ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI dP rm ac y, VN U KHOA Y DƯỢC ine an HOÀNG THỊ THÚY ed ic ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM ACETYLCHOLINESTERASE VÀ TÁC DỤNG M CHỐNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT CÂY BƠ Sc ho ol of (Persea americana Mill.) Co py rig ht @ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI dP rm ac y, VN U KHOA Y- DƯỢC an HOÀNG THỊ THÚY ed ic ine ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM ACETYLCHOLINESTERASE VÀ TÁC DỤNG M CHỐNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT CÂY BƠ of (Persea americana Mill.) ho ol KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Khóa: QH.2014.Y Người hướng dẫn 1: ThS ĐẶNG KIM THU Người hướng dẫn 2: PGS.TS BÙI THANH TÙNG Co py rig ht @ Sc (NGÀNH DƯỢC HỌC) HÀ NỘI – 2019 VN U LỜI CẢM ƠN Với sinh viên khóa luận quà cuối để lại mái trường ac y, thân yêu trước rời xa Và tơi thế, với tơi khóa luận khơng q mà hành trang tiếp bước cho đường tới Mỗi ngày thực nghiệm, ngày hồn thành khóa luận tơi gặp mn vàn khó khăn thật dP rm may mắn nhận nhiều giúp đỡ quý báu từ thầy cô, bạn bè người thân u để tơi hồn thành quà cách tốt Lời đầu tiên, xin trân trọng cảm ơn hai thầy cô hướng dẫn tơi khóa luận ThS Đặng Kim Thu PGS.TS Bùi Thanh Tùng – Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng khoa Y Dược Các thầy ln quan tâm, tận tình bảo an kĩ năng, kiến thức khơng khóa luận mà định hướng cho tơi đường tương lai tới, giúp vững tin đường phía trước ed ic ine Tơi xin chân thành cảm ơn Khoa Y Dược trang bị cho đầy đủ sở vật chất cho phép thực khóa luận Đồng thời q trình thực xin cảm ơn thầy cô giáo phụ trách môn Dược lý – Dược lâm sàng, Hóa dược – Kiểm nghiệm, Bào chế, Dược cổ truyền hết lòng giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi sử dụng dụng cụ, phòng thí nghiệm cho nhiều học M quý giá nghiên cứu khoa học ho ol of Cuối cùng, với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tơi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới bố mẹ, người thân bạn bè – người bên tôi, giúp đỡ, chia sẻ đồng hành tơi để vượt qua khó khăn khơng khóa luận mà suốt q trình học tập, nghiên cứu sống Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Co py rig ht @ Sc Tôi xin chân thành cảm ơn! Hoàng Thị Thúy Độ hấp thụ (Absorbance) ACh Acetylcholinesterase ATCI Acetylthiocholin iodid DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl DTNB Acid 5-5’-dithiobis-2-nitrobenzoic EtOAc Ethylacetate EtOH Ethanol FDA Hiệp hội Quản lý Thuốc Thực phẩm Hoa Kỳ IC50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%) rig ht @ ⃐ 𝐗 an ine M of n-buthanol Chỉ số hoạt động ion hidro (Hydrogen power) ho ol Sc SD ed ic Đơn vị quốc tế (Interational Unit) n-BuOH Ph dP rm AChE IU py Acetylcholin ac y, A Co VN U DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) Giá trị trung bình DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ VN U Hình 1.1 Sơ đồ trình sinh tổng hợp Acetylcholin .5 Hình 1.2 Các vị trí hoạt động Enzym AChE .5 Hình 1.3 Quả Bơ (Persea americana Mill) .13 ac y, Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo số chất Bơ 17 Hình 2.1 Nguyên liệu chiết xuất 20 dP rm Hình 2.2 Sơ đồ phản ứng tạo màu phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman .24 Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn hạt Bơ .28 Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn khả chống oxy hóa phần Bơ an 29 ine Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn khả chống oxy hóa acid ascorbic 29 ed ic Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn khả ức chế enzym AChE phần Bơ .31 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn khả ức chế enzym AChE Donezepil .31 M Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn khả chống oxy hóa phân đoạn hạt Bơ 33 of Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn khả ức chế enzym AChE phân đoạn dịch chiết hạt Bơ 34 ho ol Hình 3.8 Đồ thị Lineweaver – Burk cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH hạt Bơ 35 Co py rig ht @ Sc Hình 3.9 Đồ thị Dixon cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH hạt Bơ để xác định số ức chế Ki .36 DANH MỤC CÁC BẢNG VN U Bảng 1.1 Các chất chống oxy hóa nội sinh Bảng 1.2 Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa Bảng 1.3 Đặc điểm phân biệt ba giống Bơ 14 ac y, Bảng 1.4 Thành phần Bơ 15 Bảng 1.5 Thành phần dinh dưỡng 100g thịt Bơ tươi (USDA) 16 dP rm Bảng 2.1 Thành phần hỗn hợp phản ứng 24 Bảng 3.1 Giá trị IC50 Bơ, phần Bơ acid ascorbic khả quét gốc tự DPPH .30 Bảng 3.2 Giá trị IC50 Bơ, phần Bơ chất chuẩn Donezepil an khả ức chế enzym