VN U ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ne an dP r ma c y, KHOA Y DƢỢC LÊ THỊ THANH ed ici PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT SAPONIN TỪ PHÂN ĐOẠN BUTANOL PHẦN THÂN RỄ SÂM LAI CHÂU ho ol of M (PANAX VIETNAMENSIS VAR FUSCIDISCUS K KOMATSU, S ZHU & S.Q CAI) Co p yri gh t@ Sc KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Hà Nội - 2018 VN U ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ma c y, KHOA Y DƢỢC ne an dP r LÊ THỊ THANH ho ol of M ed ici PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT SAPONIN TỪ PHÂN ĐOẠN BUTANOL PHẦN THÂN RỄ SÂM LAI CHÂU (PANAX VIETNAMENSIS VAR FUSCIDISCUS K KOMATSU, S ZHU & S.Q CAI) Khóa Ngƣời hƣớng dẫn : QH.2013.Y : TS Nguyễn Thị Duyên PGS.TS Dƣơng Thị Ly Hƣơng Co p yri gh t@ Sc KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Hà Nội - 2018 VN U LỜI CẢM ƠN y, Khóa luận kết cho q trình học tập, rèn luyện tơi Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội q trình nghiên cứu, thực hành Khoa Hóa ma c Thực vật – Viện Dược liệu Qua xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: ne an dP hướng dẫn tơi hồn thành đề tài khóa luận r TS Nguyễn Thị Duyên – Khoa Hóa Thực Vật – Viện Dược liệu, PGS.TS Dương Thị Ly Hương – Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, trực tiếp Lãnh đạo, thầy cô công tác Khoa Y – Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội giúp đỡ, tạo điều kiện để học tập, nghiên cứu khoa suốt năm học qua Cán nghiên cứu khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu, lãnh đạo Viện Dược liệu, đặc biệt PGS.TS Đỗ Thị Hà tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình tiến hành thực nghiệm ici Đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống trồng Sâm Lai ed Châu (Panax vietnamensis var fuscidiscus K Komatsu, S Zhu & S.Q Cai)”, mã ho ol of M số: KHCN-TB.16C/13-18, ThS Phạm Quang Tuyến chủ nhiệm hỗ trợ kinh phí để thực nghiên cứu Gia đình, bạn bè người ln ln tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ, động viên suốt thời gian học tập vừa qua Sc Dù nhận nhiều hướng dẫn giúp đỡ khóa luận khơng tránh khỏi thiết sót Tơi mong nhận ý kiến đóng góp thầy để khóa luận tơi hồn thiện Co p yri gh t@ Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 23 tháng năm 2018 Sinh viên Lê Thị Thanh Phân đoạn butanol Sâm Lai Châu BuOH Butanol CC Sắc ký cột (Column Chromatography) DCM Dicloromethan DCMLC Phân đoạn DCM Sâm Lai Châu DL/DM Dược liệu/Dung môi EtOH Ethanol GLUT4 Protein màng tế bào vân, tim, mỡ mô khác (Glucose transporter type 4) HPLC Sắc kí lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) LPS Lipopolysaccharid M Khối lượng phân tử (Mass) ma c Điểm nóng chảy (Melting Point) Phổ khối (Mass Spectroscopy) gh t@ Sc MS Yếu tố nhân kappa B (Nuclear Factor- Kappa B) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) PCA Phản ứng phản Anaphylaxis) PRT4 Pseudoginsenosid yri r Methanol Mp NMR ne an dP ici ed ho ol of M Khối lượng/điện tích MeOH NF-κB y, BLC m/z Co p VN U DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Rf Hệ số lưu SKĐ Sắc ký đồ vệ thụ động (Passive Cutaneous Receptor LPS (Tool-Like Receptor) TLTK Tài liệu tham khảo TNF-α Yếu tố hoại tử khối u (Tumor Necrosis Factor) Treg Regulary T cells TT Thứ tự UV-Vis Phổ tử ngoại (Ultra Violet – Visible) v/v Thể tích/ Thể tích VKH&CNVN Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam WLC Phân đoạn nước Sâm Lai Châu r ne an dP ici ed ho ol of M Sc gh t@ yri Co p VN U TLR4 y, Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) ma c TLC VN U DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các saponin có cấu trúc dạng protopanaxadiol Sâm Việt Nam y, Bảng 1.2 Các saponin có cấu trúc dạng ocotillol Sâm Việt Nam ma c Bảng 1.3 Các saponin có cấu trúc dạng oleanolic Sâm Việt Nam Bảng 1.4 Các saponin có cấu trúc dạng panaxatriol Sâm Việt Nam r Bảng 1.5 Các saponin có cấu trúc dạng dammarenediol Sâm Việt Nam 10 Bảng 3.1 Dữ liệu phổ hợp chất LC05 MR2 26 Co p yri gh t@ Sc ho ol of M ed ici ne an dP Bảng 3.2 Dữ liệu phổ hợp chất LC07 Rb1 30 VN U DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình vẽ Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv y, Hình 1.2 Hình ảnh Sâm Lai Châu Panax vietnamensis var fuscidiscus 13 ma c Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn Sâm Lai Châu 20 Hình 3.2 Sắc ký đồ phân đoạn Sâm Lai Châu, Sâm Việt Nam, phát r thuốc thử H2SO4 cồn tuyệt đối, hơ nóng 21 Hình 3.3 Sơ đồ phân lập hợp chất từ cao Sâm Lai Châu phân đoạn butanol 23 ne an dP Hình 3.4 Sắc ký đồ MR2 LC05 25 Hình 3.5 Cấu trúc hợp chất LC05 (majonosid R2) 28 Hình 3.6 Kết TLC LC07 với phân đoạn butanol 29 Co p yri gh t@ Sc ho ol of M ed ici Hình 3.7 Cơng thức hợp chất LC07 (ginsenosid Rb1) 32 VN U MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ma c y, DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH r ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN ne an dP 1.1 Tổng quan Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv 1.1.1 Vài nét chi Panax L 1.1.2 Vị trí phân loại Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv 1.1.3 Đặc điểm thực vật Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv ici 1.1.4 Phân bố Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv ed 1.1.5 Thành phần hóa học Sâm Việt Nam Panax vietnamensis Ha & Grushv 1.1.6 Tác dụng sinh học hợp chất có Sâm Việt Nam Panax ho ol of M vietnamensis Ha & Grushv 10 1.2 Tổng quan đối tượng nghiên cứu – Sâm Lai Châu 11 1.2.1 Đặc điểm thực vật 12 1.2.2 Phân bố 13 1.2.3 Mối quan hệ di truyền Sâm Lai Châu Sâm Việt Nam 13 Sc 1.2.4 Thành phần hóa học 14 1.2.5 Tác dụng sinh học 14 gh t@ CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tượng 15 Co p yri 2.2 Hoá chất, thiết bị 15 2.2.1 Hoá chất 15 2.2.2 Thiết bị 15 2.3 Phương pháp chiết xuất phân lập xác định cấu trúc hợp chất tinh khiết 16 VN U 2.3.1 Phương pháp chiết xuất phân lập 16 2.3.2 Phương pháp xác định nhận dạng cấu trúc 17 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 y, 3.1 Chiết phân đoạn Sâm Lai Châu phân lập hợp chất từ cao phân ma c đoạn butanol 20 3.1.1 Kết chiết phân đoạn Sâm Lai Châu 20 r 3.1.2 Kết phân lập hợp chất tinh khiết 22 3.1.3 Hằng số phân lập hợp chất phân lập từ Sâm Lai Châu 24 ne an dP 3.2 Biện luận cấu trúc hợp chất phân lập từ Sâm Lai Châu 25 3.2.1 Biện luận cấu trúc LC05 25 3.2.2 Biện luận cấu trúc LC07 28 Co p yri gh t@ Sc PHỤ LỤC ho ol of M TÀI LIỆU THAM KHẢO ed ici 3.3 Bàn luận 32 3.3.1 Về chiết xuất 32 3.3.2 Về phân lập, tinh chế nhận dạng cấu trúc hợp chất 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 VN U ĐẶT VẤN ĐỀ Nền kinh tế - xã hội ngày phát triển đại hơn, kéo theo nhu ma c y, cầu chăm sóc sức khỏe cho người ngày tăng Một sản phẩm