ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MÔI TRƯỜNG NGUYỄN NGỌC QUỲNH NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN HQL1 VÀ HQL2 MÃ HÓA HYDROXYQUINOL 1,2DIOXYGENASE TRONG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI M15 Đà Nẵng – Năm 2018 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MÔI TRƯỜNG NGUYỄN NGỌC QUỲNH NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN HQL1 VÀ HQL2 MÃ HÓA HYDROXYQUINOL 1,2DIOXYGENASE TRONG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI M15 Ngành: Công nghệ Sinh học Người hướng dẫn: ThS Vũ Đức Hoàng Đà Nẵng – Năm 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu nghiên cứu trung thực chưa công bố cơng trình khác Các số liệu liên quan trích dẫn có ghi nguồn gốc Tơi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm kết sản phẩm kế thừa công bố người khác Người cam đoan Nguyễn Ngọc Quỳnh ii LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, em xin bày tỏ lời biết ơn chân thành đến GS Nguyễn Hoàng Lộc ThS Vũ Đức Hồng tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt suốt trình thực hồn thành khóa luận Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn ThS Dương Đức Hoàng Sinh, người trực tiếp hướng dẫn cho em, tận tình giúp đỡ em trình nghiên cứu Đồng thời, em vô biết ơn tất anh chị, bạn sinh viên phòng thí nghiệm, thầy cô giáo Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học, Đại học Huế quan tâm, giúp đỡ bảo tận tình cho em q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp Ngoài ra, em nhận giúp đỡ nhiệt tình thầy giáo Khoa Sinh – Môi trường, Trường đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng tạo điều kiện tốt để em thực đề tài, em xin chân thành cảm ơn Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân khích lệ, động viên tinh thần cho em suốt thời gian học tập làm việc Trong trình làm việc, bước đầu làm quen với chun mơn mắc nhiều sai sót, em cố gắng tìm tòi học hỏi để ngày trưởng thành Em xin chân thành cảm ơn! Đà Nẵng, ngày 27 tháng năm 2018 Sinh viên Nguyễn Ngọc Quỳnh iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ DIBENZOFURAN 1.1.1 Dioxin 1.1.2 Nguồn gốc 1.1.3 Cấu trúc hóa học 1.1.4 Tính chất lý hóa 1.1.5 Tác hại 1.1.6 Dibenzofuran 1.1.7 Nguồn gốc 1.1.8 Cấu trúc hóa học 1.1.9 Tính chất lý hóa 1.1.10 Tác hại 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU DIOXIN 1.2.1 Tình hình nghiên cứu sử dụng vi sinh vật xử lý dioxin giới iv 1.2.2 Tình hình nghiên cứu sử dụng vi sinh vật xử lý dioxin nước 1.3 ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG PHÂN HỦY DIBEZOFURAN 11 1.3.1 Các enzyme phân giải dibenzofuran 11 1.3.2 Các vi sinh vật tái tổ hợp phân hủy dibenzofuran 15 1.4 TỔNG QUAN VỀ CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP 17 1.5 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ENZYME HYDROXYQUINOL 1,2DIOXYGENASE 19 1.5.1 Cấu tạo 19 1.5.2 Tình hình nghiên cứu hydroxyquinol 1,2-dioxygenase giới 19 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 21 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.2.1 Phân lập gen HQL1 HQL2 từ vi khuẩn E coli TOP10 mang vector tái tổ hợp pGEM®-T Easy/HQL1 pGEM®-T Easy/HQL2 21 2.1.2 Tạo dòng gen HQL1 HQL2 vector biểu pQE30 23 2.1.3 Biểu gen HQL1 HQL2 E coli M15 25 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 PHÂN LẬP GEN HQL1 VÀ HQL2 TỪ VI KHUẨN E COLI TOP10 MANG VECTOR TÁI TỔ HỢP PGEM®-T EASY/HQL1 VÀ PGEM®-T EASY/HQL2 27 3.2.TẠO DỊNG GEN HQL1 VÀ HQL2 TRONG VECTOR BIỂU HIỆN PQE30… ………………………………… 29 3.3 BIỂU HIỆN GEN HQL1 VÀ HQL2 TRONG E COLI M15 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tên đầy đủ 1,2,3,4-TCDD : 1,2,3,4-tetrachlorodibenzo-p-dioxin 1,2,3,7,8-PeCDD : 1,2,3,7,8-pentachlorodibenzo-p-dioxin 2,3,7,8-TCDD : 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin 2,4,5-T : 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid 2,4-D : 2,4-dichlorophenoxyacetic acid AHR : Aryl hydrocarbon receptor (chất thụ cảm nhân thơm) AHRE : Aryl hydrocarbon response element bp : Base pair BPDO : Biphenyl dioxygenase DD : Dibenzo-p-dioxin DF : Dibenzofuran Epp : Eppendorf HpCDF : Heptachlorodibenzofuran HxCDD : Hexachlorodibenzo-p-dioxin HxCDF : Hexachlorodibenzofuran IARC : International Agency for Research on Cancer (Tổ chức nghiên cứu Ung thư quốc tế) IPTG : Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside I-TEF : International toxic equivalency factor (hệ số độc tương đương theo qui định quốc tế) LB : Môi trường Luria Bertani MSM : Minimal salt medium (Môi trường muối tối thiểu) OCDF : Octachlorodibenzofuran PCB : Polychlorinated biphenyl vi PCDD : Polychlorinated dibenzo-p-dioxin PCDD/F : Polychlorinated dibenzo-p-dioxin dibenzofuran PCDF : Polychlorinated dibenzofuran PCR : Polymerase Chain Reaction PeCDF : Pentachlorodibenzofuran TCDF : Tetrachlorodibenzofuran TEF : Toxic equivalency factor (hệ số độc tương đương) TEQ : Toxic equivalent (độ độc tương đương) U : Unit (đơn vị) DW : Deionized water vii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Hệ số độc tương đồng dẫn xuất DF Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi 24 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc PCDD Hình 1.2 Cấu trúc dibenzofuran PCDF Hình 1.3 Sự tạo thành DF q trình oxy hóa Hình 1.4 Con đường chuyển hóa biphenyl chủng Burkholderia sp LB400 12 Hình 1.5 Quá trình oxy hóa DF enzyme chuyển hóa biphenyl chủng Burkholderia sp LB400 13 Hình 1.6 Con đường chuyển hóa carbazole chủng Sphingomonas sp XLDN2-5 14 Hình 1.7 Chuyển hóa catechol enzyme catechol 1,2-dioxygenase 