (5’- 3’) sản phẩm (bp) cps cps cps cps cps1J - F 5' - TGG CTC TGT AGA TGA TTC TGC T - 3' cps1J - R 5' - TGA TAC GTC AAA ATC CTC ACC A- 3' cps2J - F 5' - TTT GTC GGG AGG GTT ACT TG - 3' cps2J - R 5' - TTT GGA AGC GAT TCA TCT CC - 3' cps7H - F 5' - AAT GCC CTC GTG GAA TAC AG - 3' cps7H - R 5' - TCC TGA CAC CAG GAC ACG TA - 3' cps9H - F 5' - GGG ATG ATT GCT CGA CAG AT- 3' 637 bp 498 bp 379 bp 303 bp cps9H - R 5' - CCG AAG TAT CTG GGC TAC TGA- 3' - Phản ứng PCR xác định gen mã hoá số yếu tố độc lực vi khuẩn S suis - Việc xác định yếu tố gây bệnh S suis thực phản ứng PCR phức hợp (Multiplex PCR), tức có phối hợp nhiều loại mồi khác phản ứng - Mồi phản ứng thiết kế dựa vào chuỗi gen mã hoá sinh tổng hợp yếu tố liên quan đến độc lực là: yếu tố ngoại bào (EF, epf), protein giải phóng muramidase (MRP, mrp), suilysin (SLY, sly) enzym arginine deiminase (ARC, arcA) Trình tự mồi sản phẩm tương ứng chúng tạo trình bày bảng sau: Trình tự mồi phản ứng PCR dùng để xác định số gen mã hoá yếu tố độc lực Gen Ký hiệu đích primers epf sly mrp arc Chuỗi primers (5’ - 3’) epf - F 5' - CGC AGA CAA CGA AAG ATT GA - 3' epf - R 5' - AAG AAT GTC TTT GGC GAT GG - 3' sly - F 5' - GCT TGA CTT ACG AGC CAC AA - 3' sly - R 5' - CCG CGC AAT ACT GAT AAG C - 3' mrp - F 5' - ATT GCT CCA CAA GAG GAT GG - 3' mrp - R 5' - TGA GCT TTA CCT GAA GCG GT - 3’ arcA - F 5' - TGA TAT GGT TGC TGC TGG TC - 3' arcA - R 5' - GGA CTC GAG GAT AGC ATT GG - 3' Kích cỡ sản phẩm (bp) 744 bp 248 bp 188 bp 118 bp Các thành phần chu kỳ nhiệt phản ứng dùng để xác định serotype S suis giống phản ứng dùng để xác định gen mã hoá yếu tố độc lực trình bày chi tiết bảng sau: Thành phần chất phản ứng MP - PCR dùng để xác định số serotype gây bệnh thơng thường gen mã hố yếu tố độc lực Thành phần Thể tích (µl) Nồng độ Mồi xi 1+1+1+1 3,2 µM/ µl Mồi ngược 1+1+1+1 3,2 µM/ µl - 0.05 500 UI Nước khử ion 12 - Tổng cộng 25 - Dung dich đệm AMP x gồm: - 750 mM Tris - HCl (pH=8) - 200mM (NH4)2SO4 - 0,1% (v/v) Tween 20 - dNTPs - 2mM MgCl2 Taq - polymerase - Các chu kỳ nhiệt phản ứng: Các chu kỳ nhiệt phản ứng PCR dùng để xác định số serotype gây bệnh thông thường gen mã hoá yếu tố độc lực Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) kỳ nhiệt Giai đoạn tiền biến tính 94 Giai đoạn biến tính 94 Giai đoạn bắt cặp 53 Giai đoạn tổng hợp 72 1,5 Giai đoạn kéo dài 72 Các giai đoạn phản ứng Số chu 35 - Phân tích sản phẩm: Các sản phẩm phản ứng PCR tiến hành chạy điện di thạch agarose 2% dung dịch x TAE với hiệu điện 50V 30 phút, đọc kết chụp ảnh hệ thống Gel Doc 2000 PHỤ LỤC Phản ứng ngưng kết phiến kính để xác định serotype gây bệnh thông