chăm sóc sức khỏe người dược phẩm Với phát triển khoa học công r nghệ tiến bộ, nhà khoa học ln muốn tối ưu hóa cơng dụng thuốc hạn chế tối đa tác dụng phụ thuốc Một biện pháp hữu hiệu áp dụng tạo thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên thân thiện với người “Sâm” từ quen thuộc mà hay dùng để nói loài dược liệu ne an dP quý thuộc chi Panax L Có lẽ nghe đến Sâm biết đến công dụng tuyệt vời như: thuốc bổ, tăng lực, chống suy nhược, hồi phục sức lực bị suy giảm, kích thích nội tiết sinh dục, tăng sức chịu đựng, giải độc bảo vệ gan, điều hoà thần kinh trung ương, điều hoà tim mạch, hạ huyết áp, giảm đường huyết…[53] Cũng cơng dụng đáng nể đó, lồi Sâm ln trọng tìm kiếm, nghiên cứu phát triển ed ici Việt Nam tiếng với loài Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha & Grushv), lồi Sâm có hàm lượng saponin cao Năm 2013, Phan Kế Long cộng phát thứ Sâm đặt tên ho ol of M Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var fuscidiscus), bậc phân loại loài Sâm Việt Nam huyện Mường Tè, tỉnh Lai Châu [38] Mặc dù nghiên cứu sơ cho thấy Sâm Lai Châu chứa hàm lượng saponin tương đối cao đem lại hiệu đáng ý, song nay, nghiên cứu chi tiết thứ Sâm Sc Vì vậy, để làm sáng tỏ thành phần hóa học giá trị sử dụng Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var fuscidiscus) thực đề tài: “Phân lập, xác định cấu trúc số hợp chất saponin từ phân đoạn butanol phần gh t@ thân rễ Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var fuscidiscus K Komatsu, S Zhu & S.Q Cai)” với mục tiêu cần đạt được: Co p yri Chiết xuất phân lập số hợp chất từ phân đoạn n-butanol Xác định nhận dạng cấu trúc chất phân lập phân đoạn Co p yri gh t@ Sc ho ol of M ed ici ne an dP r ma c y, VN U 26 Kim, N D., Kang, S Y., and Schini, V B (1994), “Ginsenosides evoke endothelium-dependent vascular relaxation in rat aorta”, General Pharmacology 25, 1071–1077 27 Kim, Y C., Kim, S R., Markelonis, G J., and Oh, T H (1998b), “Ginsenosides Rb1 and Rg3 protect cultured rat cortical cells from glutamateinduced neurodegeneration”, Journal of Neuroscience Research 53, 426–432 28 Konoshima, T., Takasaki, M., Ichiishi, E., Murakami, T.,Tokuda, H., Nishino, H., Duc, N M., Kasai, R., Yamasaki, K (1999), “Cancer chemopreventive activity of majonoside-R2 from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis”, Cancer Letters 147(1-2), 6-11 29 Konoshima, T., Takasaki, M., Tokuda, H., Nishino, H., Duc, N M., Kasai, R., Yamasaki, K (1998), “Anti-tumor-promoting activity of majonoside-R2 from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv (I).”, Biological Pharmaceutical Bulletin 21(8), 834-8 30 Lee, S.-J., Ko, W.-G., Kim, J.-H., Sung, J.-H., Lee, S.-J., Moon, C.-K., and Lee, B.-H (2000), “Induction of apoptosis by a novel intestinal metabolite of ginseng saponin via cytochrome c-mediated activation of caspase-3 protease”, Biochemical Pharmacology 60, 677–685 31 Lee, S Y et al (2015), “Ocotillol, a Majonoside R2 Metabolite, Ameliorates 2,4,6-Trinitrobenzenesulfonic Acid-Induced Colitis in Mice by Restoring the Balance of Th17/Treg Cells”, Journal of Agricultural and Food Chemistry 63(31), 31-7024 32 Linné, C (1735), Systema Naturae, Leyden 33 Linné, C (1753), Species Plantarum, Stockholm 34 Lutomski J., Luan T.C and Hoa T.T (1992), "Polyacetylenes in the Araliaceae family Part IV", Herba Polonica 38(3), 137-140 35 Nguyen Minh Duc, Nguyen Thoi Nham, Ryoji Kasai, Aiko Ito, Kazuo Yamasaki and Osamu Tanaka (1993), “Saponins from Vietnamese Ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv Collected in Vietnam I”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin 41(11), 2010-2014 36 Park, E.