ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MÔI TRƯỜNG NGUYỄN NGỌC QUỲNH NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN HQL1 VÀ HQL2 MÃ HÓA HYDROXYQUINOL 1,2DIOXYGENASE TRONG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI M15 Đà Nẵng – Năm 2018 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MÔI TRƯỜNG NGUYỄN NGỌC QUỲNH NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN HQL1 VÀ HQL2 MÃ HÓA HYDROXYQUINOL 1,2DIOXYGENASE TRONG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI M15 Ngành: Công nghệ Sinh học Người hướng dẫn: ThS Vũ Đức Hoàng Đà Nẵng – Năm 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu nghiên cứu trung thực chưa công bố cơng trình khác Các số liệu liên quan trích dẫn có ghi nguồn gốc Tơi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm kết sản phẩm kế thừa công bố người khác Người cam đoan Nguyễn Ngọc Quỳnh ii LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, em xin bày tỏ lời biết ơn chân thành đến GS Nguyễn Hoàng Lộc ThS Vũ Đức Hồng tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt suốt trình thực hồn thành khóa luận Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn ThS Dương Đức Hoàng Sinh, người trực tiếp hướng dẫn cho em, tận tình giúp đỡ em trình nghiên cứu Đồng thời, em vô biết ơn tất anh chị, bạn sinh viên phịng thí nghiệm, thầy cô giáo Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học, Đại học Huế quan tâm, giúp đỡ bảo tận tình cho em q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp Ngoài ra, em nhận giúp đỡ nhiệt tình thầy giáo Khoa Sinh – Môi trường, Trường đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng tạo điều kiện tốt để em thực đề tài, em xin chân thành cảm ơn Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân khích lệ, động viên tinh thần cho em suốt thời gian học tập làm việc Trong trình làm việc, bước đầu làm quen với chun mơn mắc nhiều sai sót, em cố gắng tìm tịi học hỏi để ngày trưởng thành Em xin chân thành cảm ơn! Đà Nẵng, ngày 27 tháng năm 2018 Sinh viên Nguyễn Ngọc Quỳnh iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài .1 Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 TỔNG QUAN VỀ DIBENZOFURAN 1.1.1 Dioxin .3 1.1.2 Nguồn gốc 1.1.3 Cấu trúc hóa học 1.1.4 Tính chất lý hóa 1.1.5 Tác hại .4 1.1.6 Dibenzofuran .4 1.1.7 Nguồn gốc 1.1.8 Cấu trúc hóa học 1.1.9 Tính chất lý hóa 1.1.10 Tác hại .7 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU DIOXIN 1.2.1 Tình hình nghiên cứu sử dụng vi sinh vật xử lý dioxin giới iv 1.2.2 Tình hình nghiên cứu sử dụng vi sinh vật xử lý dioxin nước 1.3 ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG PHÂN HỦY DIBEZOFURAN 11 1.3.1 Các enzyme phân giải dibenzofuran 11 1.3.2 Các vi sinh vật tái tổ hợp phân hủy dibenzofuran 15 1.4 TỔNG QUAN VỀ CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP 17 1.5 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ENZYME HYDROXYQUINOL 1,2DIOXYGENASE 19 1.5.1 Cấu tạo 19 1.5.2 Tình hình nghiên