thường vi khuẩn S suis Phản ứng ngưng kết phiến kính phản ứng hyết học thường áp dụng cho việc đánh giá theo đàn, kiểm tra có hay khơng kháng thể bệnh Nguyên lý phản ứng Kháng thể có huyết kết hợp với kháng nguyên vi khuẩn biết (S suis) để tạo thành phức hợp kháng nguyên kháng thể mà ta quan sát thấy (kháng nguyên chuẩn thường gắn màu nên phức hợp hạt chấm có màu đỏ dung dịch suốt) Tiến hành phản ứng - Nguyên liệu phản ứng mẫu huyết để nhiệt độ phòng (khoảng 25 0C) khoảng trước làm phản ứng - Lắc lọ kháng nguyên cách nhẹ nhàng để kháng nguyên chắn đồng - Nhỏ 30 µl mẫu huyết lên phiến kính - Nhỏ 30 µl kháng nguyên lên huyết - Trộn mẫu huyết với kháng nguyên que trộn - Lặp lại bước với huyết đối chứng âm, dương - Nhẹ nhàng lắc tròn phiến kính phút (có thể sử dụng máy lắc) - Quan sát ngưng kết sau phút kể từ lúc bắt đầu lắc, khoảng thời gian tốt để đánh giá kết Đánh giá kết Phản ứng âm tính: Khơng có ngưng kết Phản ứng dương tính (có kháng thể đặc hiệu): Có hạt ngưng kết lấm PHỤ LỤC Phương pháp xác định khả mẫn cảm với kháng sinh chủng vi khuẩn S suis Cách tiến hành: vi khuẩn S suis nuôi cấy môi trường thạch TSA qua đêm Các khuẩn lạc vi khuẩn tạo huyền phù nước muối sinh lý 0,9% để độ đục tương đương ống McFarland (3 x 10 CFU/ml) Dùng tăm bơng vơ trùng, tẩm dung dịch pha lỗng dàn lên thạch đĩa Muller Hinton, đặt khoanh giấy tẩm kháng sinh lên mặt đĩa thạch Nuôi vi khuẩn 37 oC/18 - 24 (5% CO2) Đọc kết cách đo đường kính vòng vô khuẩn so sánh với bảng chuẩn để đánh giá mức độ mẫn cảm hay kháng kháng sinh chủng vi khuẩn kiểm tra bảng sau Bảng đánh giá mức độ mẫn cảm vi khuẩn với số loại kháng sinh (NCCLS - 2002) TT 10 11 12 Loại kháng sinh Ceftiofur Ampicillin Amoxicillin Neomycin Ofloxacin Gentamicin Lincomycin Colistin Tetracyclin Erythromycin Florphenicol Penicillin G Đường kính vòng vơ khuẩn (mm) Hàm lượng Mẫn cảm Mẫn cảm Kháng cao trung bình thuốc 30 µg ≥ 21 18 - 20  17 10 µg ≥ 22 19 - 21 ≤ 18 20 µg ≥ 20 ≤ 19 30 µg ≥ 17 13 - 16 ≤ 12 µg ≥ 15 13 - 14 ≤ 12 10 µg ≥ 19 ≤ 15 15 µg ≥ 15 13 - 14 ≤ 12 10 µg ≥ 15 13 - 14 ≤ 12 30 µg ≥ 29 26 - 28 ≤ 25 15 µg ≥ 21 16 - 20 ≤ 15 30 µg ≥ 23 ≤ 20 10 µg ≥ 22 19 - 21 ≤ 18 PHỤ LỤC Giống vi khuẩn S suis Thạch Columbia Tủ ấm CO2/37oC/24h Chọn khuẩn lạc điển hình 10 ml nước thịt BHI Lắc 300 - 500 lần/phút Tủ ấm 37oC/24h Đạt tiêu chuẩn khiết Lắc 300 - 500 lần/phút Tủ ấm 37oC/24h Sản xuất giống cấp II (100 ml BHI), sau giống cấp III (1000 ml BHI) Đếm số lượng vi khuẩn Đạt tiêu chuẩn khiết Bổ sung fomalin tỷ lệ 0,3% Lắc 300 - 500 lần/phút Tủ ấm 37oC/24h Đạt tiêu vô trùng Trộn lẫn loại canh trùng theo tỷ lệ 1:1:1 Bổ sung keo phèn tỷ lệ 1/5 (20%) Đạt tiêu vơ trùng Ra chai Kiểm tra An tồn Vơ trùng Hiệu lực Sơ đồ 2: Tóm tắt quy trình chế tạo vaccine (Viện Thú y quốc gia) (Theo quy trình sản xuất vaccine vơ hoạt bổ trợ keo phèn ni cấy tĩnh) PHỤ LỤC PHƯƠNG PHÁP TÍNH LIỀU LD50 THEO REED-MUENCH (1938) TRÊN CHUỘT BẠCH Liều gây chết 50% (LD50) serotype 2, tính theo cơng thức sau: LgLD50  LgA  a  50 �d ab Trong đó: A nồng độ pha loãng gây chết sát 50% chuột a tỷ lệ chuột chết liều A gây (%) b tỷ lệ chuột chết liều B gây (%) (cộng dồn), d lg nồng độ pha loãng Liều LD50 vi khuẩn S suis serotype Bảng 1: LD50 vi khuẩn S suis serotype Độ pha loãng canh khuẩn (CFU/ml ) Số Số Số chuộ chuột chuộ t tiêm t chết sống (con) (con) (con) Các giá trị tích lũy Số Số Chuột chuột chuột thí chết sống nghiệ cộng cộng m dồn dồn (con) (con) (con) (A) 10-1 5 36 -2 10 5 31 -3 10 5 26 -4 10 5 21 -5 10 5 16 -6 10 11 -7 10 -8 10 - Xác định LD50 chủng S suis serotype 2: (B) (A+B) 0 0 36 31 26 21 16 12 10 10 Tỷ lệ chết cộng dồn (%) A/ (A+B)x100 100 100 100 100 100 91,66 70,0 40,0 Ở độ pha lỗng 10-7 gây chết 70,0 % chuột thí nghiệm, giá trị cận gây chết 50%, giá trị cận 50% độ pha lỗng 10 -8, gây chết 40,0 % chuột thí nghiệm Thay vào cơng thức ta có: 70 50 Lg LD50 = Lg 10-7 + xd 70 40 d Lg hệ số pha loãng = Lg10 Lg LD50 = Lg 10-7 + 0,66 x Lg 10 Vì Lg10 = nên ta suy Lg LD50 = -7 + 0,66 x = - 6,34 Tra máy tính: bấm số 10 nhấn vào X y, nhập -6,34 kết là: 4,57 x 10-7 Như giá trị LD50 chủng S suis serotype 4,5 x 107CFU/0,2ml Liều LD50 vi khuẩn S suis serotype Bảng 2: LD50 vi khuẩn S suis serotype Độ pha loãng canh khuẩn (CFU/ml ) Số chuột tiêm (con) Số Số chuộ chuộ t t chết sống (con) (con) Các giá trị tích lũy Số Số Chuột chuột chuột thí chết sống nghiệ cộng cộng m dồn dồn (con) (con) (con) (A) 10-1 5 37 -2 10 5 32 -3 10 5 27 -4 10 5 22 -5 10 5 17 -6 10 12 -7 10 5 -8 10 - Xác định LD50 chủng S suis serotype 7: (B) (A+B) 0 0 1 37 32 27 22 17 13 Tỷ lệ chết cộng dồn (%) A/ (A+B)x100 100 100 100 100 100 92,30 87,50 33,33 Ở độ pha lỗng 10-7 gây chết 87,50 % chuột thí nghiệm, giá trị cận gây chết 50%, giá trị cận 50% độ pha loãng 10 -8, gây chết 33.33 % chuột thí nghiệm Thay vào cơng thức ta có: Lg LD50 = Lg 87,50 - xd 50 10-7 + 87,50 – 33,33 d Lg hệ số pha loãng = Lg10 Lg LD50 = Lg 10-7 + 0,69 x Lg 10 Vì Lg10 = nên ta suy Lg LD50 = -7 + 0,69 x = - 6,31 Tra máy tính: bấm số 10 nhấn vào X y, nhập -6,31 kết là: 4,9 x 10-7 Như giá trị LD50 chủng S suis serotype 4,9 x 107CFU/0,2ml Liều LD50 vi khuẩn S suis serotype Bảng 3: LD50 vi khuẩn S suis serotype Độ pha loãng canh khuẩn (CFU/ml ) 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 Số chuột tiêm (con) 5 5 5 5 Số Số chuộ chuộ t t chết sống (con) (con) 5 5 5 0 0 0 Các giá trị tích lũy Số Số Chuột chuột chuột thí chết sống nghiệ cộng cộng m dồn dồn (con) (con) (con) (A) (B) (A+B) 36 31 26 21 16 11 0 0 0 36 31 26 21 16 11 Tỷ lệ chết cộng dồn (%) A/ (A+B)x100 100 100 100 100 100 100 85,71 33,33 - Xác định LD50 chủng S suis serotype 9: Ở độ pha loãng 10-7 gây chết 85,71 % chuột thí nghiệm, giá trị cận gây chết 50%, giá trị cận 50% độ pha loãng 10 -8, gây chết 33.33 % chuột thí nghiệm Thay vào cơng thức ta có: Lg LD50 = Lg 85,71 - x d 50 10-7 + 85,71 – 33,33 d Lg hệ số pha loãng = Lg10 Lg LD50 = Lg 10-7 + 0,68 x Lg 10 Vì Lg10 = nên ta suy Lg LD50 = -7 + 0,68 x = - 6,32 Tra máy tính: bấm số 10 nhấn vào X y, nhập -6,32 kết là: 4,8 x 10-7 Như giá trị LD50 chủng S suis serotype 4,8 x 107CFU/0,2ml PHỤ LỤC MỘT SỐ LOẠI KHÁNG SINH VÀ THUỐC SỬ DỤNG CEFANEW- LA (100 ml) (Công ty cổ phần thuốc thú y Marphavet sản xuất) Thành phần: Ceftiofur : 10.000 mg Tá dược đặc biệt vừa đủ : 100ml Công dụng: Đặc trị viêm màng phổi, phổi dính sườn, hen suyễn viêm vú, viêm tử cung, viêm con, bệnh Tụ huyết trùng, Phó thương hàn, E coli sưng phù đầu, viêm ruột tiêu chảy, phân trắng lợn con, viêm da, viêm đa khớp, nhiễm trùng huyết, kế phát LMLM, kế phát hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản Các vi khuẩn Gram (+) Gram (-) nhạy cảm với Ceftiofur Cách dùng: Tiêm bắp thịt da, mũi tiêm tác dụng kéo dài 72 Liều lượng: Lợn: 1ml/20-25 kg TT Trâu, bò, dê: 1ml/45-60 kg TT Lợn con, chó, mèo: 1ml/12-18 kg TT MARFLO - 45% (100 ml) (Công ty cổ phần thuốc thú y Marphavet sản xuất) Thành phần: Florfenicol: 45.000 mg Tá dược, dung môi đặc biệt vừa đủ: 100ml Công dụng: Đặc trị ho hen, suyễn, lepto, viêm phổi hóa mủ, viêm phổi dính sườn, phó thương hàn, tụ huyết trùng, hồng lỵ, E coli sưng phù đầu, viêm ruột tiêu chảy, viêm vú, viêm tử cung, nhiễm trùng huyết gây liệt sau sinh Bệnh sốt vẹt, bỏ ăn không rõ nguyên nhân Trị bệnh kế phát tai xanh… nhiều loại vi trùng bội nhiễm Tiêu chảy phân xanh, phân trắng gà, vịt, ngan, cút Cách dùng: Tiêm bắp thịt da Một mũi tiêm tác dụng kéo dài 72 Liều lượng: Lợn: 1ml/27-35kg TT Trâu, bò, dê, cừu: 1ml/45-47kg TT Gia cầm: 1ml/8-10kg TT MARPHAMOX - LA (100 ml) (Công ty cổ phần thuốc thú y Marphavet sản xuất) Thành phần: Amoxicilline : 15.000 mg Tá dược đặc biệt (axit Clavulalic ) dung môi hữu vừa đủ :100ml Công dụng: Đặc trị nhiễm khuẩn kế phát bệnh truyền nhiễm như: Sốt đỏ, bỏ ăn không rõ nguyên nhân, viêm phổi, khó thở, lepto, phó thương hàn, tụ huyết trùng, nhiễm trùng huyết sau sinh Bệnh viêm vú sữa, viêm tử cung, an toàn cho nái ni con, viêm khớp, viêm da, đóng dấu Thuốc hiệu với bệnh phân trắng lợn con, phân nhớt vàng E coli, Clostridium, xoắn khuẩn lỵ Cách dùng: Tiêm bắp thịt da; Một mũi tiêm tác dụng kéo dài 48 Liều lượng: Lợn, bê, nghé: Trâu, bò, ngựa: 1ml/8-10kg TT 1ml/10-12kg TT GLUCO - K - C - NAMIN (100 ml) (Công ty cổ phần thuốc thú y Marphavet sản xuất) Thành phần: Gluconate canxi : 25.000 mg Vitamin K : 1.000 mg Vitamin C : 4.000 mg Tolfenamic acid : 4.000 mg Methyparaben : 140 mg Tá dược, dung môi đặc biệt vừa đủ : 100 ml Công dụng: Thuốc trợ sức, trợ lực, giảm sốt, hỗ trợ tăng cường sức đề kháng Phục hồi sức vật nuôi bệnh, mang thai, sau sinh, suy nhược Cung cấp lượng, hỗ trợ điều trị bệnh truyền nhiễm hiệu tối ưu Tăng cường sức đề kháng, chống xuất huyết phủ tạng thể Cách dùng: Tiêm bắp thịt, da cho uống thời gian điều trị Sản phẩm đặc biệt hiệu hỗ trợ điều trị bệnh truyền nhiễm kế phát lợn mắc tai xanh, sốt đỏ, nhiễm trùng, bệnh Gumboro, ký sinh trùng đường máu gà… Liều lượng: Gia súc bệnh: Ngày lần với liều: 1ml/7-10 kg TT/ngày Gia cầm bệnh: Ngày lần với liều: 1ml/4-6 kg TT/ngày PHỤ LỤC 10 Kiểm tra vơ trùng, an tồn hiệu lực Autovaccine thử nghiệm phòng bệnh liên cầu khuẩn Kiểm tra vơ trùng theo TCVN 8684:2011 [37] Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn: Cấy Autovaccine ống môi trường kiểm tra sau đây: môi trường thiolycolat, môi trường trypticaza đậu tương đĩa môi trường thạch máu, lượng Autovaccine cấy từ 1% đến 2% (phần thể tích) so với mơi trường kiểm tra Ủ môi trường cấy Autovaccine tủ 37 oC, theo dõi từ đến 10 ngày Mẫu Autovaccine xem đạt tiêu chuẩn vi sinh vật mọc mơi trường kiểm tra thời gia theo dõi Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc: Mẫu Autovaccine ria cấy môi trường thạch Sabouraud môi trường thủy phân casein đậu tương Theo dõi 14 ngày nhiệt độ phòng từ 20 oC đến 25 oC Mẫu Autovaccine xem đạt tiêu chuẩn khơng có tạp khuẩn nấm mốc mọc môi trường kiểm tra thời gia theo dõi Kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma: Mẫu Autovaccine cấy kiểm tra môi trường canh thang PPLO vơi nồng độ từ 1% đến 2% Autovaccine 100 ml môi trường thạch đĩa PPLO có bổ sung huyết ngựa chất chiết nấm men với thể tích 0,1 ml Autovaccine đĩa Theo dõi môi trường lỏng 14 ngày nhiệt độ từ 33 oC đến 37 oC Tại thời điểm ngày, ngày, 10 ngày 14 ngày, lấy canh khuẩn môi trường lỏng ria cấy vào môi trường thạch PPLO (2 đĩa) Ủ tủ ấm 37 o C có 5% khí CO2, theo dõi 28 ngày Mẫu Autovaccine xem đạt khơng có khuẩn lạc Mycoplasma mọc mơi trường kiểm tra Kiểm tra tạp nhiễm Salmonella: Mẫu Autovaccine cấy môi trường kiểm tra, dùng loại môi trường sau: thạch MacConkey, thạch Salmonella-Shigella, thạch Brilliant Green, thạch Desoxycholat xitrat XLD, với nồng độ từ 1% đến 2% dung tích mơi trường kiểm tra Ủ mơi trường cấy Autovaccine tủ 37 oC, theo dỗi từ 18 h đến 20 h sau cấy chuyển tiếp sang môi trường nước, dùng môi trường sau: canh thang selenit canh thang tetrathionat Ủ tủ 37 oC, theo dõi từ 48h đến 72h Mẫu Autovaccine xem đạt vi khuẩn Salmonella mọc mơi trường kiểm tra Ở lô autovaccine lấy chai theo phương pháp ngẫu nhiên, lắc cấy 0,2 ml vào ống môi trường nước thịt, nước thịt TYE nước thịt gan yếm khí, thạch máu, thạch MacConkey, thạch PPLO, thạch Sabouraud Mỗi loại môi trường cấy kiểm tra ống Các ống môi trường sau cấy bồi dưỡng tủ ấm có bổ sung 5% CO 2, riêng thạch nấm để nhiệt độ phòng, ngày kiểm tra kết lần Theo dõi kết hàng ngày, ngày đọc kết lần, sau ngày (riêng môi trường nấm theo dõi 14 ngày) khơng có loại vi khuẩn mọc mơi trường autovaccine coi đạt tiêu chuẩn vô trùng Kiểm tra tiêu an toàn theo QCVN 01:187-2018 [27] TCVN 8685:2018 [38] Mỗi lô Autovaccine sử dụng lợn khoẻ mạnh, khơng có kháng thể S suis sertype 2, 7, Lợn tiêm liều Autovaccine (Autovaccine keo phèn tiêm da, Autovaccine nhũ dầu tiêm bắp) Sau tiêm theo dõi từ 14 đến 21 ngày Autovaccine xem đạt tất lợn sống không gây phản ứng cục hay toàn thân cho lợn Kiểm tra tiêu hiệu lực theo QCVN 01:187-2018 [27] Tiến hành kiểm tra hiệu lực Autovaccine thử nghiệm phương pháp thay chuột bạch Mỗi lô Autovaccine gây miễn dịch cho 10 chuột bạch khỏe mạnh đường tiêm da với liều 0,2 ml/con tiêm lặp lại mũi sau ngày với liều 0,2 ml/con Lô đối chứng: chuột không tiêm Autovaccine Sau tiêm 21 ngày tiến hành thử thách cường độc với canh khuẩn S suis chủng chế Autovaccine chứa 10 LD50 (LD50: liều gây chết 50% chuột bạch) có 0,2 ml cho tất chuột thí nghiệm chuột đối chứng Theo dõi chuột 10 ngày đánh giá Autovaccine thử nghiệm đạt yêu cầu hiệu lực lơ chuột thí nghiệm số chuột sống ¾, chuột lơ đối chứng chết 100% ... Streptococcus suis gây bệnh lợn tỉnh Thái Nguyên chế tạo Autovaccine phòng bệnh Mục tiêu đề tài - Xác định số đặc điểm sinh học vi khuẩn S suis gây bệnh vi m phổi vi m khớp lợn nuôi tỉnh Thái Nguyên - Nghiên. .. HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM –––––––––––––––––––––––– NGUYỄN MẠNH CƯỜNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN STREPTOCOCCUS SUIS GÂY BỆNH Ở LỢN TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN VÀ CHẾ... PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Nội dung nghiên cứu 35 2.1.1 Nghiên cứu tình hình bệnh vi m phổi, vi m khớp lợn ni Thái Nguyên vi khuẩn S suis gây 35 2.1.2 Nghiên cứu số