Đang tải... (xem toàn văn)
BÁO CÁO THÍ NGHIỆM, HÓA SINH, ĐỊNH TÍNH & KHẢO SÁT PROTEIN, Ngày thí nghiệm: 17/08/2018
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG – Bm Công nghệ Sinh học o_oOo_o BÁO CÁO THÍ NGHIỆM HĨA SINH GVBM: Nhóm Tên Sv Heng Tuệ Minh Gwendoline Ngô Bảo Ngân Vũ Thanh Tâm MSSV 61703101 61703151 61703199 ĐIỂM Bài số: Tên bài: ĐỊNH TÍNH & KHẢO SÁT PROTEIN Ngày thí nghiệm: 17/08/2018 I Phản ứng Biuret: Nguyên tắc: Phản ứng màu Biuret phản ứng dùng để nhận biết có mặt liên kết peptide cấu trúc hóa học hợp chất hữu Do protein mạch peptide có chứa nhóm -CO-NH- (liên kết peptide) nên chúng có phản ứng Biuret Các hợp chất có từ liên kết peptide liên kết với Cu2+ mơi trường kiềm tạo phức có màu đỏ tím đỏ đặc trưng Cường độ màu phức hợp phụ thuộc vào số lượng liên kết peptide mạch Cách tiến hành Ống nghiệm Biuret Cho vào ống nghiệm vài tinh thể ure, đun nhẹ, Protein trứng NaOH 10% CuSO4 2% ml giọt ml ml giọt Kết Ống nghiệm : Ure tan tạo thành Biuret Sau cho dd NaOH 10% CuSO4 2%, dung dịch chuyển từ trắng sang màu đỏ tím Ống nghiệm : Sau cho dd NaOH 10% CuSO4 2% vào dd protein , dung dịch chuyển sang màu tím xanh Giải thích Do lượng liên kết peptit ống nghiệm chứa biure nên ống nghiệm chuyển sang màu đỏ tím Còn ống nghiệm 2, lượng peptit có protein trứng vô nhiều nên làm ống nghiệm chuyển sang màu tím xanh So sánh với lý thuyết: Lý thuyết cho thấy cường độ màu phức hợp phụ thuộc vào số lượng liên kết peptid mạch Vì kết sau thực hành ống nghiệm xác minh cho lý thuyết II Các phản ứng kết tủa Protein Kết tủa Protein muối trung tính a) Nguyên tắc Các muối trung tính phổ biến thường gây kết tủa protein muối kim loại kiềm, kiềm thổ NaCl, (NH4)2SO4, MgSO4,… Cùng muối trung tính nồng độ khác khả kết tủa khác b) Cách tiến hành 3ml dung dịch protein trứng +3ml(NH4)2SO4 bão hòa Cho vào ống nghiệm 1.Lắc Lọc Tủa Thu dịch lọc + từ từ (NH4)2SO4 tinh thể không tan Cho vào ống nghiệm 2.Lắc đều2 Tủa c) Kết - Khi thực xong thí nghiệm trên, thu kết tủa Kết tủa thu cho protein trứng tác dụng với muối trung tính (NH4)2SO4 lắc Kết tủa thu cho dịch lọc thu sau lọc với tinh thể muối (NH4)2SO4, lắc lên thấy rõ hạt li ti kết tủa d) Nhận xét so sánh với lý thuyết - Kết tủa globulin kết tủa thu albumin Đây loại protein có lòng trắng trứng protein bị kết tủa cho tác dụng với muối trung hòa (NH4)2SO4 Hiện tượng chứng minh cho lý thuyết protein bị kết tủa muối trung tính - Lưu ý: Muối trung tính tạo kết tủa có tính thuận nghịch, sau phản ứng kết thúc kết tủa quay trở lại bình thường - Dùng phản ứng tủa thuận nghịch để chiết protein dạng tinh khiết, điều chế sản phẩm men, nội tiết tố Vì q trình, muối kết protein khơng tính chất vật lí, hóa học sinh học đặc hiệu e) Giải thích: Tại cho protein tác dụng với muối trung tính lại xuất kết tủa ? - Vì chuỗi protein có gốc R ưa nước hướng ngồi, từ phân tử protein dễ bị hydrat hóa, từ xuất lớp phân tử nước bao xung quanh, có đầu tích điện âm quay ngồi, làm protein ‘tan’ nước Khi cho muối trung hòa (NH4)2SO4 vào thực tế cho ion NH4 + SO42- vào ion lấy lớp lớp áo ion- bên ngồi, hay nói làm bất hoạt cac gốc ưa nước protein, làm chúng kết tụ lại với để tạo thành kết tủa Tại kết tủa xuất globumin mà albumin: - Vì đường kính phân tử globumin lớn so với albumin Các ion NH4+ SO42- dễ tác dụng vào lớp ion âm bao quanh globumin hơn, từ tạo kết tủa globumin trước albumin ta dung dịch bán bảo hòa albumin Nên cho tinh thể (NH4)2SO4 vào tức làm cho dung dịch