ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ĐỖ VĂN HÀO NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDIUS SEEM) THU HÁI Ở SA PA, LÀO CAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ĐỖ VĂN HÀO NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDIUS SEEM) THU HÁI Ở SA PA, LÀO CAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: QH.2012 NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS NGUYỄN HỮU TÙNG Hà Nội – 2017 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực khóa luận tốt nghiệp, em nhận nhiều giúp đỡ, đóng góp ý kiến bảo tâm huyết, nhiệt tình thầy cơ, gia đình bạn bè Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tri ân đến TS Nguyễn Hữu Tùng, giảng viên Bộ mơn Hóa dược Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y Dược, người ln tận tình hướng dẫn, bảo em suốt q trình thực khóa luận Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Khoa Y Dược nói chung Bộ mơn Hóa dược Kiểm nghiệm thuốc nói riêng truyền đạt cho em tảng kiến thức chuyên môn tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình học tập Cuối em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè người thân ln quan tâm, động viên giúp em hồn thành khóa luận này.Dù cố gắng, lần đầu làm nghiên cứu em khó tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận ý kiến đóng góp thầy để khố luận thêm hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Sinh viên Đỗ Văn Hào DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ NMR 13C-NMR PĐ 1H-NMR SKLM C SVD DĐVN IV T ĐT TT HPLC UV IR VIS MS VIẾT TẮT : High Performance Liquid Chromatography : Carbon (13) Nuclear magnetic resonance : Proton nuclear magnetic resonance : Infrared : Mass spectrum : Nuclear magetic resonance : phân đoạn : sắc ký lớp mỏng : Chuẩn : Sâm vũ diệp : Dược điển Việt Nam IV : Thử : Định tính : thứ tự : Ultra violete : visible DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình vẽ, đồ thị Hình Hợp chất saponin khung oleanane từ rễ Hình Sắc ký đồ chất thơng số đặc tr Hình Mẫu sâm vũ diệp (Panaxbipinnatifidus Seem.) thu hái Sapa, Lào dvv Cai Hình Sắc ký đồ pha đảo cao tổng (T), phân đ D MeOH-H2O (1:1) MeOH-H2O (2:1) Hình Sắc ký đồ pha thường cao tổng (T), phân đoạn butanol (Bu) với f hệ CHCl3-MeOH-H2O (70:30:0,4) CHCl3-MeOH-H2O (60:30:0,5) Hình Sơ đồ chiết xuất Sâm vũ diệp Hình Sơ đồ phân lập sắc ký hợp chất từ Hình Cấu trúc hóa học hợp chất ph Hình Sắc ký đồ dung dịch chuẩn Oleano Hình 10 Sắc ký đồ dung dịch mẫu cao tổng DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Bảng Phân bố loài thuộc chi Panax L Bảng Một số Saponin dẫn chất acid oleanolic Bảng Saponin khung dammaran Bảng kết định tính nhóm chất hữu thường gặp rễ ffff H thân Sâm vũ diệp phản ứng hóa học MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chi Panax L .3 1.1.1 Vị trí phân loại phân bố chi Panax L 1.1.2 Đặc điểm họ Ngũ gia bì (Nhân sâm) (Araliaceae) 1.1.3 Đặc điểm thực vật chi Panax L 1.1.4 Đối tượng nghiên cứu-Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem) 1.2 Tổng quan phương pháp nghiên cứu .9 1.2.1 Phương pháp định tính thành phần hóa học 1.2.2 Các phương pháp sắc kí 12 1.2.3 Các phương pháp xác định cấu trúc 18 CHƯƠNG - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tượng nghiên cứu 21 2.2 Phương tiện nghiên cứu 21 2.2.1 Thiết bị dụng cụ 21 2.2.2 Dung mơi, hóa chất 22 2.3 Phương pháp nghiên cứu 22 2.3.1 Phương pháp phân tích định tính 22 2.3.2 Phương pháp xử lý chiết mẫu 23 2.3.3 Phương pháp phân lập tinh chế hợp chất hóa học .23 2.3.4 Phương pháp định cấu trúc hóa học hợp chất 23 2.3.5 Phương pháp phân tích định tính dấu vân tay sắc ký hợp chất sắc ký lỏng hiệu cao HPLC 23 CHƯƠNG - KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 24 3.1 Kết phân tích định tính nhóm chất Sâm vũ diệp 24 3.1.1 Kết phân tích định tính nhóm chất 24 3.1.2 Phân tích định tính saponin sắc ký lớp mỏng 25 3.2 Kết nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn etyl acetat 26 3.2.1 Chiết xuất tinh chế hợp chất 26 3.2.2 Tính chất vật lý số liệu phổ hợp chất phân lập 28 3.2.3 Biện giải cấu trúc chất phân lập 29 3.3 Phương pháp phân tích định tính dấu vân tay sắc ký hợp chất sắc ký lỏng hiệu cao HPLC 30 3.4 Bàn luận 33 3.4.1 Về phân tích định tính 33 3.4.2 Về xử lý chiết mẫu phân lập chất tinh khiết 33 3.4.3 Về xác định hợp chất phân lập 33 3.4.4 Về định tính dấu vân tay sắc ký Oleanolic acid sắc ký lỏng hiệu cao HPLC 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 KẾT LUẬN 35 KIẾN NGHỊ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 PHỤ LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện xu hướng điều trị thuốc có nguồn gốc thiên nhiên đặc biết từ cỏ ngày tăng Trước xu hướng đó, người ngày trọng vào việc nghiên cứu, tìm kiếm, khai thác nguồn tài nguyên Việt Nam vùng đất nhiều lồi thảo dược q, có thuốc dân gian sử dụng từ hàng ngàn năm loại nhân sâm, tam thất Tuy nhiên, thảo dược từ bao đời sử dụng trực tiếp chế biến thành nguyên liệu thô, chưa phát huy hết cơng dụng Một số phải kể đến sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem, họ Nhân sâm-Araliaceae), thuộc chi Panax L Trong tự nhiên, sâm vũ diệp phân bố Trung Quốc dãy núi Hoàng Liên Sơn Tây Bắc nước ta Gần sâm vũ diệp hóa bước đầu trồng thử nghiệm số địa phương Hà Giang Lào Cai Theo kinh nghiệm dân gian, sâm vũ diệp lồi sâm q có nhiều tác dụng sinh học, nhiên đến chưa có nhiều tài liệu cụ thể nghiên cứu thành phần hóa học chế tác dụng sinh học sâm vũ diệp Việc xây dựng liệu thành phần hóa học có vai trò quan trọng làm sở cho nghiên cứu liên quan phân loại thực vật học, tiêu chuẩn hóa dược liệu, tác dụng sinh học Vì vậy, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidius Seem) thu hái Tây Bắc” Đề tài phần đề tài cấp “Ứng dụng giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu tạo sản phẩm từ hai loài Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.)” Khoa Y Dược Đại Học Quốc Gia Hà Nội [6,14] Mục tiêu đề tài: Chiết tách xác định số thành phần hóa học thân rễ sâm vũ diệp Để đạt mục tiêu trên, đề tài thực với nội dung sau: Định tính nhóm chất hữu thường gặp mẫu nghiên cứu phản ứng hóa học, sắc ký lớp mỏng Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập Xây dựng dấu vân tay sắc ký Sâm vũ diệp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC Đại học, Trường Đại học Dược Hà nội 37 16 Trần Nhật Phương (2008), Học phần kỹ thuật Công Nghệ Sinh Học Proteomic-Sắc ký, tr 12 17 Trường Đại học Dược Hà nội, Bộ mơn hố phân tích (2006), Hố phân tích II, tr 17, 99-146, 173-222 18 Viện Dược liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, Nhà xuất khoa học kỹ thuật tr 199 – 222; 493 – 685 B Tài liệu tiếng anh 19 Choi KT (2008) Botanical, characteristics, pharmacological effects and medicinal components of Korean Panax ginseng CA Meyer Acta Pharmacol Sin., 29, pp 1109-1118 20 Duc N M., Kasai R., Ohtani K., et al (1994), "Saponins from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv collected in Central Vietnam II", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 42(1), pp 115-122 21 Hasegawa H., Matsumiya S., Uchiyama M., et al (1994), "Inhibitory effect of some triterpenoid saponins on glucose transport in tumor cells and its application to in vitro cytotoxic and antiviral activities", Planta Medica, 60(3), pp 240-243 13 22 Mahato S, Kundu A (1994) C NMR spectra of pentacyclic triterpenoids-a complication and some salient features Phytochemistry 37:1517-1575 23 Ren Y C., Dong J Z., Jun Z., et al (1985), "Two new oleanolic acidtype saponins from Panax stipuleanatus", Acta Botanica Yunnanica, 7, pp 103106 24 Sasidharan S, Chen Y, Saravanan D, Sundram KM, Latha Y (2011), “Extraction, isolation and characterization of bioactive compounds from plants’ extracts”, Afr J Tradit Complement Altern Med, vol 8, No 1, 1-10 25 Subhadhirasakul S and Pechpongs P A terpenoid and two steroids from the flowers of Mammea siamensis Songklanakarin J Sci Technol., 2005, 27(Suppl 2):555-561 “ Takuhiro Uto, Ayana Sakamoto, Nguyen Huu Tung (2013), AntiProliferative Activities and Apoptosis Induction by Triterpenes Derived from Eriobotrya japonica in Human Leukemia Cell Lines” International Journal of Molecular Sciences 26 38 27 Tung NH, Quang TH, Ngan NTT, Minh CV, Anh BK, Long PQ, Cuong NM, Kim YH Oleanolic triterpene saponins from the roots of Panax bipinnatifidus 59, 1417-1420 (2011) 28 Wang DQ, Fan J, Feng BS, Li SR, Wang XB, Yang CR, Zhou J Studies on saponins from the leaves of Panax japonicas var bipinnatifidus (Seem.)Wu et Feng Yao Xue Xue Bao, 24, 593-599 (1989) 29 Yahara S., Kasai R., Tanaka O (1977), "New dammarane type saponins of leaves of Panax japonicus C.A Meyer (1) chikusetsusaponins-L5, -L9a and - L10", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 25(8), pp 2041-2047 30 30 Yamasaki K (2000), "Bioactive saponins in Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis", Pharmaceutical Biology, 38(1), pp 16-24 Yang W Z., Hub Y., Wua W Y., et al (2014), "Saponins in the genus Panax L.(Araliaceae): A systematic review of their chemical diversity", Phytochemistry, 106, pp 7-24 31 32 Yoshizaki K., Murakami M., Fujino H., et al (2012), "New triterpenoid saponins from fruit specimens of Panax japonicus collected in Toyama prefecture and Hokkaido", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 60(6), pp 728-735 C Trang wed 33 Http://Www.Theplantlist.Org 39 PHỤ LỤC Phụ lục : Phổ khối ESI-MS chất số (β-sitosterol) Phụ lục : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân H-NMR (CDCl3, 400 MHz) chất số (β-sitosterol) Phụ lục : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân chất số (β-sitosterol) Phụ lục : Phổ khối ESI-MS (positive) chất số (Oleanolic acid) Phụ lục : Phổ khối ESI-MS (negative) chất số (Oleanolic acid) Phụ lục : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân H-NMR (CDCl3, 400 MHz) chất số (Oleanolic acid) Phụ lục : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân chất số (Oleanolic acid) Phụ lục : Phổ khối ESI-MS (positive) chất số (Daucosterol) Phụ lục : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân H-NMR (CDCl3 + CD3OD, 400 MHz) chất số (Daucosterol) 13 C-NMR (CDCl3, 400 MHz) 13 C-NMR (CDCl3, 400 MHz) 13 Phụ lục 10: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân C-NMR (CDCl3 + CD3OD, 400 MHz) chất số (Daucosterol) Phụ lục Phổ khối ESI-MS chất số (β-sitosterol) Phụ lục Phổ cộng hưởng từ hạt nhân H-NMR (CDCl3, 400 MHz) chất số (β-sitosterol) 13 Phụ lục Phổ cộng hưởng từ hạt nhân C-NMR (CDCl3, 400 MHz) chất số (β-sitosterol) Phụ lục Phổ khối ESI-MS (positive) chất số (Oleanolic acid) Phụ lục Phổ khối ESI-MS (negative) chất số (Oleanolic acid) Phụ lục Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) chất số (Oleanolic acid) Phụ lục Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR (CDCl3, 400 MHz) chất số (Oleanolic acid) Phụ lục Phổ khối ESI-MS (positive) chất số (Daucosterol) Phụ lục Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (CDCl3 + CD3OD, 400 MHz) chất số (Daucosterol) Phụ lục 10 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR (CDCl3 + CD3OD, 400 MHz) chất số (Daucosterol) ...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ĐỖ VĂN HÀO NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDIUS SEEM) THU HÁI Ở SA PA, LÀO CAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC... stipuleanatus) nghiên cứu nhiều cách có hệ thống từ thực vật học, thành phần hóa học, tác dụng sinh học Sâm vũ diệp chưa có nhiều kết nghiên cứu Sâm vũ diệp a Phân bố Trên giới, Sâm vũ diệp tìm thấy... hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidius Seem) thu hái Tây Bắc” Đề tài phần đề tài cấp “Ứng dụng giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn