13.8 XÁC ĐỊNH HIỆU QUẢ KHÁNG KHUẨN CỦA CHẤT BẢO QUẢN Chất bảo quản chất thêm vào chế phẩm phân liều không vô trùng, loại thuốc nước, để ngăn chặn phát triển vi sinh vật có sẵn chế phẩm hay nhiễm vào chế phẩm trình sử dụng Chất bảo quản thêm vào chế phẩm vô trùng đa liều để ức chế phát triển vi sinh vật nhiễm vào chế phẩm sau mở sử dụng Không dùng chất bảo quản biện pháp thay cho thực hành tốt sản xuất thuốc, không dùng chất bảo quản với mục đích làm giảm số lượng vi sinh vật chế phẩm không vô trùng để làm tăng hiệu trình tiệt trùng chế phẩm vô trùng đa liều Đa số chất bảo quản hợp chất độc Do đó, để bảo đảm an toàn, nồng độ chất bảo quản sản phẩm cuối phải thấp mức gây nguy hiểm cho người sử dụng Nồng độ chất bảo quản cần dùng giảm đến mức tối thiểu hay nhiều hoạt chất công thức pha chế có khả kháng khuẩn và/hoặc kháng nấm Chất bảo quản nồng độ sử dụng phải ghi rõ bao bì sản phẩm Hiệu bảo vệ sản phẩm chất bảo quản phải xác định từ giai đoạn nghiên cứu phát triển sản phẩm Phương pháp xác định hiệu kháng khuẩn chất bảo quản trình bày Nguyên tắc phương pháp cấy hỗn dịch vi sinh vật thị thích hợp vào chế phẩm cần thử, tốt cấy trực tiếp vào bao bì đóng gói cuối sản phẩm, Ủ chế phẩm cấy vi sinh vật nhiệt độ thích hợp, sau lấy mẫu đếm số lượng vi sinh vật sống lại sản phẩm sau khoảng thời gian ủ định Việc sử dụng chất bảo quản xem có hiệu số lượng vi sinh vật đếm giảm đáng kể không tăng theo thời gian Tiêu chuẩn để đánh giá hiệu kháng khuẩn chất bảo quản thay đổi tùy theo loại chế phẩm đường dùng thuốc (Xem bảng 1) Phân loại chế phẩm Đối tượng thử nghiệm xác định hiệu kháng khuẩn chất bảo quản loại chế phẩm có thành phần nước hay có sử dụng nước làm tá dược Các chế phẩm chia thành nhóm sau: Bảng 13.8.1 Loại chế phẩm Mơ tả Thuốc tiêm chế phẩm tiêm khác, bao gồm nhũ dịch; thuốc nhỏ mắt, thuốc nhỏ tai thuốc nhỏ mũi vô trùng Thuốc nhỏ mũi không vô trùng, chế phẩm dùng cho màng nhày, chế phẩm dùng da, bao gồm nhũ dịch Các loại thuốc uống (trừ thuốc kháng acid) Thuốc uống kháng acid Vi sinh vật thị Aspergillus niger Candida albicans Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus ATCC 16404 (IP 1431.83, IMI 149 007) ATCC 10231 (IP 48.72, NCPF 3179) ATCC 9027 (CIP 82.118, NCIMB 8626) ATCC 6538 (CIP 4.83, NCTC 10788) Môi trường nuôi cấy Tất môi trường sử dụng phụ lục phải kiểm tra khả dinh dưỡng, dùng vi sinh vật thị nêu để thử, trước dùng Chuẩn bị hỗn dịch vi sinh vật thị Cấy riêng rẽ chủng gốc cấy lại vi sinh vật thị lên bề mặt môi trường rắn thích hợp, sử dụng mơi trường giới thiệu bảng 13.8.2 mơi trường khác có sẵn thị trường, chúng có cơng dụng có