lọc trạng thái bảo hòa, lúc albumin có tượng kết tủa Kết tủa protein acid hữu a) Nguyên tắc: - Sử dụng acid hữu để làm tác nhân gây kết tủa không thuận nghịch protein b) Cách tiến hành ống nghiệm chứa ống 1ml protein trứng Ống Ống +5 giọt TCA 10%, lắc nhẹ +5 giọt acid sunfolsalisilic,lắc nhẹ c) Kết quả: - Ở ống có xuất kết tủa đục - Ở ống có xuất kết tủa đục với thời gian nhanh độ đục nhiều so với ống d) Nhận xét so sánh với lý thuyết: - Vì axit Sunfosalisilic kết tủa protein polypeptide axit amin TCA* có khả kết tủa protein - Vì axit sunfosasilic axit mạnh TCA nên có thời gian nhanh độ đục nhiều - Lưu ý: Sau tác dụng với acid hữu cơ, protein kết tủa, biến tính khơng thể trở lại trạng thái ban đầu acid hữu tác nhân gây kết tủa không thuận nghịch Kết tủa protein muối kim loại nặng a) Nguyên tắc: Sử dụng ion kim loại nặng( hầu hết nằm nhóm chuyển tiếp) để tác dụng với protein gây kết tủa Thường phản ứng xảy nhanh chóng, ứng dụng vào việc giải độc cho thể nhiễm kim loại nặng chì, thủy ngân,… b) Cách tiến hành thí nghiệm : Cho ống nghiệm 1ml lòng trắng trứng Ống nghiệm Dung dịch nhỏ vào Pb(CH3COO)2 2% AgNO3 2% FeCl3 0.5% CuSO4 2% Lần Lần Nhỏ giọt theo thành ống chờ kết tủa xuất Cho lượng thừa để xem tủa tan Thứ tự xuất kết tủa c) Kết quả: Ống xuất kết tủa màu trắng đục, sau từ từ tan Ống xuất kết tủa, cho thêm vào lượng muối kết tủa không tan tách lớp Ống xuất kết tủa màu vàng nâu, cho dư muối kết tủa tan nhanh Ống chuyển từ màu xanh trắng sang xanh nhạt có xuất kết tủa, sau cho thêm muối kết tủa tan Ống nghiệm chứa lòng trắng trứng d) - - a) b) - Sau cho dung dịch vào ống nghiệm Nhận xét so sánh với lý thuyết: Các muối kim loại nặng tác dụng với protein tạo thành kết tủa ion kim loại nặng làm lộ đầu kỵ nước protein ngồi biến tính protein sâu sắc, phá vỡ cấu trúc bậc 2,3 protein Tại ion kim loại có hóa trị cao làm kết tủa tan nhanh so với ion kim loại có hóa trị thấp ? Trả lời: Tại cho dư lượng muối định kết tủa ống nghiệm tan ? Trả lời: Vì bỏ dư lượng muối dẫn đến dư thừa ion kim loại nặng kết tủa lại bị tan phân tử keo hấp thụ ion kim loại nặng bề mặt tiểu phân tử protein làm chúng tích điện dương (trở thành trạng thái tích điện) Ion có hóa trị cao kết tủa dễ tan trở lại Kết tủa protein nhiệt Nguyên tắc: Sử dụng nhiệt độ chất cần thiết để tạo kết tủa từ protein, qua rút nhiệt độ nguyên nhân gây kết tủa Cách tiến hành thí nghiệm: Bước 1: Lấy ống nghiệm cho vào ống 2ml dung dịch protein trứng Bước 2: Ống nghiệm Protein trứng CH3COOH 1% CH3COOH 10% NaOH 10% NaCl bão hòa Gia Nhiệt Thứ tự xuất kết tủa 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml Đun sôi Đun sôi Đun sôi giọt 5-8 giọt 5-8 giọt 5-8 giọt Đun sôi 5-8 giọt Đun sôi Không kết tủa Không kết tủa c) Kết quả: - Ống nghiệm có xuất kết tủa màu trắng, dừng đun khơng thấy trở lại trạng thái ban đầu, thời gian xuất lâu ống nghiệm 2,5 - Ống nghiệm có xuất có kết tủa trắng đục, thời gian xuất nhanh ống - Ống nghiệm 3,4 không thấy xuất kết tủa sau đun khoảng thời gian - Ống xuất kết tủa sớm nhất, lấy ngồi thời gian không thấy trở lại trạng thái ban đầu Ống nghiệm trước nhỏ dung dịch (chỉ chứa lòng trắng trứng) 10 Sau cho dung dịch đun sôi d) Nhận xét so sánh với lý thuyết - Ống có tác dụng với nhiệt độ, mạch protein bị giãn nở, liên kết thứ cấp bị phá vỡ, từ protein vón cục khơng theo quy luật tạo thành kết tủa - Ống có kết tủa trắng đục cho giọt axit axetic 1% tạo nên môi trường axit yếu Nhóm -COO- bị ức chế phân