BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐÀO THỊ CẨM MINH XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÂN DƯỢC TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐÀO THỊ CẨM MINH XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÂN DƯỢC TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH : KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ : 62720410 Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà HÀ NỘI, NĂM 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác Đào Thị Cẩm Minh LỜI CẢM ƠN Đề hồn thành Luận án này, tơi nhận giúp đỡ tận tình hiệu nhiều cá nhân tập thể, thầy cô giáo, đồng nghiệp, bạn bè gia đình Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh, Phó Viện trưởng Viện Cơng nghệ Dược phẩm Quốc gia, Trường Đại học Dược Hà Nội PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà, Phó Trưởng Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất, hai giáo tận tình hướng dẫn, định hướng, giúp đỡ, cho tơi kiến thức quý báu động viên tâm hoàn thành luận án GS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu, nguyên Hiệu phó, trưởng chuyên ngành Kiểm nghiệm thuốc Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội người thầy động viên, dẫn đóng góp ý kiến q báu cho tơi hồn thành luận án PGS.TS Nguyễn Xuân Trường, Giám đốc Trung tâm giám định ma túy, Viện khoa học hình sự, Bộ Cơng an PGS.TS Lê Văn Vũ, Giám đốc Trung tâm Khoa học vật liệu, Khoa Vật lý, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, hai người thầy dẫn đóng góp kinh nghiệm q báu cho tơi hồn thành luận án Ban giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội Ban giám hiệu Trường Đại học Y Dược Huế tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận án thời gian quy định Các thầy, Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất Phịng Sau đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ q trình học tập trường Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Gia đình người thân chia sẻ, động viên tơi có đủ nghị lực, tâm hồn thành luận án Tác giả luận án Đào Thị Cẩm Minh MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan tân dược trộn trái phép chế phẩm đông dược 1.1.1 Khái niệm, phân loại chế phẩm đơng dược 1.1.2 Tình hình tân dược trộn trái phép đơng dược giới 1.1.3 Tình hình tân dược trộn trái phép đơng dược Việt Nam 1.2 Tổng quan đối tượng nghiên cứu 12 1.2.1 Nhóm giảm đau, chống viêm steroid phi steroid 12 1.2.2 Nhóm giảm glucose máu 16 1.2.3 Nhóm ức chế PDE-5 18 1.3 Tổng quan phương pháp nghiên cứu 1.3.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 19 19 1.3.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp với quang phổ Raman tăng cường bề mặt (TLC-SERS) 24 1.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) 32 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 Nguyên liệu, trang thiết bị 39 2.1.1 Nguyên liệu 39 2.1.2 Trang thiết bị 40 2.2 Đối tượng nghiên cứu 41 2.2.1 Mẫu thử 41 2.2.2 Mẫu placebo 41 2.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 43 2.3.1 Xây dựng quy trình định tính, định lượng số tân dược trộn trái phép chế phẩm đông dược LC-MS/MS 43 2.3.2 Xây dựng quy trình định tính số tân dược trộn trái phép chế phẩm đông dược HPTLC 46 2.3.3 Phát triển quy trình định tính sildenafil trộn trái phép chế phẩm đông dược phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp với tán xạ Raman tăng cường bề mặt (TLC – SERS) 48 2.3.4 Ứng dụng phương pháp phân tích 50 2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 51 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 52 3.1 Xây dựng quy trình định tính, định lượng phương pháp LCMS/MS 52 3.1.1 Xây dựng quy trình định tính, định lượng số thuốc nhóm giảm đau, chống viêm trộn trái phép chế phẩm đơng dược 52 3.1.2 Xây dựng quy trình định tính, định lượng số thuốc nhóm giảm glucose máu trộn trái phép chế phẩm đông dược 68 3.1.3 Xây dựng quy trình định tính, định lượng số thuốc nhóm ức chế PDE-5 trộn trái phép chế phẩm đơng dược 78 3.2 Xây dựng quy trình định tính phương pháp HPTLC 87 3.2.1 Xây dựng quy trình định tính nhóm glucorticoid phương pháp HPTLC 87 3.2.2 Xây dựng quy trình định tính nhóm NSAID phương pháp HPTLC 92 3.2.3 Xây dựng quy trình định tính nhóm giảm glucose máu phương pháp HPTLC 97 3.2.4 Xây dựng quy trình định tính nhóm ức chế PDE-5 phương pháp HPTLC 102 3.3 Phát triển quy trình định tính phương pháp TLC-SERS 106 3.3.1 Xây dựng quy trình định tính phương pháp TLC-SERS 106 3.3.2 Thẩm định phương pháp định tính sildenafil TLC-SERS 109 3.4 Đánh giá khả ứng dụng phương pháp HPTLC, LC-MS/MS TLC-SERS 110 3.4.1 Ứng dụng phương pháp HPTLC mẫu thực 111 3.4.2 Ứng dụng phương pháp LC-MS/MS xác định dược chất trộn lẫn chế phẩm đông dược 117 3.4.3 Ứng dụng phương pháp TLC-SERS mẫu thực CHƯƠNG BÀN LUẬN 120 122 4.1 Xây dựng mẫu chế phẩm đông dược 122 4.2 Phương pháp LC-MS/MS 124 4.2.1 Xây dựng quy trình chiết xuất thuốc tân dược chế phẩm đông dược 124 4.2.2 Xây dựng phương pháp phân tích LC-MS/MS 126 4.2.3 Thẩm định phương pháp LC-MS/MS 128 4.3 Phương pháp HPTLC 130 4.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích HPTLC 130 4.3.2 Thẩm định phương pháp HPTLC 133 Phương pháp TLC-SERS 135 4.4 4.4.1 Lựa chọn phương pháp 135 4.4.2 Xây dựng quy trình định tính sildenafil TLC – SERS 136 4.4.3 Thẩm định phương pháp TLC-SERS 139 Đánh giá khả ứng dụng phương pháp 139 4.5.1 Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích mẫu thực 139 4.5.2 Ứng dụng phương pháp LC-MS/MS phân tích mẫu thực 141 4.5.3 Ứng dụng phương pháp TLC – SERS để phân tích mẫu thực 143 4.5 4.5.4 Bước đầu đánh giá tình hình dược chất trộn lẫn mẫu thực 144 4.6 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn luận án KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 145 147 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril AOAC Hiệp hội nhà hóa phân tích thống (Association of Official Analytical Chemists) AR Thuốc thử phân tích BETA Betamethason CRE Hiệu ứng giọt cà phê (Coffe ring effect) CE Điện di mao quản (Capillary electrophoresis) COX Cyclooxygenase DEXA Dexamethason acetat ESI Ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionization) GLIB GLIC Glibenclamid Gliclazid GLM Glimepirid GLIP Glipizid Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) HPTLC Sắc ký lớp mỏng hiệu cao (High Performance Thin Layer Chromatography) HPLC- DAD Sắc ký lỏng hiệu cao – Detector diod (High Performance Liquid Chromatography-Diode-Array Detection) HYDRO Hydrocortison acetat HPLC KETO ICH LOD Ketoprofen Hội đồng hòa hợp quốc tế (International Conference on Harmonisation) Indomethacin Hồng ngoại (Irradation) Sắc ký lỏng kết hợp khối