-K., Shin, Y.-W., Lee, H.-U., Kim, S.-S., Lee, Y.-C., Lee, B.-Y., and Kim, D.-H (2005), “Inhibitory effect of ginsenoside Rb1 and compound K on NO and prostaglandin E2 biosynthesis of RAW 264.7 cells induced by lipopolysaccharide”, Biological Pharmaceutical Bulletin 28, 652–656 37 Park, E K.,Choo, M.-K., Han, M J., and Kim, D.-H (2004), "Ginsenoside Rh1 possesses antiallergic and anti-inflammatory activities", International Archives of Allergy and Immunology 133, 113-120 Co p yri gh t@ Sc ho ol of M ed ici ne an dP r ma c y, VN U 38 Phan Ke Long et al (2013), "Lai Chau ginseng Panax vietnamensis var fuscidiscus K Komatsu, S Zhu & S.Q Cai I morphology, ecology, distribution and conservation status", Proceeding of the 2nd VAST-KAST Workshop on Biodiversity and Bio-active compounds, 65-73 39 Radad, K., Gille, G., Moldzio, R., Saito, H., and Rausch, W.-D (2004b), “Ginsenosides Rb1 and Rg1 effects on mesencephalic dopaminergiccells stressed with glutamate”, Brain Research 1021, 41–53 40 Radad, K., Gille, G., Moldzio, R., Saito, H., Ishige, K., and Rausch, W.-D (2004a), “Ginsenosides Rb1 and Rg1 effects on survival and neurite growth of MPPỵ-affected mesencephalic dopaminergic cells, Journal of neural transmission 111, 37–45 41 Rausch, W.-D., Liu, S., Gille, G., and Radad, K (2006), “Neuroprotective effects of ginsenosides”, Acta Neurobiologiae Experimentalis 66, 369–375 42 Rhule, A., Navarro, S., Smith, J R., and Shepherd, D M (2006), “Panax notoginseng attenuates LPS-induced pro-inflammatory mediators in RAW264.7 cells”, Journal of Ethnopharmacology 106, 121–128 43 Rudakewich, M., Ba, F., and Benishin, C G (2001), “Neurotrophic and neuroprotective actions of ginsenosides Rb1 and Rg1”, Planta Medical 67, 533–537 44 Scott, G I., Colligan, P B., Ren, B H., and Ren, J (2001), “Ginsenosides Rb1 and Re decrease cardiac contraction in adult rat ventricular myocytes: Role of nitric oxide”, British Journal of Pharmacology 134, 1159–1165 45 Shang, W., Yang, Y., Jiang, B., Jin, H., Zhou, L., Liu, S., and Chen, M (2007), “Ginsenoside Rb1 promotes adipogenesis in 3T3-L1 cells by enhancing PPARg2 and C/EBPa gene expression”, Life Sciences 80, 618–625 46 Tran, Q L., Adnyana, I K., Tezuka, Y., Nagaoka, T., Tran, Q K., and Kadota, S (2001), "Triterpene saponins from Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis) and their hepatocytoprotective activity", Journal of Natural Products 64, tr 456–461 47 Wakabayashi, C., Murakami, K., Hasegawa, H., Murata, J., and Saiki, I (1998), “An intestinal bacterial metabolite of ginseng protopanaxadiol saponins has the ability to induce apoptosis in tumor cells”, Biochemical and Biophysical Research Communications 246, 725–730 48 Wang, W., Zhao, Z.