AChE 32 ine Bảng 3.3 Giá trị IC50 phân đoạn từ hạt Bơ acid ascorbic khả quét gốc tự DPPH 33 Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ic Bảng 3.4 Giá trị IC50 phân đoạn dịch chiết từ hạt Bơ chất chuẩn Donezepil khả ức chế enzym AChE 34 MỤC LỤC VN U LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ac y, DANH MỤC BẢNG MỞ ĐẦU dP rm CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh Alzheimer 1.1.1 Bệnh Alzheimer an 1.1.2 Enzym AChE chất ức chế enzym AChE .4 1.1.3 Q trình oxy hóa thể chất chống oxy hóa ed ic ine 1.2 Các phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa tác dụng ức chế enzym AChE in vitro 1.2.1 Các phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro 1.2.2 Các phương pháp thường dùng nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế M enzym Acetylcholinesterase in vitro 11 of 1.3 Tổng quan Bơ .13 ho ol 1.3.1 Nguồn gốc, phân boại .13 1.3.2 Đặc điểm thực vật 15 Sc 1.3.3 Thành phần hóa học 15 1.3.4 Tác dụng công dụng 18 @ CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 ht 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị .20 rig 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20 py 2.1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu .20 Co 2.1.3 Hóa chất, dung môi 20 2.1.4 Thiết bị, dụng cụ .21 2.2 Nội dung nghiên cứu 21 VN U 2.3 Phương pháp nghiên cứu .22 2.3.1 Phương pháp chiết xuất 22 2.3.2 Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa .22 ac y, 2.3.3 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE 23 2.3.4 Phương pháp đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym AChE 26 dP rm 2.4 Phương pháp xử lí số liệu 27 CHƯƠNG KẾT QUẢ 28 3.1 Chiết xuất phân đoạn dịch chiết 28 an 3.2 Kết đánh giá hoạt tính cao chiết phần Bơ .29 3.2.1 Kết đánh giá tác dụng chống oxy hóa theo phương pháp DPPH .29 ine 3.2.2 Kết đánh giá khả ức chế enzym AChE 30 ed ic 3.3 Kết đánh giá hoạt tính cao chiết phân đoạn hạt Bơ .32 3.3.1 Kết đánh giá tác dụng chống oxy hóa theo phương pháp DPPH .32 M 3.3.2 Kết đánh giá khả ức chế enzym AChE 34 of 3.3.3 Kết xác định động học ức chế enzym AChE 35 CHƯƠNG BÀN LUẬN 37 ho ol 4.1 Về kết sàng lọc tác dụng chống oxy hóa ức chế enzym AChE dịch chiết Bơ 37 Sc 4.2 Về kết đánh giá tác dụng chống oxy hóa ức chế enzym AChE phân đoạn dịch chiết phận có tác dụng mạnh 38 ht @ CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41 Co py rig TÀI LIỆU THAM KHẢO MỞ ĐẦU VN U Bệnh Alzheimer bệnh thối hóa thần kinh tiến triển liên quan đến tuổi, làm suy yếu khả nhớ nhận thức [34] Theo Tổ chức Y tế Thế giới năm 2017, 44 triệu người giới bị trí nhớ chiếm tới 60-70% ac y, bệnh nhân Alzheimer [23] Bệnh lý học Alzheimer chưa làm sáng tỏ nhà khoa học cho bệnh nhân Alzheimer có kết dP rm hợp yếu tố di truyền môi trường gây Vì việc hiểu biết chế bệnh cần làm sáng rõ chìa khóa để phát triển thuốc điều trị bệnh Các nghiên cứu cho thấy thiếu hụt chất dẫn truyền thần kinh gây suy giảm nhận thức trí nhớ bệnh nhân Alzheimer [55] Acetylcholinesterase (AChE) enzym có tác dụng thủy phân chất dẫn truyền ed ic ine an thần kinh acetylcholine Một số phương pháp điều trị khác có mục tiêu tăng cường dẫn truyền cholinergic cách tăng lượng tiền chất ACh, ngăn chặn trình thủy phân chất ức chế AChE, kích thích thụ thể nicotinic muscarinic sử dụng chất có tác dụng tương tự cholinergic [61] Bởi vậy, chất ức chế enzym AChE đóng vai trò quan trọng việc điều trị bệnh @ Sc ho ol of M Alzheimer Mặt khác, gia tăng mức gốc tự thể gây tượng “stress oxy hóa” cho nguyên nhân gây bệnh mạn tính thối hóa bệnh Alzheimer Parkinson Tuy nhiên chất ức chế enzym AChE physostigmine, galantamine, tacrine, donepezil, metrifonate, lại không mang lại hiệu cao gây nhiều tác dụng không mong muốn như: buồn nôn, nôn, đau bụng tiêu chảy, khó tiêu, phát ban [44] Physostigmin chất ức chế AChE dùng cho nghiên cứu điều trị bệnh Alzheimer, bị thu hồi khỏi thị trường số tác dụng không mong muốn Tacrine gây độc gan thử nghiệm lâm sàng [62] Ngồi ra, thuốc thuộc nhóm chống oxy hóa vitamin E, Ginkgo biloba… sử dụng để điều trị tổn thương liên quan đến nhận thức bệnh nhân Alzheimer py rig ht có nguồn gốc từ tự nhiên Vì vậy, việc nghiên cứu dược liệu vừa có hoạt tính chống oxy hóa vừa có khả ức chế enzym AChE để phòng điều trị bệnh Alzeimer hướng nghiên cứu thu hút quan tâm nhiều nhà nghiên cứu giới Co Bơ có tên khoa học Persea americana Mill (Lauraceae), loại cận nhiệt đới có nguồn gốc từ Mexico Trung Mỹ Nghiên cứu cho thấy Bơ có chứa hợp chất peptone, b-galactoside, acid glycosylated abscisic, alkaloids, cellulose, polygalacto urease, polyuronoids, cytochrome P450,…[48, 64] Bơ VN