ly nên tiểu phân tử protein điện tích pH mơi trường đạt gần tới điểm đẳng điện - Ống cho 0.5 ml axit axetic 10% tạo nên môi trường axit mạnh Do tính háo nước axit mơi trường axit mạnh có nhiều ion H+ nên protein bị khử nước Các nhóm -COO- trung hòa nhóm NH3+ khơng trung hòa Phân tử protein tích điện dương Do khơng tạo kết tủa - Ống thêm giọt NaOH 10% gây mơi trường kiềm Nhóm NH3+ trung hòa Vì đun sơi điện tử âm cuả tiểu phân tử protein Protein tích điện âm khơng tạo tủa - Ống cho giọt axit axetic 1% giọt NaCl bảo hòa tạo nên mơi trường trung hòa điện, từ tạo kết tủa Nhiệt độ tác nhân gây biến tính gây kết tủa protein Vì nhiệt độ tác nhân gây kết tủa không thuận nghịch nên sử dụng tác nhân nên cân nhắc kỹ Để tránh làm biến tính protein thực phẩm, sử dụng biện pháp xác định nhiệt độ gây biến tính protein Xác định điểm đẳng điện protein a) Nguyên tắc: - Điểm đặc trưng điểm đẳng điện protein protein bị kết tủa lại Từ đó, xác định độ pH cần để gây kết tủa protein ngược lại Dựa thước đo pH xác định từ trước, việc xác định điểm đẳng điện giúp protein tránh kết tủa ngược lại b) Cách tiến hành thí nghiệm: Ống nghiệm 0,2M(ml) Acid citric 0,1M(ml) pH tương ứng 0.50 0.68 0,96 1,32 1,50 1,32 1,04 0,68 3,2 3,7 4,7 5,7 11 Lượng dd Rượu Thang độ albumin 1% ethylic(m đục( (ml) l) nhất, đục nhất) 1 1 1 1 - Lấy ống nghiệm bắng nhau(sạch, sấy khô),cho vào ống nghiệm dung dịch acid citric theo bảng sau,lắc cho albumin vào, thêm cồn, lắc nhẹ Để yên phút xuất kết tủa mức độ khác c) Nhận xét so sánh với lý thuyết - Điểm đẳng điện protein gần với 4.7 pH 4.7 mức độ kết tủa đạt lớn - Khi độ pH đạt đến điểm đẳng điện, tức tổng số điện tích âm tổng số điện tích dương phân tử protein 0, lúc đó, protein dễ dàng di chuyển kết tụ lại với Đông tụ sữa protease a) Nguyên tắc: - Xác định hoạt động đông tụ sữa dựa vào thời gian cần thiết để làm đông tụ thể tích dung dịch sữa có nồng độ xác định b) Cách tiến hành thí nghiệm: - Pha dung dịch sữa gầy 10% 0,01M - Lấy dứa (thịt,vỏ,lõi) vắt lấy nước, lọc ly tâm thu nước dịch enzyme - Cho 5ml dung dịch sữa vào ống nhiệm, để vào bể điều nhiệt đến đạt C - Cho lượng dịch enzyme (khoảng 0,1-0,5ml), lắc - Tiếp tục giữ C, ghi lại thời gian tạo thành kết tủa protein, tính từ lúc bắt đầu cho enzyme vào lúc vừa xuất hạt sữa mịn nhỏ, rõ đỏ nhiệt kế.(dung dịch enzyme cần chuẩn bị cho thời gian đông tụ sữa khoảng 1-5 phút) 12 c) Kết tính tốn: Cho 5ml dung dịch sữa vào ống nghiệm, để vào bể điều nhiệt đến đạt 50oC Sau cho lượng enzyme (khoảng 0.1 – 0.5ml) vào, lắc Hạt sữa nhỏ đỏ nhiệt kế d) Nhận xét so sánh với lý thuyết: 13 - Protease động tụ sữa dạng protease có khả cơng vào vị trí Phe(105)-Met(106) kappa- casein làm lộ đầu kị nước dẫn tới tượng động tụ - Protease lấy từ thơm chứa enzym bromelin VS=5ml T= 11/12 phút VE= 0.5ml K=0.2 E = ? ĐV/ml - Công thức tính: E = = = 2.1818 ĐV/ml 14 ... sang m u t m xanh Giải thích Do lượng liên kết peptit ống nghi m chứa biure nên ống nghi m chuyển sang m u đỏ t m Còn ống nghi m 2, lượng peptit có protein trứng vơ nhiều nên l m ống nghi m chuyển... Cường độ m u phức hợp phụ thuộc vào số lượng liên kết peptide m ch Cách tiến hành Ống nghi m Biuret Cho vào ống nghi m vài tinh thể ure, đun nhẹ, Protein trứng NaOH 10% CuSO4 2% ml giọt ml ml giọt... chóng, ứng dụng vào việc giải độc cho thể nhi m kim loại nặng chì, thủy ngân,… b) Cách tiến hành thí nghi m : Cho ống nghi m 1ml lòng trắng trứng Ống nghi m Dung dịch nhỏ vào Pb(CH3COO)2 2% AgNO3