15 Hình 2.1 Vector biểu pQE30 ……………………………………………… 21 Hình 3.1 Vector pGEM®-T Easy/HQL1 pGEM®-T Easy/HQL2…………… 27 Hình 3.2 Cắt hạn chế pGEM®-T Easy/HQL1 pGEM®-T Easy/HQL2 BamHI HindIII 28 Hình 3.3 Tinh gen HQL2 HQL1 28 Hình 3.4 Tinh vector pQE30 29 Hình 3.5 PCR khuẩn lạc E coli TOP10 mang pQE30/HQL1 pQE30/HQL2 29 Hình 3.6 Vector tái tổ hợp pQE30/HQL1 pQE30/HQL2 30 Hình 3.7 PCR khuẩn lạc E coli M15 mang vector pQE30/HQL1 pQE30/HQL2 31 Hình 3.8 Tiểu đơn vị protein mã hóa gen HQL1 HQL2 32 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Các chất hữu đa vòng thơm chứa chlorine bao gồm hợp chất có cấu trúc 2-3 vòng thơm chứa từ đến nguyên tử chlorine phân tử Đây chất có độ độc cao tùy thuộc vào số lượng vị trí nguyên tử chlorine phân tử Các chất gọi chung dioxin [2], chia thành nhóm hợp chất polychlorinated dibenzo-p-dioxin, polychlorinated dibenzofuran polychlorinated bipheny [1] Chúng hình thành q trình sản xuất hóa chất, giấy bột giấy Thời gian bán hủy chúng đất từ 15 đến 100 năm nên chúng di chuyển sâu vào đất thời gian tồn môi trường lâu dài, đe dọa đến hệ sinh thái sức khỏe người [1] Các đồng phân dibenzofuran chứa chlorine, furan không chứa chlorine hydrocarbon thơm đa nhân hợp chất độc ngày phát tán rộng rãi môi trường Một số chất hình thành trình sản xuất thuốc diệt cỏ thuốc trừ sâu trình thiêu đốt đô thị số đồng phân sản phẩm phụ tạo ý muốn công nghệ lạc hậu Những chất bị phân hủy số chất có chu trình bán phân hủy đến vài chục năm [3] Việc khử độc chất ô nhiễm khôi phục môi trường vùng đất bị nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin cấp bách Có nhiều phương pháp để xử lý đất ô nhiễm dioxin phương pháp vật lý, hóa học sinh học Tuy nhiên, phương pháp thường có giá thành cao khó kiểm sốt ô nhiễm thứ cấp [3] Phương pháp phân hủy sinh học dựa kích thích tập đồn vi sinh vật địa phân hủy chất ô nhiễm thu hút kết khả quan tẩy độc đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin [4] Phân hủy sinh học phương pháp có nhiều triển vọng giá thành thấp so với phương pháp vật lý hóa học Ngồi ra, phương pháp an tồn mơi trường khơng tạo sản phẩm thứ cấp Tuy nhiên, phương pháp đòi hỏi thời gian lâu phương pháp khác Q trình oxy hóa cắt vòng benzene điều kiện hiếu khí hay khử loại chlorine điều kiện kỵ khí thực enzyme vi sinh vật thơng qua phản ứng sinh hóa [3] 2 Trong năm 2016-2017, phòng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học-Bộ môn Công nghệ Sinh học-Khoa Sinh học-Trường Đại học Khoa học-Đại học Huế, phân lập thành công chủng Burkhoderia cepacia DF2 Burkhoderia cepacia DF4 có khả phân hủy sinh học dibenzofuran Qua đó, khuếch đại gắn thành công gen (BphA, CAT1, ATH, HQL) mã hóa enzyme dioxygenase vào vector pGEM®T Easy, tạo dòng thành cơng tế bào E coli TOP10 Để tiếp tục định hướng nghiên cứu sản xuất enzyme tái tổ hợp, tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu biểu gen HQL1 HQL2 mã hóa hydroxyquinol 1,2-dioxygenase vi khuẩn Escherichia coli M15” Mục tiêu nghiên cứu Sử dụng kỷ thuật sinh học phân tử công nghệ DNA tái tổ hợp để biểu gen HQL1 HQL2 mã hóa hydroxyquinol 1,2-dioxygenase vi khuẩn E coli M15 nhằm tiến tới sản xuất protein tái tổ hợp có giá trị xử lý hợp chất độc dibenzofuran Nội dung nghiên cứu Tạo dòng biểu gen HQL1 HQL2 mã hóa hydroxyquinol 1,2dioxygenase vector biểu pQE30 Biểu gen HQL1 HQL2 mã hóa hydroxyquinol 1,2-dioxygenase E coli M15 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài nghiên cứu Ý nghĩa khoa học: Cung cấp dẫn liệu khoa học quy trình tạo dòng biểu biểu gen HQL1 HQL2 mã hóa hydroxyquinol 1,2-dioxygenase tế bào E coli M15 Ý nghĩa thực tiễn: Biểu thành công gen HQL1 HQL2, tạo sở để sản xuất hydroxyquinol 1,2-dioxygenase tái tổ hợp quy mơ phòng thí nghiệm, có khả phân hủy sinh học dibenzofuran, phục vụ công tác xử lý môi trường 3 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan dibenzofuran 1.1.1 Dioxin Dioxin dẫn xuất chúng nhóm bao gồm hàng trăm hợp chất hữu độc hại tồn bền vững mơi trường, có nhóm hợp chất polychlorinated dibenzo-p-dioxin, polychlorinated dibenzofuran polychlorinated biphenyl [1] 1.1.2 Nguồn gốc Các trình đốt cháy q trình nhiệt ln xem nguồn phát thải dioxin vào mơi trường Ngồi ra, chúng hình thành q trình sản xuất nhiều ngành công nghiệp khác công nghiệp hóa chất, cơng nghiệp xi măng, tinh luyện tái chế kim loại, công nghiệp giấy bột giấy, công nghiệp dệt may [1], [37] 1.1.3 Cấu trúc hóa học Polychlorinated dibenzo-p-dioxin hay gọi dioxin, cấu tạo hai vòng thơm liên kết với hai nguyên tử oxy nên chúng coi diether hai vòng benzene Nó bao gồm 75 chất, chia thành nhóm tương ứng với số nguyên tử chlorine phân tử từ đến (Hình 1.1) [1] Hình 1.1 Cấu trúc PCDD [1] 1.1.4 Tính chất lý hóa Ở điều kiện thường, dioxin chất rắn màu trắng, kết tinh mịn, bền vững mơi trường Nhiệt độ nóng chảy 305-306oC, nhiệt độ sôi 412oC, nhiệt độ tạo thành 750900oC, bị phân hủy hoàn toàn nhiệt độ 1200-1400oC cao Áp suất bay số Henry chúng thấp Do độ phân cực thấp nên chúng gần không tan nước mà tan tốt dung môi hữu 1,2-dichlorobenzene, chlorobenzene, chloroform, benzene đặc biệt tan tốt dầu mỡ [1] Các phản ứng phân hủy doxin thực điều kiện đặc biệt nhiệt độ cao, chất xúc tác, acid có tính oxy hóa mạnh, kiềm đặc Ở nhiệt độ khoảng 250oC, chúng bị acid vơ có tính oxy hóa mạnh phân hủy hồn tồn thành chất khơng độc Dưới tác dụng kiềm đặc, nhiệt độ áp suất cao, nguyên tử chlorine bị thay dần nhóm hydroxyl để trở hành hợp chất độc Tia tử ngoại phân hủy dioxin theo hướng đề chlorine hoá, sinh sản phẩm chlorine thấp không chứa