15.1 XÁC ĐỊNH ĐỘ SỐNG CỦA VẮC XIN BCG Kiểm tra độ sống 1.1 Các vật liệu Dung dịch Sauton loãng 1/4 sử dụng để pha loãng vắc xin BCG Môi trường nuôi cấy: Lowenstein Jensen Vắc xin BCG mẫu thử mẫu chuẩn 1.2 Hoàn nguyên pha loãng vắc xin Vắc xin BCG xác định độ sống theo phương pháp sau: Hồn ngun mg vắc xin BCG vào ml dung dịch Sauton lỗng 1/4 vơ khuẩn để tạo hỗn dịch chứa mg vắc xin BCG/1ml Sau hoàn nguyên, hỗn dịch phải giữ 4oC thời gian tối thiểu 15 phút, sau pha theo công thức sau: 1ml hỗn dịch + 99 ml dung dịch Sauton loãng 1/4 = 1/100 (I) 1ml hỗn dịch pha loãng I + 99 ml dung dịch Sauton loãng 1/4 = + ml dung dịch Sauton loãng 1/4 = 1/ + ml dung dịch Sauton loãng 1/4 = 1/ 2ml hỗn dịch pha loãng II + 14 ml đung dịch Sauton loãng 1/4 = 1/ 2ml hỗn dịch pha loãng II + 30 ml dung dịch Sauton loãng 1/4 =/ 1/10.000 (II) ml hỗn dịch pha loãng II 20.000 (III) 2ml hỗn dịch pha loãng II 40.000 (IV) 80.000 (V) 160.000 (VI) 1.3 Nuôi cấy Lắc hỗn dịch độ pha 20 giây, cấy vào môi trường Lowenstein - Jensen 0,1 ml/ống theo trình tự sau: - độ pha đầu: Mỗi độ pha loãng cấy lên ống môi trường - Độ pha thứ cấy lên 10 ống môi trường Lowenstein - Jensen Đối với vắc xin tươi (trước đông khô): Cấy lên ống môi trường Lowenstein - Jensen huyền dịch vắc xin BCG từ độ pha loãng cuối IV, V,VI Đối với vắc xin BCG đông khô giữ oC: Cấy huyền dịch vắc xin BCG từ độ pha loãng III, IV, V Đối với vắc xin BCG đông khô ủ 37 oC: Cấy huyền dịch vắc xin BCG từ độ pha loãng II, III, IV Các ống môi trường cấy huyền dịch vắc xin BCG độ pha khác láng đều, để khô bề mặt ủ 37oC /28 ngày 1.4 Đếm độ sống Các ống môi trường cấy huyền dịch BCG ủ 37oC đưa đếm số khuẩn lạc mọc ống sau 21 ngày 28 ngày 1.5 Tính kết Số đơn vị sống ml vắc xin tính theo cơng thức sau: Điều kiện xác định Cơng thức tính 2 X1  X  2X d1   X  X  2X v  X  X  X 2  X  X d2  X v   X1  X  2X 3 X  2X  2  2X 3 d3  X v 2  X  2X 2X 2    d3 X v X : Số khuẩn lạc trung bình mọc ống mơi trường Lowenstein - Jensen cấy huyền dịch BCG độ pha thứ X : Số khuẩn lạc trung bình mọc ống môi trường Lowenstein - Jensen cấy huyền dịch BCG độ pha thứ X : Số khuẩn lạc trung bình mọc ống môi trường Lowenstein - Jensen cấy huyền dịch BCG độ pha thứ d - Độ pha lỗng huyền dịch vắc xin BCG v - Thể tích hỗn dịch cấy ống môi trường Lowenstein - Jensen Hằng số  tương đương với số lượng tối ưu khuẩn lạc đếm ống môi trường Lowenstein - Jensen Kết độ sống loạt vắc xin BCG tính theo chương trình phần mềm Whoprogram /BCG/Biofarma Tại nhà sản xuất, tiến hành kiểm tra độ sống tất loạt vắc xin thành phẩm (bao gồm độ sống trước đông khô, sau đông khô sau ủ ổn định nhiệt) Những loạt vắc xin BCG có độ sống không đảm bảo với giới hạn cho phép lần kiểm tra thứ phải nhắc lại thử nghiệm: - Nếu thử nghiệm độ sống lần không đạt yêu cầu thử nghiệm có giá trị (valid test), phải nhắc lại thử nghiệm với số lượng mẫu số ống môi trường Lowenstein Jensen gấp đôi so với lần - Nếu thử