-J., Rayburn, E R., Hill, D L., Wang, H., and Zhang, R (2007), “In vitro anti-cancer activity and structure-activity relationships of natural products isolated from fruits of Panax ginseng”, Cancer Chemotherapy and Pharmacology 59, 589–601 ma c y, VN U 49 Yamaguchi, Y., Haruta, K., and Kobayashi, H (1995), “Effects of ginsenosides on impaired performance induced in the rat by Scopolamine in a radial-arm maze”, Psychoneuroendrocrinology 20, 645–653 50 Yamassaki, K (2000), “Bioactive saponins in Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis”, Pharmaceutical Biology 38, 16-24 51 Zhu, S et al (2003), “A new variety of the Genus Panax from Southern Yunnan, China and its nucleotide sequences of 18S Ribosoma RNA Gene”, Journal of Japanese Botany 78(2), 86-94 C Trang Web 53 Wikimedia, ngày ne an dP r 52 Zhu, S., Zou, K., Fushimi, H., Cai, S., and Komatsu, K (2004), “Comparative study on triterpene saponins of ginseng drugs”, Planta Medical 70, 666–677 tháng năm 2018 https://vi.wikipedia.org/wiki/S%C3%A2m_Ng%E1%BB%8Dc_Linh 54 Cục sở hữu trí tuệ Việt Nam, ngày 20 tháng năm 2018, http://noip.gov.vn/noip/cms_vn.nsf/vwDisplayContentNews/DDDF190395A51 ici 545472580180013B989?OpenDocument Co p yri gh t@ Sc ho ol of M ed 55 Công ty cổ phần Dược Quảng Nam, ngày tháng năm 2018, https://sites.google.com/site/samngoclinh1000/tm-hiu-v-sm-ngc-linh VN U y, ma c r ne an dP PHỤ LỤC ici MẪU TIÊU BẢN CỦA ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU - SÂM LAI CHÂU Co p yri gh t@ Sc ho ol of M ed PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC VN U y, ma c r ne an dP ici ed ho ol of M Sc gh t@ Co p yri Phụ lục Mẫu tiêu Sâm Lai Châu (Viện Nghiên cứu Lâm sinh) , y c Phụ lục Phổ hợp chất LC05 (majonosid R2) e n ci d n a i d e l o o h c @ t h g ri C y p o M f o S Phụ lục 2.1 Phổ khối ESI-MS hợp chất LC05 r a Ph a m U N V Phổ 1H-NMR e n ci d n a i d e l o o h c @ t h g ri C y p o M f o S Phụ lục 2.2 Phổ 1H-NMR hợp chất LC05 r a Ph a m , y c U N V Phổ 13C-NMR e n ci d n a i d e l o o h c @ t h g ri C y p o M f o S Phụ lục 2.3 Phổ 13C-NMR hợp chất LC05 r a Ph a m , y c U N V Phổ DEPT e n ci d n a i d e l o o h c o C py @ t h g ri M f o S Phụ lục 2.4 Phổ DEPT hợp chất LC05 r a Ph a m , y c U N V , y c Phụ lục Phổ hợp chất LC07 (ginsenosid Rb1) e n ci d n a i d e l o o h c @ t h g ri C y p o M f o S Phụ lục 3.1 Phổ khối ESI-MS hợp chất LC07 r a Ph a m U N V Phổ H1-NMR e n ci d n a i d e l o o h c @ t h g ri C y p o M f o S Phụ lục 3.2 Phổ H1-NMR hợp chất LC07 r a Ph a m , y c U N V Phổ C13-NMR e n ci d n a i d e l o o h c @ t h g ri C y p o M f o S Phụ lục 3.3 Phổ C13-NMR hợp chất LC07 r a Ph a m , y c U N V Phổ DEPT e n ci d n a i d e l o o h c o C py @ t h g ri M f o S Phụ lục 3.4 Phổ DEPT hợp chất LC07 r a Ph a m , y c U N V gh t@ yri Co p Phụ lục 3.5 Phổ HSQC hợp chất LC07 ici ed ho ol of M Sc r ne an dP y, ma c VN U gh t@ yri Co p Phụ lục 3.6 Phổ HMBC hợp chất LC07 ici ed ho ol of M Sc r ne an dP y, ma c VN U ... fuscidiscus) thực đề tài: ? ?Phân lập, xác định cấu trúc s? ?? hợp chất saponin từ phân đoạn butanol phần gh t@ thân rễ S? ?m Lai Châu (Panax vietnamensis var fuscidiscus K Komatsu, S Zhu & S. Q Cai)? ?? với mục tiêu... Lai Châu (Panax vietnamensis var fuscidiscus K Komatsu, S Zhu & S. Q Cai), thứ cho khoa học loài S? ?m Việt (P vietnamensis Ha & Grushv) [38] 1.1.2 Vị trí phân loại S? ?m Việt Nam Panax vietnamensis. .. HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ma c y, KHOA Y DƢỢC ne an dP r LÊ THỊ THANH ho ol of M ed ici PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA MỘT S? ?? HỢP CHẤT SAPONIN TỪ PHÂN ĐOẠN BUTANOL PHẦN THÂN RỄ S? ?M LAI CHÂU (PANAX VIETNAMENSIS