khả dinh dưỡng tương đương, sau ủ điều kiện qui định bảng 13.8.2 (Xem phụ lục 13.6 Thử giới hạn nhiễm khuẩn để biết thành phần môi trường dinh dưỡng) Bảng 13.8.2 Vi sinh vật thị Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Candida albicans Aspergillus niger Môi trường nuôi cấy Soybean-Casein Digest Broth; Soybean-Casein Digest Agar Soybean-Casein Digest Broth; Soybean-Casein Digest Agar Sabouraud Dextrose Broth; Sabouraud Dextrose Agar Sabouraud Dextrose Broth; Sabouraud Dextrose Agar Nhiệt độ ủ o Thời gian ủ 30 – 35 C 18 – 24 30 – 35o C 18 – 24 20 – 25o C 44 - 52 20 – 25o C - 10 ngày Sau ủ, cần, tiếp tục cấy chuyển vi sinh vật thu sang bề mặt môi trường dinh dưỡng mới, thu vi sinh vật trạng thái phát triển tốt Tuy nhiên, số lần cấy chuyển nên hạn chế mức tối thiểu Rửa bề mặt môi trường nuôi cấy vi khuẩn C albicans vài lần, lần dùng lượng nhỏ dung dịch natri clorid vô trùng 0,9% (kl/tt), tập trung dịch rửa vào vật đựng thích hợp bổ sung dung dịch natri clorid vơ trùng 0,9% (kl/tt) để thu hỗn dịch có khoảng 10 vi sinh vật sống (cfu) ml Để thu hoạch bào tử A niger, tiến hành dùng dung dịch natri clorid vô trùng 0,9% (kl/tt) có chứa 0,05% (kl/tt) polysorbat 80, thêm dung dịch natri clorid vô trùng 0,9% (kl/tt) để hỗn dịch có khoảng 108 cfu/ml Một cách khác, tăng sinh chủng gốc vi sinh vật thị mơi trường lỏng thích hợp, ví dụ môi trường giới thiệu bảng 13.8.2, thu hoạch vi sinh vật thị cách ly tâm, sau rửa phân tán lại dung dịch natri clorid vơ trùng 0,9% (kl/tt) để hỗn dịch có khoảng 108 cfu/ml Đếm số lượng tế bào sống hỗn dịch thu phương pháp hộp thạch hay phương pháp màng lọc (xem phụ lục 13.6 Thử giới hạn nhiễm khuẩn) Kết đếm (cfu/ml) dùng để xác định lượng vi sinh vật cấy vào chế phẩm cần thử thời điểm bắt đầu thử nghiệm Bảo quản hỗn dịch vi sinh vật thị tủ lạnh khơng dùng vòng Các hỗn dịch vi khuẩn C albicans phải dùng 24 sau thu hoạch, hỗn dịch A niger bảo quản tủ lạnh ngày Tiến hành Cấy vi sinh vật thị trực tiếp vào đơn vị đóng gói cuối chế phẩm cần thử, đơn vị đóng gói với hỗn dịch vi sinh vật chuẩn bị tiêu chuẩn hóa trên, lắc kỹ để trộn Thể tích hỗn dịch vi sinh vật cấy vào đơn vị đóng gói tính tốn cho nồng độ vi sinh vật thị chế phẩm cần thử sau cấy khoảng từ 10 – 106 cfu/ml chế phẩm loại 1, 3, khoảng 10 – 104 cfu/ml chế phẩm loại Thể tích hỗn dịch đem cấy khơng vượt q 1% thể tích chế phẩm cần thử, tốt từ 0,5 – 1% Nếu cấy vi sinh vật thị trực tiếp vào đơn vị đóng gói cuối sản phẩm, chuyển thể tích đủ lớn chế phẩm cần thử, 20 ml, vào vật chứa vô trùng tích thích hợp, có nắp kín tiếp tục tiến hành Ủ vật chứa cấy vi sinh vật thị nhiệt