phổ (Liquid chromatography - mass spectrometry) Sắc ký lỏng khối phổ hai lần (Liquid chromatography tandem mass spectrometry) Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ m/z MeOH Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) Khối lượng/điện tích Methanol INDO IR LC-MS LC-MS/MS MRM MS Chế độ khảo sát đa phản ứng (Multiple Reaction Monitoring) Khối phổ (Mass Spectrometry) NMR NSAID TAD Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) Thuốc chống viêm không steroid (Non-Steroidal AntiInflammatory Drug) Tinh khiết phân tích (Pure Analysis) Paracetamol Phosphodiesterae – Piroxicam Prednisolon Prednison Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) Tán xạ Raman tăng cường bề mặt (Surface- enhanced Raman spectroscopy) Tín hiệu/nhiễu (Signal/noise) Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) Sildenafil citrat Chế độ khảo sát ion lựa chọn (Selected Ion Monitoring) Chế độ khảo sát phản ứng lựa chọn (Selected Reaction Monitoring) Nhóm cơng tác khoa học cho phân tích thuốc bị thu giữ (Scientific Working Group for the Analysis of Seized Drugs) Tadalafil TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron microscopy) TFA Trifluoroacetic Acid TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography) TLC-SERS TOF Sắc ký lớp mỏng kết hợp tán xạ Raman tăng cường bề mặt (Thin Layer Chromatography – Surface Enhanced Raman Spectroscopy) Thời gian bay (Time Of Flight) TPBVSK Thực phẩm bảo vệ sức khỏe TPCN Thực phẩm chức UV-Vis Tử ngoại – Khả kiến (Ultra Violet - Visible) VAR Vardenafil hydrochlorid VNKNTTW Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương PA PARA PDE – PIRO PREL PREN RSD SERS S/N SD SIL SIM SRM SWGDRUG DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Bảng 1.1 Cấu trúc hố học, tính chất vật lý liều dùng thuốc giảm đau, chống viêm phi steroid nghiên cứu 14 Bảng 1.2.Cấu trúc, tính chất vật lý liều dùng thuốc glucocorticoid 15 Bảng 1.3 Cấu trúc, tính chất vật lý liều dùng thuốc nghiên cứu 17 Bảng 1.4 Cấu trúc, tính chất vật lý liều dùng thuốc ức chế PDE-5 19 Bảng 1.5 So sánh vài thông số HPTLC TLC 20 Bảng 1.6 Các nghiên cứu phát tân dược trộn lẫn chế phẩm đông dược phương pháp TLC 23 Bảng 1.7.Phân loại kỹ thuật phân tích SWGDRUG 28 Bảng 1.8 Các nghiên cứu phát tân dược trộn lẫn chế phẩm đông dược phương pháp TLC-SERS 31 Bảng 1.9 Các nghiên cứu phát tân dược trộn lẫn chế phẩm đông dược phương pháp LC-MS 35 Bảng 2.1 Các chất chuẩn dùng nghiên cứu 39 Bảng 3.1 Các thông số máy khối phổ 52 Bảng 3.2 Điều kiện khối phổ nhóm giảm đau, chống viêm 53 Bảng 3.3 Điều kiện khảo sát pha động theo chế độ gradient nhóm giảm đau, chống viêm 55 Bảng 3.4 Kết khảo sát dung môi chiết 58 Bảng 3.5 Kết khảo sát thời gian siêu âm nhóm giảm đau, chống viêm 59 Bảng 3.6 Kết đánh giá độ phù hợp nhóm giảm đau chống viêm hệ thống LC-MS/MS 60 Bảng 3.7 Sự phụ thuộc tuyến tính nồng độ diện tích pic chất nghiên cứu 64 Bảng 3.8 Kết LOD LOQ mẫu nhóm giảm đau, chống viêm 65 Bảng 3.9 Kết đánh giá độ độ xác nhóm giảm đau, chống viêm NX1 66 BÁO CÁO THẨM ĐỊNH TIÊU CHUẨN KỸ THUẬT STT Nguyên vật liệu Tiêu chuẩn Nguồn gốc Chất chuẩn Sildenafil citrat Tadalafil hydroclorid Vardenafil hydroclorid Chuẩn DĐVN Chuẩn DĐVN Chuẩn EU Chuẩn VKNTTW số lô WS.0316265.03, HL: 98,28% Độ ẩm : 0,04% Chuẩn VKNTTW SKS: 0103129, HL: 100,10% (HPLC), 