U sử dụng cho điều trị số bệnh lở loét, tăng huyết áp, đau bụng, viêm phế quản [15], tiêu chảy tiểu đường [22] Ngồi ra, Bơ có hàm lượng kali cao natri, giúp điều chỉnh cân điện giải áp lực máu thể, giúp ổn định huyết áp [32] Các hợp chất béo omega-3, carotenoid vitamin làm cho dP rm ac y, Bơ có tác dụng chống viêm [15] Lá Bơ có tác dụng hạ glucose huyết hạ cholesterol toàn phần LDL, có tác dụng phòng ngừa xơ vữa động mạch [28] Hơn nữa, Bơ có tác dụng hệ thần kinh chống co giật [53], ức chế enzym AChE butyrylcholinesterase tác dụng chống oxy hóa [51] Tác dụng ngăn ngừa điều trị bệnh dược liệu ngày thu hút ý nhà nghiên cứu để tìm sản phẩm tự nhiên tiềm dùng làm thuốc để chống lại bệnh Alzheimer Tuy nhiên, qua tìm hiểu Việt Nam chưa có nghiên ine an cứu đánh giá tác dụng ức chế AChE chống oxy hóa DPPH Bơ trồng Việt Nam để định hướng phát triển thành sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer Vì vậy, đề xuất tiến hành đề tài: “Đánh giá tác ed ic dụng ức chế enzym acetylcholinesterase tác dụng chống oxy hóa dịch chiết Bơ (Persea americana Mill.)” với mục tiêu: Mục tiêu 1: Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa ức chế enzym AChE M phận Bơ (Persea americana Mill.) Co py rig ht @ Sc ho ol of Mục tiêu 2: Đánh giá tác dụng chống oxy hóa ức chế enzym AChE phân đoạn dịch chiết phận có tác dụng mạnh VN U ac y, dP rm an ine ed ic Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn khả chống oxy hóa phân đoạn hạt Bơ of M Giá trị IC50 phân đoạn hạt Bơ acid ascorbic tính dựa vào phương trình đồ thị nồng độ mẫu thử phần trăm ức chế biểu diễn hình 3.4 hình 3.6 Kết thể bảng 3.3 n-hexan Sc Mẫu thử ho ol Bảng 3.3 Giá trị IC50 phân đoạn từ hạt Bơ acid ascorbic khả quét gốc tự DPPH n-BuOH @ IC50 EtOAc 78,47 ± 1,05 59,51 ± 1,61 15,73 ± 0,42 87,63 ± 0,26 ht (µg/ml) EtOH Acid ascorbic 4,84 ± 0,35 Co py rig Từ bảng 3.3 cho thấy phân đoạn dịch chiết n-BuOH có tác dụng chống oxy hóa cao với IC50 15,73 ± 0,42 µg/ml Tiếp theo phân đoạn khác có tác dụng thấp phân đoạn EtOAc n-hexan với giá trị IC50 59,51 ± 1,61 µg/ml 78,47 ± 1,05 µg/ml, phân đoạn EtOH có tác dụng chống oxy hóa thấp phân đoạn với IC50 87,63 ± 0,26 µg/ml Song song với 33 mẫu thử, tiến hành tương tự với mẫu chứng acid ascorbic ta thu giá trị IC50 VN U 4,84 ± 0,35 µg/ml 3.3.2 Kết đánh giá khả ức chế enzym AChE Khả ức chế enzym AChE mẫu thử phân đoạn dịch chiết ho ol of M ed ic ine an dP rm ac y, nồng độ khác hạt Bơ trình bày hình 3.7 bảng 3.4 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn khả ức chế enzym AChE phân đoạn dịch chiết hạt Bơ @ Sc Giá trị IC50 phân đoạn hạt Bơ tính dựa vào phương trình đồ thị nồng độ mẫu thử phần trăm ức chế biểu diễn hình 3.7 Kết thể bảng 3.4 rig ht Bảng 3.4 Giá trị IC50 phân đoạn dịch chiết từ hạt Bơ chất chuẩn Donezepil khả ức chế enzym AChE Co py Mẫu thử IC50 (µg/ml) n-hexan EtOAc n-BuOH EtOH 52,19 ± 1,10 99,94 ± 3,23 15,24 ± 0,52 92,24 ± 0,88 34 Donepezil 0,41 ± 0,12 Từ bảng 3.4 cho thấy phân đoạn dịch chiết n-BuOH cho thấy có tác dụng ức VN U chế enzym AChE cao với IC50 15,24 ± 0,52 µg/ml, so với phân đoạn đoạn với IC50 99,94 ± 3,23 µg/ml 3.3.3 Kết xác định động học ức chế enzym AChE ac y, khác có tác dụng ức chế enzym AChE thấp phân đoạn n-hexan với giá trị IC50 52,19 ± 1,10 µg/ml, phân đoạn EtOH với giá trị IC50 92,24 ± 0,88 µg/ml phân đoạn EtOAc có tác dụng ức chế enzym AChE thấp phân dP rm Phân đoạn n-BuOH có tác dụng ức chế enzym AChE cao nên phân đoạn lựa chọn sử dụng để xác định động học ức chế enzym AChE Phương pháp xác định động học ức chế enzym dựa thay đổi nồng độ chất ATCI nồng độ dung dịch thử n-BuOH Do giá trị IC50 phân đoạn dịch chiết n- an BuOH 15,24 ± 0,52 µg/ml nên ta tiến hành đo nồng độ gần sát giá trị IC50 0; 7,5; 15 30 µg/ml ine Kết đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym AChE ed ic Động học ức chế enzym AChE mô tả đồ thị Lineweaver-Burk, xây dựng từ đồ thị biểu diễn mối tương quan giá trị độ hấp thụ quang với thời gian phản ứng chất ATCI nồng độ khác Tác dụng ức chế enzym AChE phân đoạn dịch chiết n-BuOH hạt Bơ thể Co py rig ht @ Sc ho ol of M hình 3.8 (Đồ thị Lineweaver-Burk plot) Từ đồ thị Lineweaver-Burk ta xác định kiểu ức chế enzym AchE phân đoạn dịch chiết n-BuOH ức chế hỗn hợp [11, 74] Hình 3.8 Đồ thị Lineweaver – Burk cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH hạt Bơ 35 Đồ thị động học Dixon phân đoạn dịch chiết n-BuOH xây dựng VN U dựa đồ thị biểu diễn mối tương quan giá trị độ hấp thụ quang với thời gian ed ic ine an dP rm ac y, phản ứng phân đoạn dịch chiết n-BuOH nồng độ 0; 7,5; 15; 30 µg/mL hình 3.9 Hình 3.9 Đồ thị Dixon cho phân đoạn