cứu hydroxyquinol 1,2-dioxygenase giới .19 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .21 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 21 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.2.1 Phân lập gen HQL1 HQL2 từ vi khuẩn E coli TOP10 mang vector tái ® ® tổ hợp pGEM -T Easy/HQL1 pGEM -T Easy/HQL2 21 2.1.2 Tạo dòng gen HQL1 HQL2 vector biểu pQE30 23 2.1.3 Biểu gen HQL1 HQL2 E coli M15 25 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 PHÂN LẬP GEN HQL1 VÀ HQL2 TỪ VI KHUẨN E COLI TOP10 MANG ® ® VECTOR TÁI TỔ HỢP PGEM -T EASY/HQL1 VÀ PGEM -T EASY/HQL2 27 3.2.TẠO DÒNG GEN HQL1 VÀ HQL2 TRONG VECTOR BIỂU HIỆN PQE30… ………………………………… 29 3.3 BIỂU HIỆN GEN HQL1 VÀ HQL2 TRONG E COLI M15 .30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tên đầy đủ 1,2,3,4-TCDD : 1,2,3,4-tetrachlorodibenzo-p-dioxin 1,2,3,7,8-PeCDD : 1,2,3,7,8-pentachlorodibenzo-p-dioxin 2,3,7,8-TCDD : 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin 2,4,5-T : 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid 2,4-D : 2,4-dichlorophenoxyacetic acid AHR : Aryl hydrocarbon receptor (chất thụ cảm nhân thơm) AHRE : Aryl hydrocarbon response element bp : Base pair BPDO : Biphenyl dioxygenase DD : Dibenzo-p-dioxin DF : Dibenzofuran Epp : Eppendorf HpCDF : Heptachlorodibenzofuran HxCDD : Hexachlorodibenzo-p-dioxin HxCDF : Hexachlorodibenzofuran IARC : International Agency for Research on Cancer (Tổ chức nghiên cứu Ung thư quốc tế) IPTG : Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside I-TEF : International toxic equivalency factor (hệ số độc tương đương theo qui định quốc tế) LB : Môi trường Luria Bertani MSM : Minimal salt medium (Môi trường muối tối thiểu) OCDF : Octachlorodibenzofuran PCB : Polychlorinated biphenyl vi PCDD : Polychlorinated dibenzo-p-dioxin PCDD/F : Polychlorinated dibenzo-p-dioxin dibenzofuran PCDF : Polychlorinated dibenzofuran PCR : Polymerase Chain Reaction PeCDF : Pentachlorodibenzofuran TCDF : Tetrachlorodibenzofuran TEF : Toxic equivalency factor (hệ số độc tương đương) TEQ : Toxic equivalent (độ độc tương đương) U : Unit (đơn vị) DW : Deionized water vii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Hệ số độc tương đồng dẫn xuất DF Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi 24 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc PCDD Hình 1.2 Cấu trúc dibenzofuran PCDF .5 Hình 1.3 Sự tạo thành DF trình oxy hóa Hình 1.4 Con đường chuyển hóa biphenyl chủng Burkholderia sp LB400 12 Hình 1.5 Q trình oxy hóa DF enzyme chuyển hóa biphenyl chủng Burkholderia sp LB400 13 Hình 1.6 Con đường chuyển hóa carbazole chủng Sphingomonas sp XLDN2-5 14 Hình 1.7 Chuyển hóa catechol enzyme catechol 1,2-dioxygenase 15 Hình 2.1 Vector biểu pQE30 ……………………………………………… 21 ® ® Hình 3.1 Vector pGEM -T Easy/HQL1 pGEM -T Easy/HQL2…………… 27 ® ® Hình 3.2 Cắt hạn chế pGEM -T Easy/HQL1 pGEM -T Easy/HQL2 BamHI HindIII 28 Hình 3.3 Tinh gen HQL2 HQL1 28 Hình 3.4 Tinh vector pQE30 29 Hình 3.5 PCR