độ 20 – 25 oC, tránh ánh sáng Lấy mẫu từ vật chứa sau khoảng thời gian ủ định qui định bảng 13.8.3, lượng mẫu cần lấy thường ml g Ghi chép thay đổi mặt cảm quan chế phẩm cần thử trình ủ Xác định số lượng vi sinh vật thời điểm lấy mẫu phương pháp hộp thạch hay phương pháp màng lọc, dùng môi trường dinh dưỡng nhiệt độ ủ qui định bảng 13.8.2, thời gian ủ từ – ngày đối vi khuẩn C albicans, – ngày A niger Phải bảo đảm loại bỏ hồn tồn hoạt tính kháng khuẩn và/hoặc kháng nấm chế phẩm cần thử phương pháp pha loãng, lọc, hay dùng chất trung hòa Nếu sử dụng phương pháp pha lỗng, điểm cần ý độ xác kết đếm giảm số lượng vi sinh vật nhỏ (nhỏ 30 cfu/hộp phương pháp hộp thạch, dùng hộp petri có đường kính từ 90 – 100 mm) Nếu sử dụng chất trung hòa, phải có biện pháp kiểm tra thích hợp để bảo đảm nồng độ chất trung hòa dùng đủ để loại bỏ hồn tồn hoạt tính kháng khuẩn chế phẩm cần thử để bảo đảm thân chất trung hòa khơng gây ảnh hưởng bất lợi đến phát triển vi sinh vật thị Dùng nồng độ vi sinh vật thị, tính cfu/ml, thời điểm bắt đầu thử nghiệm - Ro nồng độ vi sinh vật sống đếm thời điểm lấy mẫu t - Rt, tính lượng giảm vi sinh vật thị thời điểm - R: R (cfu/ml) = Ro - Rt Biểu diễn kết dạng log10 R Nguyên tắc đánh giá hiệu kháng vi sinh vật chất bảo quản Hiệu kháng khuẩn chất bảo quản hay hệ chất bảo quản xem đạt yêu cầu kết thử nghiệm thỏa mãn nguyên tắc đánh giá bảng 13.8.3 Số lượng vi sinh vật thị thời điểm tăng không nhiều 0,5 log 10 cfu/ml so với kết đếm thời điểm gần kề trước xem khơng tăng Bảng 13.8.3.A Chế phẩm loại Vi khuẩn Nấm men, nấm mốc ngày ≥ 1,0 Không tăng Log R 14 ngày ≥ 3,0 Không tăng 28 ngày Không tăng Không tăng Log R 14 ngày ≥ 2,0 Không tăng 28 ngày Không tăng Không tăng Log R 14 ngày ≥ 1,0 Không tăng 28 ngày Không tăng Không tăng Log R 14 ngày Không tăng 28 ngày Không tăng Bảng 13.8.3.B Chế phẩm loại Vi khuẩn Nấm men, nấm mốc ngày - Bảng 13.8.3.C Chế phẩm loại Vi khuẩn Nấm men, nấm mốc ngày - Bảng 13.8.3.D Chế phẩm loại Vi khuẩn Nấm men, nấm mốc ngày - ... Không tăng 28 ngày Không tăng Bảng 13.8. 3.B Chế phẩm loại Vi khuẩn Nấm men, nấm mốc ngày - Bảng 13.8. 3.C Chế phẩm loại Vi khuẩn Nấm men, nấm mốc ngày - Bảng 13.8. 3.D Chế phẩm loại Vi khuẩn Nấm... sáng Lấy mẫu từ vật chứa sau khoảng thời gian ủ định qui định bảng 13.8. 3, lượng mẫu cần lấy thường ml g Ghi chép thay đổi mặt cảm quan chế phẩm cần thử trình ủ Xác định số lượng vi sinh vật thời... mãn nguyên tắc đánh giá bảng 13.8. 3 Số lượng vi sinh vật thị thời điểm tăng không nhiều 0,5 log 10 cfu/ml so với kết đếm thời điểm gần kề trước xem khơng tăng Bảng 13.8. 3.A Chế phẩm loại Vi khuẩn