dịch chiết n-BuOH hạt Bơ để xác định số ức chế Ki Co py rig ht @ Sc ho ol of M Hằng số Ki xác định giá trị tuyệt đối từ điểm giao trục Ox đường Từ hình 3.9 ta thấy giá trị Ki xác định theo đồ thị 9,07 ± 0,21 µg/ml 36 CHƯƠNG BÀN LUẬN Về kết sàng lọc tác dụng chống oxy hóa ức chế enzym AChE dịch chiết Bơ VN U 4.1 Theo nghiên cứu bệnh học Alzheimer trình oxy hóa kéo dài ac y, đặc điểm điển hình bệnh với đặc điểm lượng peroxid hóa lipid, oxy hóa protein oxy hóa ADN tăng cao não [6] Các nghiên cứu ngun nhân q trình oxy hóa chủ yếu protein beta – amyloid gây dP rm tế bào thần kinh nên phương hướng tiếp cận điều trị sử dụng liệu pháp chống oxy hóa Phương pháp DPPH phương pháp sử dụng rộng rãi mơ hình nghiên cứu đánh giá khả chống oxy hóa chất q trình nghiên cứu phát triển thuốc [1] Vì nghiên cứu an sử dụng phương pháp DPPH để đánh giá tác dụng chống oxy hóa mẫu thử Chất đối chứng sử dụng acid ascorbic thu giá trị IC50 acid ascobic 4,84 ± 0,35 µg/ml tương đồng với nghiên cứu ed ic ine trước [67, 77] cho thấy phương pháp thử nghiệm phù hợp kết thu có ý nghĩa Kết nghiên cứu cho thấy cao chiết từ phần Bơ có tác dụng quét gốc tự DPPH nồng độ biến thiên of M khả quét gốc tự biến thiên theo Trong đó, cao chiết từ hạt Bơ cho tác dụng tốt so với phận lại với IC50 68,70 ± 0,35 µg/ml Điều chứng tỏ, cao chiết hạt Bơ chứa nhiều chất có khả quét @ Sc ho ol gốc tự DPPH phần khác phenol, sterol, flavonoid Kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu trước tác giả Maha I Alkhalf tiến hành nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa hạt Bơ có tác dụng chống oxy hóa tốt thịt Bơ [19] Hạt Bơ tác giả Gómez nghiên cứu để sử dụng làm chất chống oxy hóa thực phẩm [73] Một số nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa dịch chiết hạt Bơ [66, 72] Co py rig ht Bên cạnh liệu pháp chống oxy hóa hướng điều trị tiến hành nghiên cứu điều trị bệnh Alzheimer nghiên cứu chất ức chế enzym AChE – xúc tác trình thủy phân chất dẫn truyền ACh mà theo nghiên cứu nồng độ chất dẫn truyền ACh giảm trầm trọng bệnh nhân Alzheimer gây suy giảm khả nhận thức người bệnh [6, 10] Với nhiều ưu điểm phương pháp khác, phương pháp đo quang Ellman sử dụng để đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE mẫu thử với số thay đổi cho phù hợp với điều kiện 37 nghiên cứu Chúng sử dụng chất đối chứng Donepezil VN U thuốc FDA chấp thuận sử dụng cho bệnh nhân bị Alzheimer thông qua chế ức chế AChE [75] Bên cạnh sử dụng phổ biến làm chất đối chứng thử nghiệm đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE [71, 76] Kết thu Donezepil thể khả ức chế AChE rõ rệt với giá trị IC50 dP rm ac y, 0,41 ± 0,12 µg/ml tương đồng với nghiên cứu trước Fernandes cộng hay Ahmad Mohammadi-Farani cộng [71, 76] Vì phương pháp chất đối chứng lựa chọn phù hợp với thí nghiệm Bằng phương pháp Ellman nghiên cứu thấy phần Bơ có tác dụng ức chế enzym AChE theo cách thức phụ thuộc vào nồng độ chất thử, nghĩa tác dụng ức chế tăng dần theo nồng độ thử Cao chiết hạt Bơ cho thấy khả ức chế cao với IC50 47,43 ± 0,5 µg/ml hạt Bơ ed ic enzym AChE chống oxy hóa [78] ine an chứa hàm lượng cao chất có khả ức chế enzym AChE phenolic, saponin, alkanoid, terpenoid Kết tương đồng với nghiên cứu trước Oboh cộng kết luận dịch chiết hạt Bơ có tác dụng ức chế Như vậy, với việc kết thu từ việc đánh giá tác dụng chống oxy hóa tác dụng ức chế enzym AChE ta sàng lọc mẫu thử từ Bơ Về kết đánh giá tác dụng chống oxy hóa ức chế enzym AChE phân đoạn dịch chiết phận có tác dụng mạnh Sc 4.2 ho ol of M phần Bơ cao chiết hạt Bơ cho tác dụng tốt Tuy nhiên, không nên tự ý sử dụng hạt Bơ hạt Bơ chứa nhiều thành phần gây độc tác dụng không mong muốn hợp chất tanin, alkanoid, flavonoid Do đó, cần nghiên cứu tách chiết chất có tác dụng dược lý để an toàn hiệu sử dụng @ Từ kết trên, tiến hành đánh giá khả chống oxy hóa ức chế enzym AChE phân đoạn dịch chiết hạt Bơ bao gồm phân rig ht đoạn: n-hexan, EtOAc, n-BuOH EtOH Chúng tiếp tục sử dụng phương pháp DPPH, phương pháp thuốc thử Ellman chất đối chứng chọn để đánh giá tác dụng phân đoạn thu Co py Kết đánh giá tác dụng chống oxy hóa cho thấy phân đoạn n-BuOH cao chiết hạt Bơ có tác dụng tối với IC50 15,73 ± 0,42 µg/ml gấp gần bốn lần so với chất đối chứng acid ascorbic có giá trị IC50 4,84 ± 0,35 µg/ml Như 38 chất có hoạt tính chống oxy hóa chủ yếu nằm phân đoạn n-BuOH VN U có hoạt tính mạnh Kết đánh giá khả ức chế enzym AChE phân đoạn hạt Bơ cho thấy phân đoạn n-BuOH có tác dụng tốt với IC50 = 15,24 ± 0,52 µg/ml Tiếp theo phân đoạn n-hexan với IC50 = 52,19 ± 1,10 µg/ml, phân dP rm ac y, đoạn EtOH với IC50 = 92,24 ± 0,88 µg/ml vỏ Bơ IC50 = 99,94 ± 3,23 µg/ml Từ cho thấy, chất có tác dụng ức chế enzym AChE tập trung nhiều phân đoạn dịch chiết n-BuOH hạt Bơ Phân đoạn n-BuOH dịch chiết hạt Bơ có tác dụng ức chế enzym AChE chống oxy hóa cao phân đoạn giải thích BuOH dung mơi phân cực nên hợp chất phenol, flavonois… tan chủ yếu dung môi Kết tác dụng ức chế enzym AChE chống oxy hóa tác ine an dụng hiệp đồng hợp chất phân đoạn dịch chiết Hướng nghiên cứu nên tập trung vào phân lập, xác định hợp chất làm sáng tỏ chế tác dụng hợp chất ed ic Với kết thu được, phân đoạn n-BuOH hạt Bơ đánh giá tốt so với dịch chiết lại, đồng thời dộng học ức chế enzym AChE dịch chiết hạt Bơ chưa công bố trước nên tiến hành @ Sc ho ol of M nghiên cứu để đánh giá động học ức chế enzym phân đoạn Đồ thị động học Lineweaver–Burk có tính chất trung gian kiểu ức chế cạnh tranh không cạnh tranh, cho thấy kiểu ức chế phân đoạn dịch chiết n-BuOH kiểu ức chế hỗn hợp (trong đồ thị Lineweaver–Burk hệ số góc =Km/Vmax, điểm giao trục Ox = -1/Km) Đồ thị động học Dixon có tính chất đặc trưng chất ức chế cạnh tranh Hằng số ức chế Ki xác định giá trị tuyệt đối từ điểm giao đường trục Ox đồ thị Dixon, vẽ theo 1/(tốc độ phản ứng) theo nồng độ phân đoạn dịch chiết n-BuOH Giá trị Ki xác định theo đồ thị Dixon 9,07 ± 0,21 µg/ml Ki số ức chế enzym cho phép đánh giá độ mạnh yếu chất ức chế, Co py rig ht gọi số phân ly phức hợp enzym – chất ức chế Nếu số Ki nhỏ, chất ức chế bị liên kết chặt với enzym nên lượng enzym hoạt động nhỏ, tác dụng ức chế mạnh Phân đoạn n-BuOH dịch chiết hạt Bơ có giá trị số Ki nhỏ chứng tỏ có tác dụng ức chế enzym AChE mạnh Kiểu ức chế hỗn hợp kiểu ức chế đặc trưng dược liệu, nguyên nhân thành phần dịch chiết có chứa loạt hợp chất có nhiều chế tác dụng khác Cơ chế ức chế cho thấy hợp chất có hoạt tính phân đoạn dịch chiết n-BuOH cạnh 39 tranh với ATCI để gắn vào trung tâm hoạt động – vị trí liên kết với chất VN U enzym AChE kết hợp với enzym AChE kết hợp với phức hợp AChEATCI Như vậy, từ nghiên cứu cho thấy Bơ, vỏ, thịt hạt Bơ có tác dụng chống oxy hóa ức chế ẠChE mức độ khác Trong hạt Bơ dP rm ac y, đánh giá có tác dụng tốt Những kết đầy hứa hẹn góp phần giá trị phận thải có giá trị đáng quan tâm Tuy nhiên nghiên cứu này, chúng tơi khơng khuyến khích nên sử dụng hạt Bơ thực phẩm chăm sóc sức khỏe chưa có nghiên cứu cụ thể lượng dùng tác dụng phụ hạt Bơ gây Do đó, cần tiếp tục nghiên cứu sâu để phân lập, xác định hợp chất có hoạt tính cụ thể làm sáng tỏ chế tác dụng hợp chất Mặc dù kết nghiên cứu chưa hoạt chất cụ thể chế tác dụng hợp ine an chất góp phần bổ sung cho sở liệu chất có tác dụng chống oxy hóa ức chế AChE nói chung đồng thời cho nghiên cứu tìm kiếm hợp chất Bơ Bơ có tác dụng hỗ trợ phòng Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ic điều trị bệnh Alzheimer 40 VN U CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN ac y, Về sàng lọc tác dụng chống oxy hóa ức chế enzym AChE phận Bơ (Persea americana Mill.) ✓ Đã sàng lọc tác dụng chống oxy hóa phận Bơ phương dP rm pháp đánh giá khả quét gốc tự DPPH, thu hạt Bơ có tác dụng tốt (IC50 = 68,70 ± 0,35 µg/ml), sau đến lá, vỏ thịt ✓ Đã sàng lọc khả ức chế enzym AChE phận Bơ phương pháp đo quang Ellman, thu hạt Bơ có tác dụng tốt ( với an IC50 = 47,43 ± 0,50 µg/ml), sau đến lá, thịt vỏ Về đánh giá tác dụng chống oxy hóa ức chế enzym AChE phân đoạn dịch chiết phận có tác dụng mạnh ✓ Đã đánh giá tác dụng chống oxy hóa phân đoạn dịch chiết từ hạt Bơ thu phân đoạn n-BuOH có tác dụng tốt (IC50 = 15,73 ± 0,42 ed ic ine µg/ml), sau đến phân đoạn EtOAc, n-hexan EtOH ✓ Đánh giá khả ức chế enzym AChE phân đoạn dịch chiết từ hạt Bơ thu phân đoạn n-BuOH có tác dụng tốt (IC50 = 15,24 ± 0,52 µg/ml), sau đến phân đoạn n-hexan, EtOH EtOAc M ✓ Đã đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym AChE phân đoạn dịch of chiết n-BuOH hạt Bơ kiểu ức chế hỗn hợp với số Ki tìm 9,07 ± 0,21 µg/ml ho ol ĐỀ XUẤT Co py rig ht @ Sc Tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học hạt Bơ Tiến hành nghiên cứu sâu để tinh chế hợp chất tinh khiết phân đoạn dịch chiết hạt Bơ có tiềm phòng, điều trị bệnh liên quan đến Alzheimer rối loạn thần kinh để phục vụ cho nghiên cứu khoa học ứng dụng lâm sàng Tiếp tục đánh giá tác dụng ức chế AChE dịch chiết hạt Bơ in vivo nghiên cứu lâm sàng 41 VN U TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đàm Trung Bảo (2001), "Các gốc tự do", Tạp chí Dược học, 6, 29 - 30 Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam TS Trương Thị Đẹp (2011), Thực vật Dược, Bộ Y Tế Nguyễn Văn Đoàn (2016), "Phát triển bền vững bơ địa bàn huyện Krông Ana tỉnh Đắk Lắk" Võ Tấn Hậu (2008), "Nghiên cứu công nghệ sản xuất dầu béo bột bơ loại béo từ trái bơ (Avocado)", Viện công nghệ thực phẩm - Bộ công thương Phạm Khuê (2002), Bệnh Alzheimer, Nhà xuất Y học Lê Thị Tuyết Ngân (2012), "Nghiên cứu xác định thành phần hóa học có số dịch chiết hạt Bơ Đăk Lăk ", Luận văn thạc sĩ khoa học, Đại học Đà Nẵng, Đà Nẵng Đào Văn Phan, Nguyễn Trần Giáng Hương, and Nguyễn Trọng Thông (2011),Dược lý học NXB Giáo dục Việt Nam Lê Thành Phước (2016), "Chất chống oxy hóa nguyên tố vi lượng thiết yếu", Tài liệu chuyên đề D5K66 10 Phan Kế Sơn (2017), "Đánh giá tác dụng ức chế enzym Acetylcholinsterase in vitro phân đoạn dịch chiết Hoàng Liên Ơ rơ (Mahonia Nepalensis DC., họ Berberidaceae)", Khóa luận tốt nghiệp Đại học ngành Dược học, Khoa Y Dược - Đại học Quốc Gia Hà Nội 11 Nguyễn Xuân Thắng (2007), Hóa sinh học, Nhà xuất Y học 12 Huỳnh Như Thủy Tiên (2008), "Tìm hiểu trái bơ sản xuất thử nghiệm số sản phẩm từ phần nạc trái bơ", Đại học Kĩ thuật công nghiệp TP.HCM 13 Viện Dược Liệu (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý thuốc từ thảo dược, Hà Nội, NXB Khoa học kỹ thuật Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ic ine an dP rm ac y, Tiếng Anh Adewusi, E.A and V Steenkamp (2011), "In vitro screening for acetylcholinesterase inhibition and antioxidant activity of medicinal plants from southern Africa", Asian Pacific journal of tropical medicine, 4(10), 829-835 15 Adeyemi, O., S Okpo, and O Ogunti, (2002), Analgesic and antiinflammatory effects of the aqueous extract of leaves of Persea americana Mill (Lauraceae) 375-380 16 Adsersen, A., et al (2006), "Screening of plants used in Danish folk medicine to treat memory dysfunction for acetylcholinesterase inhibitory activity", Journal of ethnopharmacology, 104(3), 418-422 17 Alam, M.N., N.J Bristi, and M Rafiquzzaman (2013), "Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity", Saudi Pharm J, 21(2), 143-52 doi:10.1016/j.jsps.2012.05.002 18 Alam, M.N., N.J Bristi, and M Rafiquzzaman (2013), "Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity", Saudi Pharmaceutical Journal, 21(2), 143-152 19 Alkhalf, M.I., et al (2018), "Anti-oxidant, anti-inflammatory and anti-cancer activities of avocado (Persea americana) fruit and seed extract", Journal of King Saud University-Science 20 Alzheimer's, A (2012), "2012 Alzheimer's disease facts and figures", Alzheimers Dement, 8(2), 131-68 doi:10.1016/j.jalz.2012.02.001 21 Ansari, N.a.F.K (2013),Natural products as promising drug candidates for the treatment of Alzheimer’s disease: molecular mechanism aspect 414429 22 Antia, B., J Okokon, and P Okon (2005), "Hypoglycemic activity of aqueous leaf extract of Persea americana Mill", Indian journal of pharmacology, 37(5), 325 23 Association, A.s (2017),Alzheimer's disease facts and figures 325-373 24 Athaydes, B.R., et al (2019), "Avocado seeds (Persea americana Mill.) prevents indomethacin-induced gastric ulcer in mice", Food Research International, 119, 751-760 25 Barril, X., M Orozco, and F.J Luque (2001), "Towards improved acetylcholinesterase inhibitors: a structural and computational approach", Mini Rev Med Chem, 1(3), 255-66 rig ht @ Sc ho ol of M ed ic ine an dP rm ac y, VN U 14 py 26 Co 27 Battle, D.E (2013), "Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM)", Codas, 25(2), 191-2 Brai, B., A Odetola, and P Agomo (2007), "Effects of Persea americana leaf extracts on body weight and liver lipids in rats fed hyperlipidaemic diet", African journal of Biotechnology, 6(8) Brai, B.I., A Odetola, and P Agomo, (2007), "Hypoglycemic and hypocholesterolemic potential of Persea americana leaf extracts", Journal of medicinal food, 10(2), 356-360 29 Carocho, M and I.C Ferreira (2013), "A review on antioxidants, prooxidants and related controversy: natural and synthetic compounds, screening and analysis methodologies and future perspectives", Food and chemical toxicology, 51, 15-25 30 Carr, A.C and B Frei (1999), "Toward a new recommended dietary allowance for vitamin C based on antioxidant and health effects in humans", Am J Clin Nutr, 69(6), 1086-107 doi:10.1093/ajcn/69.6.1086 31 Di Giovanni, S., et al (2008), "In vitro screening assays to identify natural or synthetic acetylcholinesterase inhibitors: thin layer chromatography versus microplate methods", Eur J Pharm Sci, 33(2), 109-19 doi:10.1016/j.ejps.2007.10.004 32 Dzeufiet, P.D.D., et al (2014), Antihypertensive potential of the aqueous extract which combine leaf of Persea americana Mill.(Lauraceae), stems and leaf of Cymbopogon citratus (DC) Stapf.(Poaceae), fruits of Citrus medical L.