chlorine [1] 1.1.5 Tác hại Dioxin hợp chất độc mà người biết đến Trong đó, 2,3,7,8-TCDD chất độc nhất, chất gây ung thư cho người (ung thư tổ chức phần mềm, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư đường hơ hấp ung thư phổi, phế quản, khí quản, quản), ngồi tác nhân gây bệnh nguy hiểm khác bệnh sạm da, bệnh tiểu đường, bệnh đa u tủy, u lympho ác tính, bệnh thần kinh ngoại vi dẫn đến tử vong Nguy hiểm hơn, gây thiểu sinh dục cho nam nữ, sinh quái thai, dị dạng tổ chức nghiên cứu Ung thư quốc tế - IARC xếp vào nhóm độc loại 1, tức nhóm gây ung thư dẫn đến tử vong người [1], [2], [38] 1.1.6 Dibenzofuran Dibenzofuran thành phần phổ biến chất gây ô nhiễm môi trường, xác định có khơng khí, nước ngầm, khí đốt nhiên liệu, khói từ lò đốt rác thải thị, khí thải từ động diesel [17] 1.1.7 Nguồn gốc Dibenzofuran dẫn xuất hình thành từ nguồn đốt cháy than đá, dầu, gỗ, rác thải hay hợp chất hữu thuốc lá, công nghiệp hóa chất, cơng nghiệp bột giấy giấy có sử dụng chlorine để tẩy, cố tràn dầu Chúng tìm thấy bề mặt dầu thô, than đá, nhựa than đá, dầu Giống dioxin, DF dẫn xuất có mặt mơi trường nước, khơng khí, đất Ngồi ra, chúng có thịt, trứng, sữa, cá Trong khơng khí, chúng đồng thời cơng liên kết vào phần tử bụi cát sau tích tụ đất trầm tích [8], [46], [14] Q trình chlorine hóa DF đóng vai trò quan trọng việc hình thành PCDF cơng nghiệp hóa chất [15] Schauer công (1999) báo cáo DF nhiên liệu diesel khoảng 29 µg/g khí thải động diesel khoảng 28,7 µg/km [16] 1.1.8 Cấu trúc hóa học Dibenzofuran (C12H8O) hay gọi với tên khác 2,2’- biphenylene oxide, dibenzo (b,d) furan, diphenylene oxide Thuộc loại cấu trúc hydrocarbon thơm đa vòng [16] Là hợp chất có cấu trúc gồm nhân benzene nối với cầu nối biaryl có chứa nguyên tử oxygen, dạng cấu trúc hóa học với fluorene carbazole (Hình 1.2) Hiện nay, dibenzofuran sử dụng mơ hình nghiên cứu chế phân hủy chất dạng dioxin phòng thí nghiệm [7] PCDF hay gọi furan, gồm 135 chất chia thành nhóm tương ứng với số nguyên tử chlorine phân tử từ đến (Hình 1.2) [1], [18] Hình 1.2 Cấu trúc dibenzofuran PCDF [1], [18] 1.1.9 Tính chất lý hóa Ở nhiệt độ thường, DF có dạng tinh thể trắng, nhiệt độ nóng chảy 82°C, nhiệt độ bay 287°C, áp suất 2,48 x 10-3 mmHg 25oC Tan tốt acetic acid, acetone, ethanol, ether, benzene, toluene, ethylbenzene [16] Các dẫn xuất DF có tính chất vật lí tương tự dioxin, chúng chất rắn nhiệt độ thường, nhiệt độ nóng chảy nhiệt độ sơi cao, áp suất số Henry thấp nên chúng tan nước tan tốt dầu mỡ [1] Đây hợp chất bền vững, có lực mạnh trầm tích có khả tích tụ cao mơ sinh học [46] Thời gian bán hủy DF đất điều kiện hiếu khí ước tính từ – 28 ngày, điều kiện kị khí từ 28 – 112 ngày, nước ngầm từ – 35 ngày Trong khí quyển, thời gian bán hủy khoảng từ 1,9 – 19 dựa vào phản ứng với gốc OH [16] DF tạo thành q trình oxy hóa hợp chất phenanthrene, fluorene, 9-methylfluorene, 9-fluorenone (Hình 1.3) [15] Hình 1.3 Sự tạo thành DF q trình oxy hóa [15] 1.1.10 Tác hại Dibenzofuran vào thể qua đường hô hấp tiếp xúc với da Khi tiếp xúc nhiều với DF gây phát ban biến đổi màu da [19] Dựa vào số lượng nguyên tử chlorine vị trí chúng phân tử mà xác định độc tính PCDF, phân tử có nguyên tử chlorine trở lên vào vị trí 2, 3, có chế gây độc tương tự 2,3,7,8-TCDD độ độc Chúng có khả gây ảnh hưởng liều tiếp xúc nhỏ ảnh hưởng kéo dài từ hệ sang hệ khác, có khả ảnh hưởng tới q trình mã thơng tin di truyền tổng hợp protein nhân tế bào Việc tổng hợp protein cách khơng kiểm sốt thể nguyên nhân gây tai biến sức khỏe Thêm vào đó, việc gây nhiễu loạn trình mã dẫn tới hậu làm thay đổi thông tin di truyền gây đột biến gen di truyền từ hệ sang hệ khác [1] Tương tự dioxin, chúng kết hợp với chất thụ cảm nhân thơm AHR tế bào, cặp phức chất tương tác tiếp với phối tử chuyển nhân di chuyển vào nhân tế bào Tại đây, chúng tương tác với đoạn gen đặc hiệu chuỗi DNA có tên gọi AHRE, kết dẫn tới mã sai lệch mRNA gây tổng hợp nhiều gen enzyme khác [1], [20], [14] Mức độ tương đối độ độc chất hữu khó phân hủy biểu thị thông qua giá trị gọi hệ số độc tương đương (Toxic Equivalency Factor), giá trị TEF 2,3,7,8-TCDD qui định Giá trị TEF cho 10 dẫn xuất DF theo qui định quốc tế (International-TEF) thể bảng 1.1 [1] Bảng 1.1 Hệ số độc tương đồng dẫn xuất DF [1] Tên chất I-TEF Tên chất I-TEF 2,3,7,8-TCDF 0,1 1,2,3,7,8,9-HxCDF 0,1 1,2,3,7,8-PeCDF 0,05 2,3,4,6,7,8-HxCDF 0,1 2,3,4,7,8-PeCDF 0,5 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 0,01 1,2,3,4,7,8-HxCDF 0,1 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 0,01 1,2,3,6,7,8-HxCDF 0,1 OCDF 0,001 Những chất giữ lại thể động vật người, tập trung chủ yếu mỡ, gan Mặc dù, chúng thể người chuyển hóa tiết q trình xảy chậm thời gian bán hủy chúng thể người từ vài năm đến vài chục năm [1], [46] Thí nghiệm động vật, PCDF có chlorine vị trí 2,3,7,8 có độc tính tương tự PCDD Một số PCDF chứng minh gây quái thai chuột [14] Nghiên cứu người ăn phải dầu gạo bị ô nhiễm PCB, PCDF Nhật Bản Đài Loan Trong hai trường hợp, ngộ độc tương tự ngộ độc chloracne, nồng độ triglyceride cao, triệu chứng thần kinh bất thường, thay đổi nhãn khoa thay đổi thông số miễn dịch [14] Phụ nữ tiếp xúc với vài miligram furan dầu gạo bị ô nhiễm dẫn đến sinh dị tật tử vong trẻ sơ sinh [46] 1.2 Tình hình nghiên cứu Dioxin 1.2.1 Tình hình nghiên cứu sử dụng vi sinh vật xử lý dioxin giới Nhiều nghiên cứu giới chứng minh số loài vi sinh vật chứa gen tham gia trình phân hủy, xúc tác hay chuyển hóa hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân, dibenzofuran, congener khác polychorinated dibenzo-p-dioxin polychlorinated dibenzofuran Sphingomonas sp RW1, chủng Pseudomonas HH69, NCGB 9816, CA10 , Terrabacter sp DPO136, 360, Staphylococcus auriculans DBF63, vài loài chi Rhodococcus, nấm đảm Phanerochaete chrysosporium, P Sordida YK-624, nấm men, nấm sợi [7] Takada đồng tác giả (1996) nghiên cứu khả phân hủy polychlorinated dibenzo-p-dioxin polychlorinated dibenzofuran nấm mục rửa trắng Phanerochaete sordida YK-624 Kết cho thấy khả phân hủy polychlorinated dibenzo-p-dioxin: 40% (tetra-chloro-) đến 76% (hexachloro-) khả phân hủy polychlorinated dibenzofuran: 45% (tetra-chloro-) đến 70% (hexachloro-) [21] Fukuda đồng tác giả (2002) phân lập chủng vi khuẩn Klebsiella sp HL1 Sphingomonas sp HL7 có khả sử dụng dibenzofuran nguồn carbon phân lập từ mẫu đất khu đất hoang Các chất chuyển hóa từ dibenzofuran chủng HL1 HL7 tương tự vi khuẩn phân hủy dioxin Sphingomonas sp RW1 Chủng HL7 có gen tương đồng với gen mã hóa enzyme dioxygenase (dxnA1) chủng Sphingomonas sp RW1 [22] Năm 2004, Hong đồng tác giả phân lập chủng Pseudomonas veronii PH-03 từ đất bị ô nhiễm kỹ thuật tăng sinh chọn lọc Chủng PH-03 sử dụng dibenzo-p-dioxin dibenzofuran nguồn carbon Hơn nữa, 1chlorodibenzo-p-dioxin, 2-chlorodibenzo-p-dioxin chất chuyển hóa dioxin khác, salicylic acid catechol chuyển hóa tốt [25] Năm 2006, Jin đồng tác giả phân lập chủng Janibacter terrae XJ-1 có khả sử dụng dibenzofuran Chủng có khả nhân đơi sau 12 300C phân giải hoàn toàn 100 mg/L dibenzofuran ngày, sản sinh 2,2', 3trihydroxybiphenyl, salicylic acid, gentisic acid, chất chuyển hóa khác [23] Peng đồng tác giả (2013) phân lập chủng Rhodococcus sp p52 sử dụng dibenzofuran loại bỏ hồn tồn dibenzofuran 500 mg/L vòng 48 Chủng p52 loại bỏ 70% 2-chlorodibenzofuran 100 mg/L 96 chuyển hóa hợp chất thơm dibenzo-p-dioxin, biphenyl, fluorene, dibenzothiophene, 2,8-dichlorodibenzofuran Hai gen mã hóa enzyme dioxygenase (DbfA DfdA) khuếch đại giải trình tự [24] 1.2.2 Tình hình nghiên cứu sử dụng vi sinh vật xử lý dioxin nước Năm 2004, Hoàng Thị Mỹ Hạnh đồng tác giả nghiên cứu khả phân hủy 2,4-D dibenzofuran chủng nấm sợi FDN20 phân lập đất ô nhiễm chất độc hóa học Kết xác định phần trình tự gen 18S rRNA cho thấy FDN20 có độ tương đồng 97,3% với chi Acremonium Chủng FDN20 có khả phát triển tốt mơi trường chứa 3% NaCl, pH 280C Sau ngày ni cấy, mơi trường muối khống chứa 1% glucose, chủng FDN20 phân hủy 30% dibenzofuran 44% 2,4D [3] Mai Anh Tuấn đồng tác giả (2004) nghiên cứu phân loại khả sử dụng hydrocarbon thơm đa nhân, dibenzofuran chủng xạ khuẩn XKDN19 phân lập khu đất nhiễm chất độc sân bay Đà Nẵng Kết chủng xạ khuẩn XKDN19 có khả phân hủy 78,7% anthracene, 22,36% flouranthene với nồng độ ban đầu 10 chất 100 ppm chủng không sử dụng dibenzofura nguồn lượng carbon [10] Nguyễn Đương Nhã đồng tác giả (2005) nghiên cứu khả phân hủy hydrocarbon thơm đa nhân dibenzofuran chủng xạ khuẩn XKDN12 phân lập từ đất bị ô nhiễm dioxin sân bay Đà Nẵng Trình tự đoạn gen 16S rRNA (khoảng 550 bp) chủng đăng ký ngân hàng gen Chủng XKDN12 phát triển tốt nồng độ NaCl 1%, pH nhiệt độ 300C Sau ngày nuôi cấy lắc, 32,72% phenanthrene; 39,01% anthracene; 39,01% fluoranthene bị phân hủy nồng độ ban đầu chất 100 ppm Chủng xạ khuẩn phân hủy 32,1% dibenzofuran sau 10 ngày nuôi cấy điều kiện lắc [7] Nguyễn Bá Hữu Đặng Thị Cẩm Hà (2007) xác định gen mã hóa dioxygenase chủng xạ khuẩn phân hủy dibenzofuran Rhodococcus sp HDN3 phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin Đà Nẵng Kết trình tự đoạn gen mã hóa enzyme dioxygenase chủng HDN3 có mức tương đồng cao 99% với đoạn gen mã hóa enzyme dioxygenase chủng xạ khuẩn Terrabacter sp DBF63, Mycobacterium sp YK18; 98% với gen mã hóa tiểu đơn vị alpha angular dioxygenase chủng xạ khuẩn Rhodococcus sp YK2, Rhodococcus sp DFA3 [6] Năm 2008, Nguyễn Bá Hữu đồng tác giả xác định đoạn gen mã hóa enzyme chuyển hóa chất diệt cỏ từ ba chủng vi khuẩn phân hủy dibenzofuran Kết đoạn gen tfdA, tfdAα giống cadA phát chủng vi khuẩn sử dụng dibenzofuran Rhodococcus sp HDN3, Paenibacillus sp Ao3 Terrabacter sp DMA phân lập từ đất trầm tích nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin Đà Nẵng [4] Nguyễn Nguyên Quang đồng tác giả (2009) phân lập phân loại nấm sợi sử dụng chất diệt cỏ chứa dioxin từ đất nhiễm chất độc hóa học quân cũ Đà Nẵng Kết phân lập 15 chủng nấm sợi: chủng sử dụng dịch chiết đất chứa dioxin nguồn cacbon lượng nhất; chủng có khả phát triển mơi trường có chứa 2,4,5-T glucose; chủng phát triển môi trường chứa dịch chiết đất chứa dioxin glucose Ba chủng FDN4, FDN9 FDN10 phát triển tốt mơi trường khống bổ sung 2,4,5-T dịch chiết đất có mặt glucose khơng bổ sung glucose Dựa đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào 11 tử so sánh phần trình tự gen mã hóa 18S rRNA chủng FDN9, chủng xếp vào chi Aspergillus có tên Aspergillus sp FDN9 [9] Năm 2012, Phùng Khắc Huy Chú đồng tác giả phân lập, phân loại chủng vi khuẩn BHNA1, xác định gen tfdA mã hóa cho enzyme phân hủy 2,4-D từ đất nhiễm chất diệt cỏ/ dioxin thuộc khu vực Tây Nam sân bay Biên Hòa Kết phân lập chủng vi khuẩn có khả sinh trưởng dịch chiết đất chứa dioxin, 2,4,5T 2,4-D nguồn carbon lượng Dựa đặc điểm hình thái trình tự gen 16S rRNA, chủng vi khuẩn BHNA1 thuộc chi Pseudomonas đặt tên Pseudomonas sp BHNA1 Chủng có mang đoạn gen tfdA mã hóa cho enzyme 2,4-D/α-ketoglutarate dioxygenase Đoạn gen có mức tương đồng từ 67-96% với gen chức tương tự công bố [5] 1.3 Ứng dụng Công nghệ Sinh học phân hủy dibezofuran 1.3.1 Các enzyme phân giải dibenzofuran a) Biphenyl 