Đang tải... (xem toàn văn)
BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HÀNH, CÔNG NGHỆ SINH HỌC, Tiếp cận phương pháp PCR, Sử dụng phương pháp PCR, phát hiện Salmonella trong mẫu vật
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVHD: TS NGUYỄN MINH XUÂN HỒNG ThS TƠN BẢO LINH NHĨM THỰC HIỆN: VÕ ĐÌNH TÍN LÊ BẠCH NGỌC TRÂN HỒNG QUANG BÌNH Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2017 MỤC LỤC MỤC LỤC DANH SÁCH BẢNG DANH SÁCH HÌNH Chương Mở đầu .4 1.1 Đặt vấn đề .4 1.2 Mục tiêu Chương Tổng quan 2.1 Khái quát Salmonella 2.2 Kỹ thuật PCR .7 Chương Vật liệu phương pháp 3.2.1 Phương pháp thực 3.2.1 Tiền tăng sinh mẫu 3.2.2 Qui trình tách chiết DNA 3.2.3 Thực phản ứng PCR 12 3.2.4 Điện di kiểm tra kết PCR 13 3.2.2 Đọc kết 16 Chương Kết luận .17 DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR 12 Bảng 3.2 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR 12 DANH SÁCH HÌNH Hình 3.1: Dung dịch tiện tăng sinh Hình 3.2: Loại bỏ xác mẫu dung dịch tiện tăng sinh Hình 3.3: Thu kết tủa 10 Hình 3.4: Thu kết tủa lần 10 Hình 3.5: Làm lạnh dung dịch 11 Hình 3.6: Phản ứng PCR 11 Hình 3.7: Các bước chuẩn bị gel agarose 1% 14 Hình 3.8:Các bước thực điện di gel agarose 14 Hình 3.9: Chọn hiệu điện điện di 14 Hình 3.10 Xem kết chạy điện di 15 Hình 3.11 Xem kết chạy điện di đèn UV 15 Chương Mở đầu Đặt vấn đề Cuộc sống ngày phát triển, nhiều thiết bị đại phát minh giúp cho ngành công nghệ thực phẩm phát triển, đáp ứng nhu cầu người thực phẩm Bên cạnh đó, phương pháp chế biến thực phẩm cải tiến hơn, nhiều phương pháp nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm đưa ra, giúp rút ngắn thời gian chế biến, tăng cấu trúc, màu sắc hương vị sản phẩm Tuy nhiên, vấn đề quan tâm ngành thực phẩm vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm Một lồi vi sinh vật có khả gây ngộ độc cao quan tâm nhiều Salmonella Salmonella tên chung nhiều loại vi khuẩn Chúng có mặt loại thịt gia cầm trứng, hay trái rau Hầu hết loại Salmonella tác hại trực tiếp vào bao tử khiến người bệnh đau bụng, tiêu chảy nơn mửa vài ngày Cũng có loại vào đường ruột, gây thương hàn khiến người bệnh tử vong Do đó, việc phát Salmonella có thực phẩm đặt lên hàng đầu Phương pháp đại gần sử dụng nhiều PCR (Polymerase Chain Reaction) phương pháp khuếch đại DNA chuyên biệt cách sử dụng mồi chuyên biệt Trong báo cáo này, nhóm xin trình bày phương pháp PCR sử dụng để phát Salmonella thực phẩm Mục tiêu - Tiếp cận phương pháp PCR - Sử dụng phương pháp PCR phát Salmonella mẫu vật Chương Tổng quan 2.1 Khái quát Salmonella Salmonella xếp vào giới Bacteria, ngành Proteobacteria, họ Enterobacteriaceae, chi Salmonella Giống Salmonella chia thành lồi: Salmonella bongori (khơng gây bệnh) Salmonella enterica (gây bệnh) Ðến nay, 2.500 kiểu huyết thuộc chi Salmonella S enterica lại chia làm loài khác S enterica (S enterica I), S salamae (S enterica II), S arizonae (S enterica IIIa), S diarizonae (S enterica IIIb), S houtenae (S enterica IV) S indica (S enterica VI) Phần lớn, serotype thuộc S enterica I nguyên nhân gây 99,9 % bệnh nhiễm trùng người động vật Trong đó, số lồi Salmonella có tầm quan trọng chẩn đoán bệnh ngườivà động vật là: - S typhi: gây bệnh cho người Ở Việt Nam, bệnh thương hàn chủ yếu vi khuẩn gây - S paratyphy A: gây bệnh thương hàn cho người Ở Việt Nam, thường phát hiệnvi khuẩn sau vi khuẩnS typhi - S paratyphy B: gây bện thương hàn chủ yếu cho người, đơi có súc vật, thương phát hiệnở nước châu Âu - S paratyphy C: vừa có khả gây bệnh thương hàn vừa có khả gây bệnh viêm dày ruột nhiễm khuẩn huyết, thường xuất hiệnở nước Đông Nam Á - S typhimurium S enteritidis gây bệnh cho người gia súc, nguyên nhân chủ yếu nhiễm khuẩn, nhiễm độc thức ăn vi khuẩn Salmonella - S choleraesuis: nguyên thường gặp nhiễm trùng huyết vi khuẩn Về hình thái, Salmonella trực khuẩn Gram âm, hình que, ngắn, hai đầu tròn, kích thước trung bình khoảng 0,4 – 0,6 x – µm, di chuyển tiên mao trừ S gallimarum S pullorum, có khoảng đến 12 tiên mao bao quanh thân; phát triển tốt nhiệt độ °C- 42 °C, thích hợp 37 °C, pH thích hợp 6,8 – 7,2 Đặc điểm nuôi cấy Salmonella vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, phát triển mơi trường nuôi cấy thông thường, làmđục môi trường canh thang sau 18 h Trên môi trường thạch thường, khuẩn lạc Salmonella tròn, lồi, trắng xám, trong, bờ đều, đường kính khoảng1 – 1,5 mm Salmonella mọc mơi trường có chất ức chế chọn lọc HE (hektoen entericagar), XLD (xylose lysine deoxycholate) Trên môi trường HE, khuẩn lạc Salmonella có màu thay đổi từ xanh dương đến xanh lục, có hay khơng có tâm đen, số dòngSalmonella có tâm đen bóng lớn chiếm gần hết khuẩn lạc.Còn mơi trường XLD, khẩn lạc đặc trưng Salmonella có màu hồng suốt,có hay khơng cótâm đen, số dòng Salmonella có tâm đen bóng lớn chiếm gần hết khuẩn lạc, môi trường xung quanh khuẩn lạc chuyển sang màu đỏ Đặc điểm sinh hóa Phần lớn, chủng Salmonella không lên men lactose, lên men glucose sinh Phản ứng oxidase âm tính, indol âm tính, VP âm tính, ure âm tính, H2S dương tính 2.2 Kỹ thuật PCR PCR (Polymerase chain reaction) phương pháp sử dụng sinh học phân tử để khuếch đại hay vài đoạn DNA sinh vật, tạo thành hàng triệu bảo từ trình tự đặc trưng ban đầu Phương pháp áp dụng phổ biến để khuếch đại đoạn DNA mục tiêu hữu ích chẩn đốn theo dõi bệnh di truyền, định danh sinh vật nghiên cứu chức gen Phản ứng PCR gồm thành phần: DNA khuôn, mồi xuôi mồi ngược, nucleodite (dNTP), enzyme DNA polymerase, MgCl2 dung dịch đệm Thơng qua chu kì ln nhiệt, đoạn DNA mục tiêu tổng hợp nhờ enzyme DNA polymerase Hình 2.1 Thành phần chu kì nhiệt phản ứng PCR Chương Vật liệu phương pháp 3.1 Dụng cụ thiết bị 3.1.1 Dụng cụ Pipet 200- Kéo 1000 µL Bao tay Pipet 20- 200 µL Đầu hút pipet 200-1000 µL Pipet 2.0- 20 µL Đầu hút pipet 20- 200 µL Pipet 1.0-10 µL 3.1.2 Thiết bị Cân phân tích Máy Vortex Tủ hút Máy PCR Máy ly tâm tốc độ 6000 vòng, Lò vi sóng >11.000 vòng Water bath (1000C) Bộ điện di ngang 3.2 Phương pháp thực 3.2.1 Tiền tăng sinh mẫu Cân 25 g mẫu cho vào túi nylon vô trùng, bổ sung 100 mL môi trường BPW vào túi Ủ mẫu chuẩn bị 37 + oC 18 ( + 2) 3.2.2 Qui trình tách chiết DNA Lấy mL dịch tiền tăng sinh mẫu vào ống eppendorf Hình 3.1: Dung dịch tiện tăng sinh Ly tâm 6000 vòng/10 giây để loại bớt xác mẫu, thu dịch để ly trích DNA Hình 3.2: Loại bỏ xác mẫu dung dịch tiện tăng sinh Ly tâm 11.000 vòng/10 phút, đổ bỏ dịch thu kết tủa (sinh khối tế bào) Hình 3.3: Thu kết tủa Huyền phù tủa mL dung dịch PBS nước cất vơ trùng Ly tâm 11.000 vòng 10 phút, sau bỏ dịch thu phần tủa Hình 3.4: Thu kết tủa lần Huyền phù tủa 200 µL dung dịch đệm TE cách vortex 10 giây Đun ống mẫu 100 oC 15 phút Làm lạnh nhanh ống cách đặt ống đá 15 phút Hình 3.5: Làm lạnh dung dịch Vortex 10 giây Ly tâm 11000 vòng 10 phút oC Thu 50 – 100 µL phần dung dịch sang tube Tiến hành thực phản ứng PCR bảo quản DNA ly trích -20 oC 3.2.3 Thực phản ứng PCR Hình 3.6: Phản ứng PCR Chuẩn bị phản ứng PCR với thành phần bảng 2.1 1 Đặt tube phản ứng vào máy PCR cài đặt máy theo bảng 2.2 Trình tự mồi khuếch đại đoạn DNA kích thước 429 bp đặc hiệu cho S typhimurium ST11: 5’- GCC AAC CAT TGC TAA ATT GGC GCA -3’ ST15: 5’- GGT AGA AAT TCC CAG CGG GTA CTG G – 3’ Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích hút (μL) PCR master mix 1X 12,5 Mồi xuôi 10 μM 0,6 µM 1,5 Mồi ngược 10 μM 0,6 µM 1,5 DNA khn μL Nước (4,5µL) Thêm vào cho đủ 25 μL Bảng 3.2 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ 95 phút Biến tính 94 20 giây Bắt cặp 60 30 giây Kéo dài 72 30 giây 72 phút Giai đoạn Biến tính ban đầu Khuếch đại Kết thúc 35 3.2.4 Điện di kiểm tra kết PCR Thể tích dung dịch agarose cần 190ml nồng độ 1,5% => m agarose =2,85g Làm tan agarose với dung dịch đệm TBE 0,5X Thể tích dung dịch đệm TBE cần là: 500ml nồng độ 10X dùng cho vào bồn điện di + 190ml nồng độ 10X dùng pha agarose = 690ml Pha 690ml dung dịch đệm TBE từ 10X cần dùng 34,5ml TBE 10X Vậy để pha TBE 0.5X cần: Pha 500 ml cần 25 ml TBE 10X Pha 190 ml cần 9.5 ml TBE 10X 3.2.4.1 Chuẩn bi gel agarose 1% + Cân 2,85g agarose cho vào bình tam giác + Bổ sung 190ml dung dịch đệm TBE 