(Rutaceae) as well as honey in ethanol and sucrose experimental model 507 33 Ellman, G.L., et al (1961), "A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity", Biochemical pharmacology, 7(2), 88-95 34 Essa, M.M., et al (2012), "Neuroprotective effect of natural products against Alzheimer's disease", Neurochem Res, 37(9), 1829-42 35 Ezio Giacobini (2000), Cholinesterase and cholinesterase inhibitors, London 36 Grossberg, G.T (2003), "Cholinesterase inhibitors for the treatment of Alzheimer's disease:: getting on and staying on", Curr Ther Res Clin Exp, 64(4), 216-35 doi:10.1016/S0011-393X(03)00059-6 37 Halliwell, B (1994), "Free radicals, antioxidants, and human disease: curiosity, cause, or consequence?", Lancet, 344(8924), 721-4 38 Heim, K.E., A.R Tagliaferro, and D.J Bobilya (2002), "Flavonoid antioxidants: chemistry, metabolism and structure-activity relationships", The Journal of nutritional biochemistry, 13(10), 572-584 ht @ Sc ho ol of M ed ic ine an dP rm ac y, VN U 28 Houghton, P.J., Y Ren, and M.J Howes (2006), "Acetylcholinesterase inhibitors from plants and fungi", Nat Prod Rep, 23(2), 181-99 doi:10.1039/b508966m rig 39 Co py 40 Howes, M.J.R., N.S Perry, and P.J (2003), Houghton, Plants with traditional uses and activities, relevant to the management of Alzheimer's disease and other cognitive disorders 1-18 Liu, W (2012), Introduction to modeling biological cellular control systems, (6), Springer Science & Business Media 42 López-Alarcón, C and A Denicola (2013), "Evaluating the antioxidant capacity of natural products: A review on chemical and cellular-based assays", Analytica chimica acta, 763, 1-10 43 Marston, A (2011), "Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry", J Chromatogr A, 1218(19), 2676-83 doi:10.1016/j.chroma.2010.12.068 44 McGleenon, B., K Dynan, and A Passmore (1999), "Acetylcholinesterase inhibitors in Alzheimer's disease", British journal of clinical pharmacology, 48, 471-480 45 Mikiciuk-Olasik, E., P Szymański, and E Żurek (2007), "Diagnostics and therapy of Alzheimer’s disease", Indian Journal of Experimental Biology, 45, 325 46 Min, B.S., et al (2010), "Cholinesterase inhibitors from Cleistocalyx operculatus buds", Archives of pharmacal research, 33(10), 1665-1670 47 Molyneux and Philip (2004), "The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity", Songklanakarin J Sci Technol, 26(2), 211-219 48 Moreno, A.O., et al (2003), "Effect of different extraction methods on fatty acids, volatile compounds, and physical and chemical properties of avocado (Persea americana Mill.) oil", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51(8), 2216-2221 49 Musicco, M., et al (2013), "Inverse occurrence of cancer and Alzheimer disease: a population-based incidence study", Neurology, 81(4), 322-8 doi:10.1212/WNL.0b013e31829c5ec1 50 Nguyen, Q.-V and J.-B Eun (2011), "Antioxidant activity of solvent extracts from Vietnamese medicinal plants", Journal of Medicinal Plants Research, 5(13), 2798-2811 51 Oboh, G., et al (2016), "Aqueous extracts of avocado pear (Persea americana Mill.) leaves and seeds exhibit anti-cholinesterases and antioxidant activities in vitro", Journal of basic and clinical physiology and pharmacology, 27(2), 131-140 ht @ Sc ho ol of M ed ic ine an dP rm ac y, VN U 41 Ojewole, J.A and G.J Amabeoku (2006), "Anticonvulsant effect of Persea americana Mill (Lauraceae) (Avocado) leaf aqueous extract in mice", Phytother Res, 20(8), 696-700 doi:10.1002/ptr.1940 rig 52 Co py 53 Ojewole, J.A.a.G.J.A (2006), "Anticonvulsant effect of Persea americana Mill (Lauraceae)(Avocado) leaf aqueous extract in mice", Phytotherapy Research: An International Journal Devoted to Pharmacological and Toxicological Evaluation of Natural Product Derivatives, 20(8), 696-700 Olushola, A.I., et al (2017), "Biochemical Effects of Aqueous Extract of Persea americana (Mill) on the Myocardium of Left Ventricle of High Salt– Fed Adult Wistar Rats", Journal of Evidence-Based Complementary & Alternative Medicine, 22(4), 765-769 55 Pappas, B.A., et al (2000), "Choline acetyltransferase activity and cognitive domain scores of Alzheimer’s patients", Neurobiology of aging, 21(1), 1117 56 Peng, L., et al (2017), "A novel assay to determine acetylcholinesterase activity: The application potential for screening of drugs against Alzheimer's disease", Biomed Chromatogr, 31(10) doi:10.1002/bmc.3971 57 Pohanka, M (2011), "Cholinesterases, a target of pharmacology and toxicology", Biomedical Papers of the Medical Faculty of Palacky University in Olomouc, 155(3), 219 -229 58 Schiff P L (1997), "Bisbenzylisoquinoline alkaloids", J Nat Prod, 60, 934 – 953 59 Selkoe, D.J (2001), "Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy", Physiological reviews, 81(2), 741-766 60 Tang, Z.M., Z.Y Wang, and J.W Kang (2007), "Screening of acetylcholinesterase inhibitors in natural extracts by CE with electrophoretically mediated microanalysis technique", Electrophoresis, 28(3), 360-5 doi:10.1002/elps.200600327 61 Upadhyaya, P., V Seth, and M Ahmad, (2010), "Therapy of Alzheimer’s disease: An update", Afr J Pharm Pharmacol, 4(6), 408-421 62 Watkins, P.B., et al., (1994),Hepatotoxic effects of tacrine administration in patients with Alzheimer's disease 992-998 63 Whitehouse, P.J., et al (1982), "Alzheimer's disease and senile dementia: loss of neurons in the basal forebrain", Science, 215(4537), 1237-1239 64 Yasir, M., S Das, and M Kharya, (2010), "The phytochemical and pharmacological profile of Persea americana Mill", Pharmacognosy reviews, 4(7), 77 65 Ziegler-Graham, K., Brookmeyer, R., Johnson, E., Arrighi, H.M (2008), "Worldwide variation in the doubling time of Alzheimer’s disease incidence rates", Alzheimers Dement, 4, 316–323 ht @ Sc ho ol of M ed ic ine an dP rm ac y, VN U 54 Alagbaoso, C.A., I.I Tokunbo, and O.S Osakwe (2017), "Comparative study of antioxidant activity and mineral composition of methanol extract of seeds of ripe and unripe avocado pear (Persea americana, Mill.)", NISEB Journal, 15(4) py rig 66 Co 67 Bao, Y., et al (2018), "In vitro and in vivo antioxidant activities of the flowers and leaves from Paeonia rockii and identification of their antioxidant VN U constituents by UHPLC-ESI-HRMSn via pre-column DPPH reaction", Molecules, 23(2), 392 Cowan, A and B Wolstenholme (2016), "Avocado" 69 De Matos, A.M., M.P de Macedo, and A.P Rauter (2018), "Bridging type diabetes and Alzheimer's disease: assembling the puzzle pieces in the quest for the molecules with therapeutic and preventive potential", Medicinal research reviews, 38(1), 261-324 70 Di Domenico, F., et al (2015), "Strategy to reduce free radical species in Alzheimer’s disease: an update of selected antioxidants", Expert review of neurotherapeutics, 15(1), 19-40 71 Fernandes, T.B., et al (2017), "Synthesis, Molecular Modeling, and Evaluation of Novel Sulfonylhydrazones as Acetylcholinesterase Inhibitors for Alzheimer's Disease", Archiv der Pharmazie, 350(11), 1700163 72 Folasade, O.A., R.A Olaide, and T.A Olufemi (2016), "Antioxidant properties of Persea americana M seed as affected by different extraction solvent", Journal of Advances in Food Science & Technology, 3(2), 101-106 73 Gómez, F., et al (2014), "Avocado seeds: extraction optimization and possible use as antioxidant in food", Antioxidants, 3(2), 439-454 74 Mills, S and K Bone (2000), Principles and practice of phytotherapy Modern herbal medicine, Churchill Livingstone 75 Mohammad, D., et al (2017), "Acetylcholinesterase inhibitors for treating dementia symptoms-a safety evaluation", Expert opinion on drug safety, 16(9), 1009-1019 76 Mohammadi-Farani, A., S.S Darbandi, and A Aliabadi (2016), "Synthesis and acetylcholinesterase inhibitory evaluation of 4-(1, 3-dioxoisoindolin-2yl)-N-phenyl benzamide derivatives as potential anti-alzheimer agents", Iranian journal of pharmaceutical research: IJPR, 15(3), 313 77 Mowsumi, F.R., et al (2015), "In vitro relative free radical scavenging effects of Calocybe indica (milky oyster) and Pleurotus djamor (pink oyster)", World J Pharm Pharm Sci., 4(07), 186-195 78 Oboh, G., et al (2016), "Aqueous extracts of avocado pear (Persea americana Mill.) leaves and seeds exhibit anti-cholinesterases and antioxidant activities in vitro", Journal of basic and clinical physiology and pharmacology, 27(2), 131-140 ht @ Sc ho ol of M ed ic ine an dP rm ac y, 68 Sies, H (2015), "Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine", Redox biology, 4, 180-183 Co py rig 79 ... tổng Bơ phần Bơ @ Sc • Đánh giá tác dụng chống oxy hóa ức chế enzym AChE cao chiết Bơ phần Bơ (vỏ, thịt hạt qu ) để chọn phần có tác dụng mạnh Nội dung 2: Đánh giá tác dụng chống oxy hóa ức chế enzym. .. ic dụng ức chế enzym acetylcholinesterase tác dụng chống oxy hóa dịch chiết Bơ (Persea americana Mill. ) với mục tiêu: Mục tiêu 1: Sàng lọc tác dụng chống oxy hóa ức chế enzym AChE M phận Bơ (Persea. .. THÚY ed ic ine ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM ACETYLCHOLINESTERASE VÀ TÁC DỤNG M CHỐNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT CÂY BƠ of (Persea americana Mill. ) ho ol KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Khóa: QH.2014.Y