2,3-dioxygenase Biphenyl 2,3-dioxygenase hay gọi biphenyl dioxygenase, enzyme xúc tác bước đường chuyển hóa biphenyl Nó oxy hóa loạt chất tương tự biphenyl, bao gồm PCB, DF, DD [26] Enzyme chủng Burkholderia sp LB400 enzyme phân giải PCB tốt có nguồn gốc tự nhiên Biphenyl dioxygenase enzyme ba thành phần Nó bao gồm iron-sulfur protein làm xúc tác cho việc bổ sung phân tử oxygen, flavoprotein reductase ferredoxin liên quan đến việc chuyển electron từ NADH đến iron-sulfur protein Các thành phần biphenyl dioxygenase mã hóa bphA (tiểu đơn vị α iron-sulfur protein), bphE (tiểu đơn vị β iron-sulfur protein), bphF (ferredoxin) bphG (flavoprotein reductase) chủng Burkholderia sp LB400 (Hình 1.4) [26] 12 Hình 1.4 Con đường chuyển hóa biphenyl chủng Burkholderia sp LB400 [26] Gần đây, biphenyl 2,3-dioxygenase, enzyme oxy hóa ban đầu đường chuyển hóa biphenyl chủng Burkholderia sp LB400 chủng P pseudoalcaligenes KF707 báo cáo có khả oxy hóa góc DF DD (Hình 1.5) [27] Tuy nhiên, biphenyl dioxygenase chủng Burkholderia sp LB400 oxy hóa DF khơng hiệu [26] 13 Hình 1.5 Q trình oxy hóa DF enzyme chuyển hóa biphenyl chủng Burkholderia sp LB400 [26] b) Anthranilate 1,2-dioxygenase Chủng Pseudomonas resinovorans CA10 sử dụng carbazole (hợp chất tương tự DF) nguồn carbon, nitrogen lượng Chủng phân giải carbazole thành catechol thông qua anthranilate, sau catechol chuyển hóa thơng qua đường phân cắt orthor [28], [27] Anthranilate chuyển hóa thành catechol enzyme anthranilate 1,2-dioxygenase chủng vi khuẩn Sphingomonas sp XLDN2-5, Acinetobacter sp ADP1 phân giải carbazole (Hình 1.6) [29], [30] 14 Hình 1.6 Con đường chuyển hóa carbazole chủng Sphingomonas sp XLDN2-5 [30] Sản phẩm khung với nét đứt khơng ổn định chưa phát (Hình 1.6) Các enzyme hợp chất hình 1.6 gồm: carbazole 1,9a-dioxygenase (carAaAcfdr), meta-cleavage enzyme (carBaBb), hydrolase (carC), anthranilate 1,2dioxygenase (antAcAdAbAa), I: carbazole, II: 2’-aminobiphenyl-2,3-diol, III: 2hydroxy-6-oxo-6-(2’-aminobiphenyl)-hexa-2,4-dienoic acid, IV: 2-hydroxypenta2,4-dienoate, V: anthranilic acid, VI: catechol [30] c) Catechol 1,2-dioxygenase Chủng vi khuẩn Sphingomonas sp RW1 có khả phân giải monochlorinated DF dichlorinated DF thành salicylate catechol [31] Chủng Fusarium sp BI có khả giảm salicylate chủ yếu thông qua chất trung gian catechol, sau chất phân cắt vòng catechol 1,2-dioxygenase (Hình 1.7) [32] Enyme tìm thấy trình phân phải DD DF chủng Sphingomonas sp RW1 [21] Schlüter cộng (2012) báo cáo chủng nấm men Trichosporon mucoides phân giải phenol có khả phân giải DF, diphenyl ether biphenyl cách phân cắt vòng Enzyme catechol 1,2-dioxygenase chủng nấm men khơng có khả phân cắt vòng thơm 3,4-dihydroxybiphenyl, xúc tác phân cắt ortho hợp chất dihydroxylated monoaromatic [33] 15 Hình 1.7 Chuyển hóa catechol enzyme catechol 1,2-dioxygenase [32] d) Hydroxyquinol 1,2-dioxygenase Enzyme xúc tác phân cắt ortho hydroxyquinol tạo maleylacetate [34] Chủng Sphingomonas sp RW1 có khả sử dụng DF DD dẫn xuất chúng có nhóm hydroxyl nguồn lượng carbon Chủng có khả phân giải 3-hydroxydibenzofuran 2-hydroxydibenzo-pdioxin thành hydroxyquinol sau chất chuyển hóa thành maleylacetate enzyme hydroxyquinol 1,2-dioxygenase [35] 1.3.2 Các vi sinh vật tái tổ hợp phân hủy dibenzofuran Sự phân giải hiếu khí dioxin dẫn xuất dioxin hệ thống dioxygenase vi khuẩn ý nhiều lĩnh vực nghiên cứu Tuy nhiên, hệ thống dioxygenase vi khuẩn cơng vào dẫn xuất dioxin furan chứa một, hai ba nguyên tử chlorine phân tử Rất khó để phân giải hoàn toàn 2,3,7,8-TCDD dẫn xuất dioxin độc khác mà sử dụng hệ thống dioxygenase tự nhiên Các hệ thống enzyme phân giải lignin nấm mục trắng cơng dẫn xuất dioxin hiệu quả, điều kiện phát triển 16 nấm mục trắng tương đối hạn chế khó cạnh tranh với vi khuẩn địa có đất nên khó áp dụng xử lý sinh học chỗ [18] Sự phân giải biphenyl vi khuẩn nghiên cứu để khắc phục đất bị nhiễm PCB Biphenyl dioxygenase enzyme xúc tác đầu tiền đường phân giải biphenyl [36] L'Abbée J.B cs (2005) nghiên cứu chuyển hóa DF biphenyl dioxygenase chủng Comamonas testosteroni B-356 so sánh với chủng Burkholderia xenovorans LB400 Kết cho thấy enzyme chủng oxy hóa DF với tỷ lệ thấp, tế bào E coli biểu LB400 BPDO phân giải với tốc độ cao (30 nmol 18 giờ) so với tế bào biểu B356 BPDO (2 nmol 18 giờ) Hơn nữa, enzyme tạo dihydro-dihydroxydibenzofuran chất chuyển hóa chủ yếu, kết oxy hóa bên DF 2,2',3trihydroxybiphenyl (kết từ oxy hóa góc DF) chất chuyển hóa nhỏ tạo enzyme này[36] Các tế bào E coli DH5α chứa plasmid pUC19 mang gen mã hóa enzyme anthranilate 1,2-dioxygenase chủng Sphingomonas sp XLDN2-5 cảm ứng với IPTG dễ dàng chuyển hóa anthranilate thành catechol chuyển hóa hồn tồn 1mM anthranilate thành catechol vòng 24 [30] Hoạt tính anthranilate 1,2dioxygenase chủng Acinetobacter sp ADP1 E coli phát thông qua thay đổi màu sắc bổ sung anthranilate ferrous iron vào môi trường nuôi cấy [29] Năm 1999, Armengaud cộng nghiên cứu biểu hydroxyquinol 1,2-dioxygenase Plasmid pET9a mang gen mã hóa enzyme chủng Sphingomonas sp RW1 chuyển vào tế bào E coli BL21 Dịch chiết thu từ tế bào cho thấy hoạt tính phân cắt vòng cao hydroquinol (600 nmol/phút/mg) [35] 17 1.4 Tổng quan Công nghệ DNA tái tổ hợp Cơng nghệ DNA tái tổ hợp (còn gọi kỹ thuật di truyền hay kỹ thuật gen) phận quan trọng công nghệ then chốt lĩnh vực công nghệ sinh học Công nghệ DNA tái tổ hợp đời sở thành tựu sinh học phân tử đóng vai trò cách mạng phát triển sinh học cải tạo sinh giới [11] Các kỹ thuật tái tổ hợp DNA cho phép nhà công nghệ sinh