khuẩn lạc E coli TOP10 mang pQE30/HQL1 pQE30/HQL2 29 Hình 3.6 Vector tái tổ hợp pQE30/HQL1 pQE30/HQL2 30 Hình 3.7 PCR khuẩn lạc E coli M15 mang vector pQE30/HQL1 pQE30/HQL2 31 Hình 3.8 Tiểu đơn vị protein mã hóa gen HQL1 HQL2 32 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Các chất hữu đa vòng thơm chứa chlorine bao gồm hợp chất có cấu trúc 2-3 vịng thơm chứa từ đến nguyên tử chlorine phân tử Đây chất có độ độc cao tùy thuộc vào số lượng vị trí nguyên tử chlorine phân tử Các chất gọi chung dioxin [2], chia thành nhóm hợp chất polychlorinated dibenzo-p-dioxin, polychlorinated dibenzofuran polychlorinated bipheny [1] Chúng hình thành trình sản xuất hóa chất, giấy bột giấy Thời gian bán hủy chúng đất từ 15 đến 100 năm nên chúng di chuyển sâu vào đất thời gian tồn mơi trường lâu dài, đe dọa đến hệ sinh thái sức khỏe người [1] Các đồng phân dibenzofuran chứa chlorine, furan không chứa chlorine hydrocarbon thơm đa nhân hợp chất độc ngày phát tán rộng rãi mơi trường Một số chất hình thành q trình sản xuất thuốc diệt cỏ thuốc trừ sâu q trình thiêu đốt thị số đồng phân sản phẩm phụ tạo ngồi ý muốn cơng nghệ lạc hậu Những chất bị phân hủy số chất có chu trình bán phân hủy đến vài chục năm [3] Việc khử độc chất ô nhiễm khôi phục môi trường vùng đất bị nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin cấp bách Có nhiều phương pháp để xử lý đất ô nhiễm dioxin phương pháp vật lý, hóa học sinh học Tuy nhiên, phương pháp thường có giá thành cao khó kiểm sốt nhiễm thứ cấp [3] Phương pháp phân hủy sinh học dựa kích thích tập đồn vi sinh vật địa phân hủy chất ô nhiễm thu hút kết khả quan tẩy độc đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin [4] Phân hủy sinh học phương pháp có nhiều triển vọng giá thành thấp so với phương pháp vật lý hóa học Ngoài ra, phương pháp an toàn môi trường không tạo sản phẩm thứ cấp Tuy nhiên, phương pháp đòi hỏi thời gian lâu phương pháp khác Q trình oxy hóa cắt vịng benzene điều kiện hiếu khí hay khử loại chlorine điều kiện kỵ khí thực enzyme vi sinh vật thông qua phản ứng sinh hóa [3] 27 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập gen HQL1 HQL2 từ vi khuẩn E coli TOP10 mang vector tái tổ hợp pGEM®-T Easy/HQL1 pGEM®-T Easy/HQL2 ® ® Vector tái tổ hợp pGEM -T Easy/HQL1 pGEM -T Easy/HQL2 tách chiết từ chủng vi khuẩn E coli TOP10 Kết điện di kiểm tra DNA gel agarose 1% trình bày hình 3.1 ® ® Hình 3.1 Vector pGEM -T Easy/HQL1 pGEM -T Easy/HQL2 ® M: thang chuẩn DNA 10 kb (hãng Thermo Scientific); 2: pGEM -T ® Easy/HQL1, 4: pGEM -T Easy/HQL2 Cắt gen HQL1 HQL2 từ vector tái tổ hợp pGEM®-T Easy/HQL1 pGEM®-T Easy/HQL2 loại enzyme cắt hạn chế BamHI HindIII Kết trình bày hình 3.2 cho thấy phản ứng cắt mở vịng xảy hoàn toàn, vector tái tổ hợp ® có băng DNA, pGEM -T Easy/HQL1 cho thấy băng thứ vị trí khoảng ® kb phù hợp với kích thước pGEM -T Easy băng thứ hai khoảng 0.5 kb phù ® hợp với kích thước gen HQL1, tương tự với pGEM -T Easy/HQL2 kết cho ® thấy băng thứ vị trí khoảng kb