10X (vào bình tam giác lắc nhẹ) + Làm tan agarose lò vi sóng, + Đợi agarose nguội khoảng 650C đổ vào khay gel + Gắn lược gel vào khay đợi khoảng 15 phút cho gel nguội đông lại + Nhẹ nhàng gở lược gel khỏi miếng agarose 3.2.4.2 Chuẩn bị bồn điện di + Cho 25 ml TBE vào bình 500 ml + Cho thêm nước cất, định lượng đến 500 ml + Cho 500ml dung dịch đệm TBE 0,5X vào bồn điện di + Cho khay gel agarose vào bồn cho dung dịch đệm ngập gel 0,5cm Hình 3.7: Các bước chuẩn bị gel agarose 1% 3.2.4.3 Cho mẫu vào giếng Đặt gel vào bồn điện di Bơm mẫu vào giếng Hình 3.8:Các bước thực điện di gel agarose Chạy điện di hiệu điện 100V 30 phút Hình 3.9: Chọn hiệu điện điện di 3.2.2 Đọc kết Hình 3.10 Xem kết chạy điện di Hình 3.11 Xem kết chạy điện di đèn UV 15 Chương Kết luận Dựa vào khả tích điện DNA, biết mẫu kiểm tra có chứa DNA vi khuẩn hay khơng Vạch số 18 số 19 (hình 3.9) tương đương với đối chứng dương đối chứng âm mẫu Khi có dòng điện qua, phân tử tích điện âm có xu hướng di chuyển cực dương điện trường va ngược lại, phân tử tích điện dương lại có xu hướng di chuyển cực âm Hình 3.9 cho thấy vệt đối chứng âm (vạch số 19) gần không di chuyển mà đứng yên, vệt đối chứng dương (vạch số 18) di chuyển xa vạch số 19 cực âm điên trường Qua đó, đọc kết kiểm tra vạch mẫu di chuyển xa đối chứng dương cực âm DNA vi khuẩn Để biết độ dài vệt kết quả, so sánh dãy vạch đối chứng số Theo kết điện di hình 3.9, kết nhóm vạch số số 4, đó, vạch số 3(số 3) kết thịt gà nạc 4oC (số 4) thịt gà xay 0oC Hai mẫu số số chứa DNA Salmonella nên vệt di chuyển mẫu xa so với vạch đối chứng âm Quan sát hình 3.9 cho thấy vệt chứa vi khuẩn di chuyển xa vạch đối chứng âm cực dương Dựa vào kết kết luận thịt gà chứa nhiều Salmonella thịt tôm (vạch số 5), thịt heo (vạch số 7) Dù bảo quản nhiệt độ lạnh đông hay bảo quản nhiệt độ mát vi khuẩn tồn thịt gà mà không bị tiêu diệt Hơn nữa, vi khuẩn có khả đề kháng tốt với nhiệt độ lạnh đông Sản phẩm thịt gà xay hay thịt gà nguyên nhiễm vi khuẩn với lượng Vì vậy, cần có cách bảo quản thịt gà với điều kiện khác tốt để đảm bảo chất lượng thịt ... gây ngộ độc cao quan tâm nhiều Salmonella Salmonella tên chung nhiều loại vi khuẩn Chúng có mặt loại thịt gia cầm trứng, hay trái rau Hầu hết loại Salmonella tác hại trực tiếp vào bao tử khiến... thực phẩm Bên cạnh đó, phương pháp chế biến thực phẩm cải tiến hơn, nhiều phương pháp nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm đưa ra, giúp rút ngắn thời gian chế biến, tăng cấu trúc, màu sắc hương vị... khoảng 0,4 – 0,6 x – µm, di chuyển tiên mao trừ S gallimarum S pullorum, có khoảng đến 12 tiên mao bao quanh thân; phát triển tốt nhiệt độ °C- 42 °C, thích hợp 37 °C, pH thích hợp 6,8 – 7,2 Đặc điểm