học phân lập khuếch đại gen đơn từ genome sinh vật để nghiên cứu, biến đổi chuyển vào thể sinh vật khác Các kỹ thuật gọi tạo dòng gen sản xuất số lượng lớn gen xác định [11] Năm 1970, công nghệ DNA tái tổ hợp đời nhờ phát triển phương pháp kỹ thuật dùng nghiên cứu trình sinh học mức độ phân tử Từ cho phép phân lập, phân tích thao tác gen theo nhiều phương thức khác nhau, giúp hiểu biết sâu sắc lĩnh vực sinh học công nghệ sinh học, bào chế loại thuốc mới, y học phân tử liệu pháp gen [12] Sự khám phá enzyme hạn chế năm đầu 1970 phát triển then chốt khơng cho khả phân tích DNA hiệu hơn, mà cung cấp khả cắt phân tử DNA để tạo đoạn DNA tái tổ hợp mới, trình mà ngày gọi tạo dòng gen (gene cloning) Phương thức tạo dòng báo hiệu kỷ nguyên thao tác, phân tích khai thác phân tử nucleic acid [11] Năm 1972, nhóm nghiên cứu Đại học Stanford (Paul Berg) đưa phương pháp đuôi để nối phân tử DNA khác Để tạo đầu dính, người ta sử dụng terminaltransferase Dưới tác dụng enzyme này, người ta tạo đuôi polynucleotide khoảng 50 đến 100 gốc adenine (polyA) đầu 3’-OH mạch đơn DNA virus SV 40 (Simian virus 40) đuôi poly T DNA plasmid mở enzyme Sau trộn lẫn hai loại DNA này, đuôi bổ sung adenine thymine bắt cặp lại với với có mặt DNA ligase, hai DNA nối lại tạo plasmid tái tổ hợp vòng Vì an tồn cho cộng đồng nên sản phẩm 18 tái tổ hợp không biến nạp tế bào chủ Tuy chưa hoàn tất, thực nghiệm Berg cho ta hai vấn đề mấu chốt DNA tái tổ hợp dùng enzyme để cắt DNA cách định trước đoạn DNA loài khác nối lại với [39] Năm 1973, Cohen Chang tạo phân tử DNA tái tổ hợp từ lồi khác nhau, có nhiều ưu điểm biến nạp tế bào chủ Và từ đây, công nghệ DNA tái tổ hợp đời Sau đó, nhiều nhà khoa học bắt đầu tiến hành thí nghiệm lắp ghép gen nhanh chóng thu kết có ứng dụng thực tiễn [40] Năm 1980, chủ tịch Novo Nordisk’s Bioindustrial Group (BIG) (Bagsvaerd, Denmark) công bố vòng năm hầu hết enzyme cơng nghiệp sản xuất việc sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp Bốn năm sau, 50% enzyme công nghiệp thị trường cung cấp trình tái tổ hợp, doanh thu đạt 140 triệu USD [41] Phytase thực vật sản xuất Aspergillus niger tái tổ hợp sử dụng loại thức ăn cho khoảng 50% tổng số lợn Hà Lan Nhờ công nghệ DNA tái tổ hợp mà việc sản xuất phytase A niger tăng 1000 lần so với phương pháp sản xuất truyền thống [42] Chính phát triển nhanh chóng lĩnh vực DNA tái tổ hợp giúp hiểu biết nhiều cấu trúc hoạt động gen, gen prokaryote eukaryote trở thành kỹ thuật sản xuất trực tiếp tạo hàng loạt chế phẩm y-sinh học hữu ích từ tế bào vi khuẩn, nấm men tạo giống sinh vật góp phần giải vấn đề thực tiễn đặt y học công tác chọn tạo giống [11] 19 1.5 Tổng quan nghiên cứu enzyme hydroxyquinol 1,2-dioxygenase 1.5.1 Cấu tạo Hydroxyquinol 1,2-dioxygenase heterotetramer α2β2 112,4 kDa bao gồm tiểu đơn vị α 17,8 kDa tiểu đơn vị β 38,3 kDa [43] 1.5.2 Tình hình nghiên cứu hydroxyquinol 1,2-dioxygenase giới Nhiều nghiên cứu giới chứng minh hydroxyquinol 1,2-dioxygenase tham gia q trình phân hủy, xúc tác hay chuyển hóa hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân, dibenzofuran, congener khác polychorinated dibenzo-p-dioxin polychlorinated dibenzofuran Moonen cs (2008), nghiên cứu trình tinh đặc tính hydroquinone dioxygenase từ Pseudomonas flreorescens ACB Kết nghiên cứu cho thấy enzyme heterotetrameric, mã hóa gen hapC hapD thành viên họ enzyme dioxygenase nonheme-iron (II) Ngoài ra, hydroxyquinol 1,2dioxygenase enzyme liên quan đến chuyển hóa 4-hydroxyacetophenone Pseudomonas flreorescens ACB, xúc tác phân tách vòng hydroquinone thành semialdehyde-4-hydroxymucon Hydroxyquinol 1,2-dioxygenase kích hoạt ion sắt II xúc tác phân hạch vòng loạt hydroquinones [43] Daubaras cs (1996), nghiên cứu trình tinh hydroxyquinol 1,2-dioxygenase maleylacetate reductase từ Burkholderia cepacia AC1100 Kết nghiên cứu cho thấy, enzyme hydroxyquinol 1,2-dioxygenase xúc tác phân cắt ortho hydroxyquinol (1,2,4-trihydroxylbenzene) thành maleylacetat, tinh chế từ tế bào E coli chứa gen tftH từ Burkholderia cepacia AC1100 Sau đó, enzyme menylacetate reductase tham gia vào trình xúc tác, giảm liên kết bền maleylacetat cũng, tinh chế từ tế bào E coli chứa gen tftE từ B cepacia AC1100 Hai enzyme xúc tác q trình chuyển hóa hydroquinol thành 3oxoadipat Trong nghiên cứu, xác định rõ khối lượng phân tử tự nhiên hydroxyquinol 1,2-dioxygenase 68 kDa kích thước tiểu đơn vị protein 36 20 kDa; đồng thời, sử dụng hydroxyquinol 5-chlorohydroxyquinol làm chất [34] Ferraroni cs (2005), nghiên cứu cấu trúc tinh thể hydroxyquinol 1,2-dioxygenase (1,2-HQD) từ Nocardioides simplex 3E Trong nghiên cứu cho thấy, hydroxyquinol 1,2-dioxygenase xúc tác phân tách vòng hydroxyquinol (1,2,4trihydroxybenzene), trung gian trung gian trình phân hủy hợp chất thơm, bao gồm nhiều chất gây ô nhiễm polychloro nitroaromatic Kết nghiên cứu xác định trình tự sơ cấp phân tích cấu trúc tinh thể 1,2-HQD từ Nocardioides simplex 3E giải độ phân giải 1,75 A cách sử dụng phân tán dị thường sóng điện cực với hai cực xúc tác (1 Fe / 293 amino axit) Các polyhedron phối hợp xúc tác Fe (III) gồm chuỗi bên Tyr 164 , Tyr 197 , His221 , His 223 giống với dioxygenase chiết xuất intradiol khác, số đặc điểm cấu trúc bậc ba khác Một phân tử kết hợp benzoat tìm thấy gắn kết với trung tâm kim loại tạo thành mạng lưới liên kết hydro đặc biệt quan sát trước có 4-chlorocatechol 1,2-dioxygenase từ Rhodococcus opacus 1CP Đây cấu trúc chất ức chế intradiol dioxygenase chuyên cắt vòng hydroxyquinol [44] Latus cs (1995), nghiên cứu q trình tinh đặc tính