99,70% (UV- VIS) Độ ẩm: 0,09% Chuẩn Dược Điển Châu ÂU CAS Number: 330808-8-3, HL: 100,0% Dung môi 10 Methanol Acetonitril Acid formic Ether dầu hỏa Methanol 11 Nước cất HPLC HPLC PA AR AR Tinh khiết Merck - Đức Merck - Đức Merck - Đức Trung Quốc Trung Quốc 2.2 Thiết bị, dụng cụ -Máy sắc ký lỏng khối phổ Brucker Evog Qube, (Mỹ)- Cột tách Restek Ultra II C18 (100mm × 2,1 mm, 1,9m), (Mỹ) 2.3 Nền mẫu Nền mẫu viên nang cứng nhóm nghiên cứu Trường Đại học Dược cung cấp với mức liều dự kiến khoảng 2,00 g III Quy trình phân tích kết thẩm định 3.1 Mô tả phương pháp Xử lý mẫu Cân xác đơn vị mẫu, tính khối lượng trung bình Đồng mẫu, nghiền mịn Cân xác lượng bột tương ứng ½ liều (1,00 g) vào ống falcon dung tích 50 ml Thêm xác 25 ml methanol, lắc xoáy phút, siêu âm 10 phút, ly tâm 6000 vịng/phút phút Pha lỗng lớp dịch phía 50 lần methanol Lọc qua màng lọc 0,22 µm Điều kiện sắc ký: - Cột: Restek Ultra II C18 (100 mm × 2,1 mm; 1,9 m) (Mỹ) - Cột bảo vệ: Restek Ultra C18 Guard Cartridge (10 mm × mm; m) (Mỹ) Trang 3/17 BÁO CÁO THẨM ĐỊNH TIÊU CHUẨN KỸ THUẬT - Nhiệt độ buồng cột: 40oC - Thể tích tiêm mẫu: µl - Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút - Thời gian phân tích: 12 phút - Pha động: Kênh A HCOOH 0,1%/H2O kênh B HCOOH 0,1%/ACN - Gradient bảng sau: Thời gian (phút) %A %B 0-7 70 → 30 30 → 70 - 8,5 30 → 70 70 → 30 8,5 - 12 70 30 Điều kiện khối phổ: Điện áp đầu phun: 3500V Khí chắn: 20psi Nhiệt độ nón: 250C Khí ion hóa 1: 40psi Nhiệt độ ion hóa: 250C Khí ion hóa 2: 45psi CID gas: Ar 1.5mTorr Bảng Điều kiện khối phổ chất phân tích Tên chất Sildenafil Ion mẹ (m/z) 475,2 Vardenafil 489,2 Tadalafil 390,0 Ion (m/z) 100,3 283,0 151,1 312,0 268,0 169,0 CE (eV) 24 35 40 37 11 34 Tỷ lệ (%) 73,9 26,1 75,0 25,0 75,4 24,6 3.2 Kết thẩm định 3.2.1 Độ đặc hiệu * Thực nghiệm - Mẫu chuẩn: Mẫu hỗn hợp chuẩn SIL 500 ng/ml; VAR, TAD 160 ng/ml methanol - Mẫu nền: chuẩn bị phần Xử lý mẫu, mục 3.1 Mô tả phương pháp; Trang 4/17 BÁO CÁO THẨM ĐỊNH TIÊU CHUẨN KỸ THUẬT Mẫu tự tạo: thêm vào mẫu hỗn hợp chuẩn chất phân tích có nồng độ - tương đương nồng độ chất mẫu hỗn hợp chuẩn Chuẩn bị phần Xử lý mẫu, mục 3.1 Mô tả phương pháp * Kết Nền mẫu thêm chuẩn Hỗn hợp chuẩn Nền mẫu Hình Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu phương pháp Kết cho thấy sắc ký đồ mẫu hồn khơng xuất pic trùng với thời gian lưu chất phân tích Trên sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn, pic xuất trùng với thời gian lưu chuẩn, pic có hình dạng cân đối, sắc nét Như vậy, phương pháp phân tích đáp ứng yêu cầu độ đặc hiệu 3.2.2 .Độ thích hợp hệ thống * Thực nghiệm - Mẫu chuẩn: Sử dụng dung dịch chuẩn hỗn hợp pha mục 3.2.1 Độ đặc hiệu - Phân tích lặp lại lần dung dịch chuẩn hỗn hợp hệ thống LC-MS/MS với điều kiện sắc ký mục 3.1 Mô tả phương pháp * Kết Bảng Kết đánh giá độ phù hợp hệ thống LC-MS/MS Hoạt chất tR SIL Spic L1 3,850 L2 3,851 L3 3,853 L4 3,857 L5 3,858 L6 3,855 TB 3,854 48230 47116 48355 47467 48392 48255 47969,2 RSD 0,1 1,1 Trang 5/17 BÁO CÁO THẨM ĐỊNH TIÊU CHUẨN KỸ THUẬT VAR TAD tR 3,212 3,213 3,217 3,216 3,222 3,252 3,222 0,5 Spic 8866 8907 8884 8742 8511 8731 8773,5 1,7 tR 3,260 3,251 3,263 3,267 3,255 3,259 3,260 0,2 Spic 61394 60998 60477 61982 63335 63815 62000,2 2,1 *: tR (phút); Spic (Counts) Nhận xét: Kết cho thấy hệ số biến thiên (RSD) thời gian lưu thấp (