phù hợp với kích thước pGEM -T Easy băng thứ hai khoảng 1kb phù hợp với kích thước gen HQL2 28 ® ® Hình 3.2 Cắt hạn chế pGEM -T Easy/HQL1 pGEM -T Easy/HQL2 BamHI HindIII ® M: thang chuẩn DNA 10 kb (hãng Thermo Scientific); 2: pGEM -T ® Easy/HQL1; 4: pGEM -T Easy/HQL2 Sản phẩm cắt hạn chế thực trình tinh gel cột spin GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific) để thu hồi gen HQL1 HQL2 Sản phẩm tinh kiểm tra điện di gel agarose 1% Kết trình bày hình 3.3 Hình 3.3 Tinh gen HQL2 HQL1 M: thang chuẩn DNA 10 kb (hãng Thermo Scientific); 1: gen HQL1; 3: gen HQL2 29 Quá trình tinh vector pQE30 thực tương tự Kết trình bày hình 3.4 Hình 3.4 Tinh vector pQE30 3.2.Tạo dịng gen HQL1 HQL2 vector biểu pQE30 Gen HQL1, HQL2 gắn vào vector pQE30, hỗn hợp phản ứng gắn biến nạp vào tế bào E coli TOP10 Chủng vi khuẩn E coli TOP10 mang vector tái tổ hợp pQE30/HQL1 pQE30/HQL2 kiểm tra phương pháp PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi đặc hiệu HQL1, HQL2 Kết trình bày hình 3.5 Hình 3.5 PCR khuẩn lạc E coli TOP10 mang pQE30/HQL1 pQE30/HQL2 30 M: thang chuẩn DNA 10 kb (hãng Thermo Scientific); 1, 3: gen HQL1; 4, 5, 7: gen HQL2 Chủng vi khuẩn E coli TOP10 mang vector tái tổ hợp pQE30/HQL1 pQE30/HQL2 nuôi để tách chiết vector pQE30/HQL1 pQE30/HQL2 Sản phẩm tách chiết điện di gel agarose 1% Kết trình bày hình 3.6 Hình 3.6 Vector tái tổ hợp pQE30/HQL1 pQE30/HQL2 M: thang chuẩn DNA 10 kb (hãng Thermo Scientific); 1: pQE30/HQL2; 3: pQE30/HQL1 Sản phẩm vector pQE30/HQL1 pQE30/HQL2 sử dụng làm nguyên liệu để biến nạp vào vi khuẩn E coli M15 3.3 Biểu gen HQL1 HQL2 E coli M15 Vector tái tổ hợp pQE30/HQL1 pQE30/HQL2 biến nạp vào tế bào E coli M15 Chủng vi khuẩn E coli M15 mang vector tái tổ hợp pQE30/HQL1 pQE30/HQL2 kiểm tra phương pháp PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi đặc hiệu HQL1, HQL2 Kết trình bày hình 3.7 31 Hình 3.7 PCR khuẩn lạc E coli M15 mang vector pQE30/HQL1 pQE30/HQL2 M: thang chuẩn DNA 10 kb (hãng Thermo Scientific); 1, 2, 3: gen HQL2; 4, 5, 6: gen HQL1 Chủng vi khuẩn E coli M15 mang vector pQE30/HQL1 pQE30/HQL2 nuôi cấy môi trường LB có bổ sung 50 μg/mL ampicillin 50 μg/mL kanamycin 37 C 16 giờ, tốc độ lắc 220 vịng/phút có bổ sung chất cảm ứng 0.5 mM IPTG Sự biểu gen HQL1 va HQL2 phân tích kỹ thuật SDSPAGE Kết cho thấy băng protein lớn có kích thước khoảng 38 kDa (gen HQL2) khoảng 18 kDa (gen HQL1) so với mẫu đối chứng (hình 3.8) 32 Hình 3.8 Tiểu đơn vị protein mã hóa gen HQL1 HQL2 M: thang chuẩn chuẩn protein (10 đến 180 kDa) (hãng Thermo Scientific); 6: khuẩn lạc chứa pQE30/HQL1 khuẩn lạc chứa pQE30/HQL2 có cảm ứng IPTG; 5: khuẩn lạc chứa pQE30/HQL1 khuẩn lạc chứa pQE30/HQL2 không cảm ứng IPTG; 4: Khuẩn lạc M15 cảm ứng IPTG Mẫu đối chứng sử dụng dịch phá màng tế bào E coli M15 không chứa vector tái tổ hợp (pQE30/HQL1 pQE30/HQL2) có cảm ứng IPTG dịch phá màng E coli M15 có chứa vector tái tổ hợp khơng cảm ứng IPTG Các mẫu đối chứng âm xuất băng kích thước nhỏ khơng rõ nét Có