hydroquinone dioxygenase từ Azotobacter sp GP1 Kết nghiên cứu cho thâý hydroxyquinol 1,2-dioxygenase tinh chế từ tế bào vi khuẩn đất Azotobacter sp chủng GP1 có khả sử dụng 2,4,6-trichlorophenol nguồn carbon Chức enzyme dioxygenase đường phân giải 2,4,6-trichlorophenol, 6-chlorohydroxyquinol (6-chloro-1,2,4- trihydroxybenzene) hydroxyquinol (1,2,4-trihydroxybenzene) thực việc phân tách ortho hợp chất hydroxyquinol, mang lại chloromaleyl acetat maleylacetat tương ứng Đồng thời, xác định trọng lượng phân tử 1,2dioxygenase hydroxyquinol địa ước tính 58.000, với hệ số lắng 4.32; trọng lượng phân tử đơn vị 34.250 cho biết cấu trúc dimeric enzym dioxygenase Ngoài ra, việc bổ sung ion Fe (II) kích hoạt hoạt tính enzym đáng kể, chất chelat kim loại ức chế [45] 21 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu - Chủng vi khuẩn E coli TOP10 hãng Introvigen, Mỹ - Chủng vi khuẩn E coli M15 hãng Qiagen, Đức - Chủng vi khuẩn E coli TOP10 mang vector tái tổ hợp pGEM®-T Easy/HQL1 pGEM®-T Easy/HQL2 [13] - Vector biểu pQE30 hãng Qiagen, Đức Hình 2.1 Vector biểu pQE30 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phân lập gen HQL1 HQL2 từ vi khuẩn E coli TOP10 mang vector tái tổ hợp pGEM®-T Easy/HQL1 pGEM®-T Easy/HQL2 a) Tách chiết vector tái tổ hợp pGEM®-T Easy/HQL1 pGEM®-T Easy/HQL2 Chủng vi khuẩn E coli TOP10 mang vector tái tổ hợp pGEM®-T Easy/HQL1 pGEM®-T Easy/HQL2 ni mơi trường LB lỏng có bổ sung 50 μg/mL 22 ampicillin nhiệt độ 37oC 12 giờ, tốc độ lắc 220 vòng/phút Sinh khối vi khuẩn sử dụng để tách chiết DNA vector theo phương pháp Moon-Sik Yang [47] Sinh khối vi khuẩn tái huyền phù kết tủa 0,1 mL solution I (50 mM glucose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl pH 8.0) để nhiệt độ phòng 10 phút Thêm 0,2 mL solution II (0,2 N NaOH, 1% SDS), đảo trộn đặt đá bào phút Thêm 0,15 mL solution III (60 mL CH3COOK M; 11,5 mL CH3COOH; 28,5 mL H2O), đảo trộn đặt đá bào 10 phút Ly tâm 12000 vòng/phút 10 phút Chuyển thể vào tube Epp Thêm PCI (Phenol : Chloroform : Isoamyl Alcohol = 25:24:1 ) với lượng lượng thể Vortex 30 giây Ly tâm 12000 vòng/phút phút Chuyển thể vừa ly tâm sang tube Epp Thêm lượng chloroform vào với thể tích thể Vortex 30 giây Ly tâm 12000 vòng/phút phút Chuyển thể vừa ly tâm sang tube Epp Thêm lượng ethanol 100% gấp đơi thể tích thể nổi, đảo trộn, giữ nhiệt độ -80oC 15 phút Sau đó, ly tâm 12000 vòng/phút 15 phút 4oC thu kết tủa Thêm 500 μL ethanol 70%, đảo trộn ly tâm 12000 vòng/phút phút, thu kết tủa Để tube Epp khô nhiệt độ phòng Hòa tan kết tủa cách cho thêm 20 μL nước cất [47] DNA vector điện di gel agarose 1%, điện áp 100 V nhuộm với RedSafeTM Nucleic Acid Staining Solution 20000x theo nồng độ khuyến cáo nhà sản xuất (iNtRON Biotechnology, Hàn Quốc) Hình ảnh điện di quan sát ánh sáng tử ngoại (UV transilluminator, Wealtec) b) Phân lập gen HQL1 HQL2 phản ứng cắt hạn chế bới BamHI HindIII Cắt gen HQL1 HQL2 từ vector tái tổ hợp pGEM®-T Easy/HQL1 pGEM®T Easy/HQL2 loại enzyme cắt hạn chế BamHI HindIII (Thermo scientific) với thành phần phản ứng bao gồm: μL 10 × tango buffer, μL 10 U/μL BamHI, μL 10U/μL HindIII, 14 μL DNA vector (2 μg), thêm nước cất vô trùng đến thể tích cuối 20 μL Hỗn hợp phản ứng cắt trộn ủ 370C qua đêm Q trình mở vòng DNA vector pQE30 tiến hành tương tự enzyme 23 cắt hạn chế BamHI HindIII Vector tái tổ hợp vector pQE30 sau cắt kiểm tra điện di gel agarose 1% c) Tinh thu hồi gen HQL1, HQL2, vector pQE30 Sản phẩm cắt hạn chế tinh cột spin GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific) theo hướng dẫn nhà sản xuất Sản phẩm tinh kiểm tra điện di gel agarose 1% 2.1.2 Tạo dòng gen HQL1 HQL2 vector biểu pQE30 a) Gắn gen HQL1 HQL2 vào vector pQE30 Gen HQL1, HQL2 vector pQE30 sau tinh thực phản ứng gắn T4 ligase (Promega) với thành phần phn ng bao gm: àL 10ì T4 DNA ligase buffer, µL 1U/L T4 DNA ligase, 50 ng vector pQE30, 25 ng gen HQL1 phản ứng gắn gen HQL2 45 ng, thêm nước cất vô trùng đến thể tích cuối 20 µL Hỗn hợp trộn ủ 220C Vector tái tổ hợp pQE30/HQL1 pQE30/HQL2 biến nạp vào tế bào E coli TOP10 khả biến phương pháp sốc nhiệt 42oC 55 giây Dịch biến nạp nuôi đĩa Petri chứa môi trường LB 50 μg/mL ampicillin ủ qua đêm 37oC * Phương pháp tạo tế bào khả biến E coli TOP10 E coli M15 Chủng vi khuẩn E coli TOP10 lấy từ ống stock cấy ria môi trường LB rắn nuôi qua đêm 370C; ngày hôm sau lấy khuẩn lạc, nuôi cấy lỏng lắc ống nghệm chứa môi trường LB lỏng, nuôi qua đêm điều kiện lắc 220 vòng/phút 370C (lưu ý: chủng E coli TOP10 tiến hành nuôi 12 giờ; chủng E coli M15 tiến hành nuôi qua đêm 16 môi trường nuôi cấy có bổ sung kháng sinh kanamycin 50 µg/mL) Cấy chuyển mL dịch nuôi cấy sang 100 mL môi trường LB lỏng Tiếp tục nuôi cấy giá trị OD600 = 0.5 (lắc 220 vòng/phút; 1.5-3 giờ) nhiệt độ 370C Chia dịch nuôi cấy sang ống fancol 50 mL, ly tâm 4000 vòng/phút phút Loại bỏ dịch nổi, bổ sung 12.5 mL dung dịch CaCl2 0.1 M; làm tan hết tủa tế bào dung dịch CaCl2; ủ đá 15 24 phút Ly tâm 4000 vòng/phút phút; loại bỏ dịch nổi; bổ sung 2mL 0.1 M CaCl2 and 300 µl glycerol hấp khử trùng; ủ đá Chia 200 µL EP làm lạnh sẵn; làm lạnh nhanh nitơ lỏng; sau bảo quản tủ -800C [47] Chủng vi khuẩn E coli TOP10 mang vector tái tổ hợp pQE30/HQL1 pQE30/HQL2 kiểm tra phương pháp PCR khuẩn lạc Hỗn hợp phản ứng khuếch đại bao gồm 10 pmol/µL mi xuụi, 10 pmol/àL mi ngc, àL 2ì PCR Master Mix (Fermentas), khuẩn lạc vi khuẩn E coli TOP10 mang vector tái tổ hợp pQE30/HQL1 pQE30/HQL2 với tổng thể tích phản ứng µL Khuếch đại PCR thực máy luân nhiệt MINI 25 PCR (PHUSA Biochem, Việt Nam) theo