nghiệm độ sống lần khơng đạt u cầu thử nghiệm khơng có giá trị (invalid test) cần nhắc lại thử nghiệm với số lượng mẫu số ống môi trường lần Nếu lần thử nghiệm nhắc lại, độ sống khơng đạt phải huỷ bỏ loạt vắc xin BCG Kiểm tra độ sống vắc xin BCG phải tiến hành song song với vắc xin BCG mẫu chuẩn để kiểm tra chất lượng môi trường dùng cho thử nghiệm độ sống Độ sống vắc xin BCG mẫu chuẩn thử nghiệm phải ổn định nằm giới hạn giá trị trung bình ± 2SD 1.6 Tiêu chuẩn chấp thuận Đối với vắc xin BCG phòng bệnh lao, giới hạn độ sống cho phép từ triệu đến triệu đơn vị sống mg vắc xin BCG (1.106 – 6.106 đvs/mg vaccxin BCG) Kiểm tra tính ổn định nhiệt Số đơn vị sống vắc xin BCG sau ủ 37 oC/28 ngày phải đạt 20% so với mẫu ủ oC /28 ngày 2.1 Các vật liệu Dung dịch Sauton loãng 1/4 sử dụng để pha lỗng vắc xin BCG Mơi trường ni cấy: Lowenstein Jensen Vắc xin BCG mẫu thử mẫu chuẩn Trước kiểm tra tính ổn định nhiệt, vắc xin BCG đông khô mẫu thử phải ủ nhiệt độ khác 28 ngày đây: - Dạng 1mg/ống: ủ 10 ống oC/28 ngày 10 ống 37 oC/28 ngày - Dạng 0,5mg/ống: ủ 20 ống oC/28 ngày 20 ống 37 oC/28 ngày 2.2 Tiến hành Kiểm tra tính ổn định nhiệt vắc xin BCG cách đếm độ sống loạt vắc xin sau ủ 4oC 37oC/28 ngày Quy trình đếm độ sống thực Mục Tính tỷ lệ % số đơn vị sống BCG mọc 37 oC so với oC Số ĐVS/ mg vắc xin BCG 37 oC/28 ngày Tỷ lệ % ổn định nhiệt x 100 (%) = Số ĐVS/ mg vắc xin BCG oC/28 ngày ĐVS: đơn vị sống Những loạt vắc xin BCG có tỷ lệ % ổn định nhiệt không đạt yêu cầu lần kiểm tra thứ phải nhắc lại thử nghiệm: - Nếu thử nghiệm tỷ lệ % ổn định nhiệt lần không đạt yêu cầu thử nghiệm có giá trị (valid test), phải nhắc lại thử nghiệm với số lượng mẫu số ống môi trường Lowenstein Jensen gấp đôi so với lần - Nếu thử nghiệm tỷ lệ % ổn định nhiệt lần không đạt yêu cầu thử nghiệm khơng có giá trị (invalid test) cần nhắc lại thử nghiệm với số lượng mẫu số ống môi trường lần Nếu lần thử nghiệm nhắc lại, tỷ lệ % ổn định nhiệt khơng đạt phải huỷ bỏ loạt vắc xin BCG Kiểm tra tỷ lệ % ổn định nhiệt vắc xin BCG phải tiến hành song song với vắc xin BCG mẫu chuẩn để kiểm tra chất lượng môi trường dùng cho thử nghiệm độ sống Độ sống vắc xin BCG mẫu chuẩn thử nghiệm phải ổn định nằm giới hạn giá trị trung bình ± 2SD 2.3 Tiêu chuẩn chấp thuận Tỷ lệ % số đơn vị sống BCG mọc 37 oC so với oC phải không thấp 20 %  ... trung bình ± 2SD 1. 6 Tiêu chuẩn chấp thuận Đối với vắc xin BCG phòng bệnh lao, giới hạn độ sống cho phép từ triệu đến triệu đơn vị sống mg vắc xin BCG (1. 106 – 6 .10 6 đvs/mg vaccxin BCG) Kiểm tra... bỏ loạt vắc xin BCG Kiểm tra độ sống vắc xin BCG phải tiến hành song song với vắc xin BCG mẫu chuẩn để kiểm tra chất lượng môi trường dùng cho thử nghiệm độ sống Độ sống vắc xin BCG mẫu chuẩn thử... vắc xin BCG Kiểm tra tỷ lệ % ổn định nhiệt vắc xin BCG phải tiến hành song song với vắc xin BCG mẫu chuẩn để kiểm tra chất lượng môi trường dùng cho thử nghiệm độ sống Độ sống vắc xin BCG mẫu