thể mẫu này, tế bào chủ có tổng hợp số protein kích thước hàm lượng thấp 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Tạo dịng biểu thành cơng gen HQL1 HQL2 mã hóa hydroquinol 1,2-dioxygenase vector biểu pQE30 Gen HQL1 HQL2 biểu thành công chủng vi khuẩn E coli M15 Kiến nghị Tối ưu hóa q trình biểu gen HQL1 HQL2 chủng vi khuẩn E coli M15 Nghiên cứu gắn kết chuỗi polypeptide mã hóa đoạn gen HQL1 HQL2 tạo hydroquinol 1,2-dioxygenase tái tổ hợp có hoạt tính sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Lê Kế Sơn (2014 ), "Báo cáo trạng ô nhiễm dioxin môi trường Việt Nam, Hà Nội" Nguyễn Thị Tâm Thư (2013), Nghiên cứu đa dạng quần xã vi khuẩn kỵ khí lơ xử lý chất diệt cỏ/ dioxin phương pháp phân hủy sinh học, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Hà Nội Hoàng Thị Mỹ Hạnh (2004), "Khả phân hủy 2,4-D dibenzofuran chủng nấm sợi FDN20", Tạp chí Công nghệ Sinh học Tập 2(Số 4), Tr 517528 Nguyễn Bá Hữu, Đàm Thúy Hằng, Đặng Thị Cẩm Hà (2008), "Xác định đoạn gen mã hóa enzyme chuyển hóa chất diệt cỏ từ ba chủng vi khuẩn phân hủy dibenzofuran", Tạp chí Cơng nghệ sinh học Tập 6(Số 2), Tr 257-264 Phùng Khắc Huy Chú (2012), "Phân lập, phân loại chủng vi khuẩn BHNA1 xác định gene tfdA mã hóa cho enzyme phân hủy 2,4-D từ đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin thuộc khu vực Tây – Nam sân bay Biên Hịa", Tạp chí Độc học Tập 21, Tr 3-11 Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà (2007), "Xác định đoạn gen mã hóa Dioxygenaza chủng xạ khuẩn phân hủy Dibenzofuran Rhodococcus SP HDN3 phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin Đà Nẵng", Tạp chí Cơng nghệ sinh học Tập 6(Số 2), Tr 257-264 Nguyễn Đương Nhã (2005), "Khả phân hủy hydrocarbon thơm đa nhân dibenzofuran chủng xạ khuẩn XKDN12", Tạp chí Cơng nghệ Sinh học Tập 3(Số 1), Tr 123-132 Nghiêm Ngọc Minh, Cung Thị Ngọc Mai (2010), "Hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân (PAHs) khả phân hủy sinh học vi khuẩn", Tạp chí Cơng nghệ Sinh học Tập 8(Số 1), Tr 1-11 Nguyễn Nguyên Quang (2010), Phân lập nghiên cứu khả chuyển hóa số chất đa vịng thơm nấm sợi sinh tổng hợp Enzme laccase từ đất nhiễm chất diệt cỏ Dioxin, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội 10 Mai Anh Tuấn, Nghiêm Ngoc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2004), "Nghiên cứu phân loại khả sử dụng hydrocarbon thơm đa nhân, dibenzofuran chủng XKDN19", Tạp chí Cơng nghệ sinh học Tập 2(Số 3), Tr 389-396 11 Nguyễn Hồng Lộc (2007), "Cơng nghệ DNA tái tổ hợp", NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh 12 Nguyễn Hồng Lộc (2007), "Giáo trình Nhập môn công nghệ sinh học", Nxb Đại Học Huế 13 Dương Đức Hồng Sinh (2017), Tạo dịng gen phân giải dibenzofuran từ số chủng vi sinh vật đất, Luận án Thạc sĩ Khoa học, Đại học Khoa Học Huế Tiếng anh 14 Polychlorinated Dibenzofurans (1997), "Polychlorinated dibenzo-paradioxins and polychlorinated dibenzofurans", IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans 69 15 Shanqing Li, Qingzhu Zhang (2015), "Mechanistic studies on the dibenzofuran formation from phenanthrene, fluorene and 9–fluorenone", International journal of molecular sciences 16(3), 5271-5284 16 John H Montgomery (2007), "Groundwater Chemicals Desk Reference, Fourth Edition", CRC Press, Florida, pp 328 -330 17 Tetsushi Watanabe, Teruhisa Hirayama (1992), "Mutagenicity of nitro derivatives produced by exposure of dibenzofuran to nitrogen oxides", Mutation Research Letters 283(1), 35-43 18 Akira Hiraishi (2003), "Biodiversity of dioxin-degrading microorganisms and potential utilization in bioremediation", Microbes and Environments 18(3), 105-125 19 Richard P Pohanish (2017), Sittig's handbook of toxic and hazardous chemicals and carcinogens, William Andrew 20 Miguel Angel Céspedes, Maximo Ibo Galindo, Juan Pablo Couso (2010), "Dioxin toxicity in vivo results from an increase in the dioxin-independent transcriptional activity of the aryl hydrocarbon receptor", PLoS One 5(11), e15382 21 Satoshi Takada (1996), "Degradation of polychlorinated dibenzo-p-dioxins and polychlorinated dibenzofurans by the white rot fungus Phanerochaete sordida YK-624", Applied and environmental microbiology 62(12), 43234328 22 Kazumasa Fukuda, Sumio Nagata, Hatsumi Taniguchi (2002), "Isolation and characterization of dibenzofuran-degrading bacteria", FEMS microbiology letters 208(2), 179-185 23 Shiwei Jin (2006), "Biodegradation of dibenzofuran by Janibacter terrae strain XJ-1", Current microbiology 53(1), 30-36 24 Peng Peng (2013), "Biodegradation of dioxin by a newly isolated Rhodococcus sp with the involvement of self-transmissible plasmids", Applied microbiology and biotechnology 97(12), 5585-5595 25 Hyo-Bong Hong (2004), "Biodegradation of dibenzo-p-dioxin, dibenzofuran, and chlorodibenzo-p-dioxins by Pseudomonas veronii PH-03", Biodegradation 15(5), 303-313 26 Mahmood Mohammadi, Michel Sylvestre (2005), "Resolving the profile of metabolites generated during oxidation of dibenzofuran and chlorodibenzofurans by the biphenyl catabolic pathway enzymes", Chemistry & biology 12(7), 835-846 27 Hideaki Nojiri, Toshio Omori (2002), "Molecular bases of aerobic bacterial degradation of dioxins: involvement of angular dioxygenation", Bioscience, biotechnology, and biochemistry 66(10), 2001-2016 28 Hideaki Nojiri (2002), "Organization and transcriptional characterization of catechol degradation genes involved in carbazole degradation by Pseudomonas resinovorans strain CA10", Bioscience, biotechnology, and biochemistry 66(4), 897-901 29 D Matthew Eby (2001), "Characterization and evolution of anthranilate 1, 2dioxygenase from Acinetobacter sp strain ADP1", Journal of bacteriology 183(1), 109-118 30 Zhonghui Gai (2010), "The genes coding for the conversion of carbazole to catechol are flanked by IS6100 elements in Sphingomonas sp strain XLDN2-5", PLoS One 5(4), e10018 31 Heinz Wilkes (1996), "Degradation of Chlorinated Dibenzofurans and Dibenzo-p-Dioxins by Sphingomonas sp Strain RW1", Applied and environmental microbiology 62(2), 367-371 32 Anthony G Dodge, Lawrence P Wackett (2005), "Metabolism of bismuth subsalicylate and intracellular accumulation of bismuth by Fusarium sp strain BI", Applied and environmental microbiology 71(2), 876-882 33 Rabea Schlüter (2013), "Novel insights into the fungal oxidation of monoaromatic and biarylic environmental pollutants by characterization of two new ring cleavage enzymes", Applied microbiology and biotechnology 97(11), 5043-5053 34 Dayna L Daubaras, Katsuhiko Saido, AM Chakrabarty (1996), "Purification of hydroxyquinol 1, 2-dioxygenase and maleylacetate reductase: the lower pathway of 2, 4, 5-trichlorophenoxyacetic acid metabolism by Burkholderia cepacia AC1100", Applied and environmental microbiology 62(11), 42764279 35 Jean Armengaud, Kenneth N Timmis, Rolf-Michael Wittich (1999), "A Functional 4-Hydroxysalicylate/Hydroxyquinol Degradative Pathway Gene Cluster Is Linked to the Initial Dibenzo-p-Dioxin Pathway Genes inSphingomonas sp Strain RW1", Journal of bacteriology 181(11), 34523461 36 José-Bruno L’Abbée, Diane Barriault, Michel Sylvestre (2005), "Metabolism of dibenzofuran and dibenzo-p-dioxin by the biphenyl dioxygenase of Burkholderia xenovorans LB400 and Comamonas testosteroni B-356", Applied microbiology and biotechnology 67(4), 506-514 37 Yoon-Seok Chang (2008), "Recent developments in microbial biotransformation and biodegradation of dioxins", Journal of molecular microbiology and biotechnology 15(2-3), 152-171 38 Debdas Mukerjee (1998), "Health impact of polychlorinated dibenzo-pdioxins: a critical review", Journal of the air & waste management association 48(2), 157-165 39 David A Jackson, Robert H Symons, Paul Berg (1972), "Biochemical method for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40: circular SV40 DNA molecules containing lambda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli", Proceedings of the National Academy of Sciences 69(10), 2904-2909 40 Huiying Chu (2012), "Investigation of family 18 chitinases and inhibitors by computer-aided approaches", Current drug targets 13(4), 502-511 41 John Hodgson (1994), "The changing bulk biocatalyst market", Bio/technology (Nature Publishing Company) 12(8), 789-790 42 John EG, McCarthy (1998), "Posttranscriptional control of gene expression in yeast", Microbiology and Molecular Biology Reviews 62(4), 1492-1553 43 Mariëlle JH Moonen (2008), "Hydroquinone dioxygenase from Pseudomonas fluorescens ACB: a novel member of the family of nonheme-iron (II)-dependent dioxygenases", Journal of Bacteriology 190(15), 5199-5209 44 Marta Ferraroni (2005), "Crystal structure of the hydroxyquinol 1, 2dioxygenase from Nocardioides simplex 3E, a key enzyme involved in polychlorinated aromatics biodegradation", Journal of Biological Chemistry 280(22), 21144-21154 45 Markus Latus (1995), "Purification and Characterization of Hydroxyquinol 1, 2-Dioxygenase from Azotobacter sp Strain GP1", Applied and environmental microbiology 61(7), 2453-2460 46 Martin John Boddington (1990), Polychlorinated Dibenzodioxins and Polychlorinated Dibenzofurans, Environment Canada 47 Moon-Sik Yang, "Basic protocols of molecular biology", Professor of plant molecular biology Chonbuk National University, South Korea 48 Ulrich K Laemmli (1970), "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", nature 227(5259), 680 PHỤ LỤC 480271 480331 480391 480451 480511 480571 480631 480691 Query ATGACCGACACGGCATTCCACACCGTCTTTGGCTCGCTCGACCATTACCGCAAGGGCGAG 60 Sbjct 480212 ATGACCGACACGGCATTCCACACCGTCTTTGGCTCGCTCGACCATTACCGGAAGGGCGAG Query 61 ATCGAAATCACCAGCGGCAGCGCCCGACACTACGCGTTCTCGAACGTGTTCGAGGTCGCA 120 Sbjct 480272 ATCGAAATCACCAGCGGCAGCGCCCGGCACTACGCGTTCTCGAACGTGTTCGAGGTCGCA Query 121 TCGAAATCGGCGCCGTATGAAAAGGTCGTCGCCGGCAAGAACCTCGAATACGTGATCGAA 180 Sbjct 480332 TCGAAATCGGCGCCGTATGAAAAGGTCGTCGCCGGCAAGAACCTCGAATACGTGATCGAA Query 181 GTACTGCGGACCGACGGCCAGTCGCCGTGGTTCGCGTGCTCGCACGACGAGTTCGTGATC 240 Sbjct 480392 GTGCTGCGGACCGACGGCCAGTCGCCGTGGTTCGCGTGCTCGCACGACGAGTTCGTGATC Query 241 CAGATGGACGGCGAGGTCCGGATCGACTTCATCAAGCTCGATTCGCCGCCGAAACCGGGG 300 Sbjct 480452 CAGATGGACGGCGAAGTCCGGATCGACTTCATCAAGCTCGATTCGCCGCCTAAACCGGGG Query 301 CGCGGCACCGTGAGCGCCGGCGCCCAGCCGGCCGGCCGCAAGATGGGGTATGTCGTGCTG 360 Sbjct 480512 CGCGGCGCCGTGAGCGCCGGCGCCCAGCCGGCCGGCCGCAAGATGGGGTATGTCGTGCTG Query 361 CGCAAGGGCCATCAGGCGCTGCTGCCGGCCGGTTGTGCATACCGCTTCACCGCGAGCCGG 420 Sbjct 480572 CGCAAGGGCCATCAGGCGCTGCTGCCGGCCGGTTGTGCATACCGCTTCACCGCGAGCCGG Query 421 CCGGGCGTCGCGCTGGTGCAGACCGTCCTTGGCGAGCTGTCCGTGGAGAAGTGGGCCGAA 480 Sbjct 480632 CCGGGCGTCGCGCTGGTGCAGACCGTCCTTGGCGAGCTGTCCGTGGAGAAGTGGGCCGAG Query Sbjct 481 480692 ATCTGCCTGCACTGA ATCTGCCTGCACTGA 495 480706 Trình tự gen hydroxyquinol 1,2-dioxygenase (HQL1) từ chủng B cepacia DF2 Chú thích: Query: gen HQL1; Sbjct: CP013376 Query Sbjct 480804 Query Sbjct 480864 Query Sbjct 480924 Query Sbjct 480984 Query Sbjct 481044 Query Sbjct 481104 Query Sbjct 481164 Query Sbjct 481224 Query Sbjct 481284 Query Sbjct 481344 Query Sbjct 481404 Query Sbjct 481464 Query Sbjct 481524 Query Sbjct 481584 Query Sbjct 481644 Query Sbjct 481704 Query Sbjct 481764 Trình tự gen hydroxyquinol 1,2-dioxygenase (HQL2) từ chủng B cepacia DF2 Chú thích: Query: gen HQL2; Sbjct: CP013376 ... ? ?Nghiên cứu biểu gen HQL1 HQL2 mã hóa hydroxyquinol 1,2- dioxygenase vi khuẩn Escherichia coli M15? ?? Mục tiêu nghiên cứu Sử dụng kỷ thuật sinh học phân tử công nghệ DNA tái tổ hợp để biểu gen HQL1. .. gen HQL1 HQL2 mã hóa hydroxyquinol 1, 2dioxygenase vector biểu pQE30 Biểu gen HQL1 HQL2 mã hóa hydroxyquinol 1,2- dioxygenase E coli M15 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài nghiên cứu Ý nghĩa khoa... trình tạo dịng biểu biểu gen HQL1 HQL2 mã hóa hydroxyquinol 1,2- dioxygenase tế bào E coli M15 Ý nghĩa thực tiễn: Biểu thành công gen HQL1 HQL2, tạo sở để sản xuất hydroxyquinol 1,2- dioxygenase tái