chu trình: biến tính 95oC/2 phút; 30 chu kỳ: 95oC/30 giây, 60 oC /1 phút, 72oC/1,5 phút; cuối 72oC/10 phút Sản phẩm PCR điện di nhuộm với RedsafeTM Nucleic Acid Staining Solution 20000x theo nồng độ khuyến cáo nhà sản xuất (iNtRON Biotechnology, Hàn Quốc), quan sát tia tử ngoại (UV transilluminator, Wealtec) Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi Tên gene HQL1 HQL2 Tên primer HQL1E-F HQL12E-R HQL2E-F HQL2E-R Trình tự primer 5’ – 3’ GGATCCATGACCGACACGGCAT AAGCTTGTGCAGGCAGATTTCG GGATCCATGGCCACCCTCGACA AAGCTTGAACGCGATCGGATAC Kích thước 495 bp 1020 bp b) Tách chiết vector tái tổ hợp pQE30/HQL1 pQE30/HQL2 Chủng vi khuẩn E coli TOP10 mang vector tái tổ hợp pQE30/HQL1 pQE30/HQL2 ni mơi trường LB lỏng có bổ sung 50 μg/mL ampicillin nhiệt độ 37oC 16 giờ, tốc độ lắc 220 vòng/phút Sinh khối vi khuẩn sử dụng để tách chiết DNA vector theo phương pháp Moon-Sik Yang [47] Chuẩn bị nguyên liệu để biến nạp vào vi khuẩn E coli M15 DNA vector pQE30/HQL1 pQE30/HQL2 điện di gel agarose 1%, điện áp 100 V nhuộm với RedSafeTM Nucleic Acid Staining Solution 20000x theo 25 nồng độ khuyến cáo nhà sản xuất (iNtRON Biotechnology, Hàn Quốc) Hình ảnh điện di quan sát ánh sáng tử ngoại (UV transilluminator, Wealtec) 2.1.3 Biểu gen HQL1 HQL2 E coli M15 a) Biến nạp vector pQE30/HQL1 pQE30/HQL2 vào E coli M15 Vector tái tổ hợp pQE30/HQL1 pQE30/HQL2 biến nạp vào tế bào E coli M15 khả biến phương pháp sốc nhiệt 42oC 85 giây Dịch biến nạp nuôi đĩa Petri chứa mơi trường LB có bổ sung kanamycin 50 µg/mL ampicillin 50 µg/mL, ủ qua đêm 37oC Chủng vi khuẩn E coli M15 mang vector tái tổ hợp pQE30/HQL1 pQE30/HQL2 kiểm tra phương pháp PCR khuẩn lạc Sản phẩm PCR điện di nhuộm với RedsafeTM Nucleic Acid Staining Solution 20000x theo nồng độ khuyến cáo nhà sản xuất (iNtRON Biotechnology, Hàn Quốc), quan sát tia tử ngoại (UV transilluminator, Wealtec) b) Biểu gen HQL1 HQL2 vi khuẩn E coli M15 Chủng vi khuẩn E coli M15 nuôi cấy nhân sinh khối cách cấy chuyển khuẩn lạc vào ml mơi trường LB lỏng có bổ sung 50 μg/mL ampicillin 50 μg/mL kanamycin, nuôi 370C 16 giờ, tốc độ lắc 220 vòng/phút Chuyển 50 μL sang ống nghiệm chưa môi trường LB lỏng có bổ sung 50 μg/mL ampicillin 50 μg/mL kanamycin Ni 370C/ 220 vòng/phút 3.5 , lấy 500 μL dịch ni pha lỗng lần với mơi trường LB, đo OD bước sóng 595 nm , lặp lại giá trị OD nằm khoảng (0.5 – 0.8) Lấy 500 μL dịch nuôi đem bảo quản -200C, ghi xác giá trị OD1 nắp Lượng dịch ni lại, bổ sung chất cảm ứng 0.5 mM IPTG, ni 370C/ 220 vòng/phút 4h Tiếp tục, lấy 500 μL dịch ni pha lỗng lần với môt trường LB lỏng, đo OD bước sóng 595 nm Lấy 500 μL dịch cảm ứng đem bảo quản -200C, ghi rõ xác giá trị OD2 nắp Epp Lấy 500 μL (V1) dịch nuôi cấy khơng cảm ứng V2 μL (OD1×V1 = OD2×V2), đem ly tâm thu sinh khối, bổ sung 10 μL DW, tái huyền phù, bổ sung 26 μL 4× protein sample buffer Vortex phá tế bào, biến tính protein 10 phút 950C Dùng 10 μL mẫu để điện di SDS-PAGE với thang chuẩn protein (mẫu điện di bao gồm: đối chứng âm dịch phá màng E coli M15 không cảm ứng IPTG dịch phá màng E coli M15 không chứa vector tái tổ hợp cảm ứng IPTG * Điện di protein gel polyacryamide Nguyên tắc: Các tiểu phần protein xác định dựa vào tốc độ di chuyển khác tiểu phần protein điện trường Ở số điều kiện định, protein dạng ion có mưc độ ion hóa khác nhau, nên tách riêng biệt chúng theo khản di động trường điện từ cực âm sang cực dương Kết nhận băng protein khác Phương pháp điện di protein thường tiến hành chất mang dạng gel lưới polymer Lưới polymer làm chậm tốc độ di chuyển phân tử protein theo khối lượng, kích thước, độ mang điện chúng Phương pháp điện di protein gel polyacrylamide có chứa SDS tiến hành theo phương pháp Laemmli [48] Quy trình điện di sau: Pha mẫu với Protein Sample buffer 4× biến tính mẫu 950C 10 phút Dùng 10 µL mẫu tra vào giếng tiến hành điện di gel polyacrylamide 12% gồm gel cô 4% gel tách 12% Đổ đệm chạy (running buffer) SDS-Page 1× chạy điện di, q trình chạy điện di gồm có giai đoạn: giai đoạn - 50V 20 phút; giai đoạn – 80V 40 phút Theo dõi đến thấy màu dung dich đệm mẫu gần dung dịch đệm chạy kết thúc Bản gel nhuộm dung dịch nhuộm Coomassie Brilliant Blue R250 Dye (hãng Thermo Scientific) khoảng 30 phút Tẩy gel cách ngâm gel nhuộm vào dung dịch rửa (washing buffer) đến gel màu trắng kết thúc trình rửa (ngâm gel dung dịch rửa qua đêm, lắc 70 vòng/phút) Sau gel bảo quản chụp ảnh 27 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập gen HQL1 HQL2 từ vi khuẩn E coli TOP10 mang vector tái tổ hợp pGEM®-T Easy/HQL1 pGEM®-T Easy/HQL2 Vector tái tổ hợp pGEM®-T Easy/HQL1 pGEM®-T Easy/HQL2 tách chiết từ chủng vi khuẩn E coli TOP10 Kết điện di kiểm tra DNA gel agarose 1% trình bày hình 3.1 Hình 3.1 Vector pGEM®-T Easy/HQL1 pGEM®-T Easy/HQL2 M: thang chuẩn DNA 10 kb (hãng Thermo Scientific); 2: pGEM®-T Easy/HQL1, 4: pGEM®-T Easy/HQL2 Cắt gen HQL1 HQL2 từ vector tái tổ hợp pGEM ... Nghiên cứu biểu gen HQL1 HQL2 mã hóa hydroxyquinol 1,2-dioxygenase vi khuẩn Escherichia coli M15 Mục tiêu nghiên cứu Sử dụng kỷ thuật sinh học phân tử công nghệ DNA tái tổ hợp để biểu gen HQL1. .. trình tạo dòng biểu biểu gen HQL1 HQL2 mã hóa hydroxyquinol 1,2-dioxygenase tế bào E coli M15 Ý nghĩa thực tiễn: Biểu thành công gen HQL1 HQL2, tạo sở để sản xuất hydroxyquinol 1,2-dioxygenase tái... PHẠM KHOA SINH MÔI TRƯỜNG NGUYỄN NGỌC QUỲNH NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN HQL1 VÀ HQL2 MÃ HÓA HYDROXYQUINOL 1,2DIOXYGENASE TRONG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI M15 Ngành: Công nghệ Sinh học Người hướng dẫn: