13.6 Thư giíi h¹n nhiƠm khn Thư giíi h¹n nhiƠm khuẩn nhằm đánh giá số lợng vi khuẩn hiếu khí, nấm, mốc có khả sống lại đợc phát vi khuẩn điểm y tế có thuốc Thí nghiệm đợc tiến hành điều kiện vô khuẩn Trong làm thí nghiệm, ý không đa chất khử khuẩn vào mẫu thử Thử nghiệm đợc áp dụng cho tất dợc phẩm gồm nguyên liệu thành phẩm thuốc không tiệt khuẩn trình sản xuất Thử nghiệm sơ Tìm chÊt øc chÕ cã thc: Thư nghiƯm giíi h¹n nhiễm khuẩn giá trị chất ức chế có thuốc cản trở đến khả phát vi khuẩn Vì cần làm thí nghiệm kiểm tra trớc cách lấy dung dịch chế phẩm đợc pha nồng độ thích hợp vào môi trêng chän läc cho Escherichia coli, Salmonella, Staphylococcus, Pseudomonas aeruginosa, cấy vào 1ml canh khuẩn 24 h tuổi ®· pha lo·ng víi dung dÞch ®Ưm phosphat pH 7,2 tới 10 -3 vi khuẩn tơng ứng Nếu vi khuẩn không mọc, thí nghiệm cần thay đổi cách: Giữ nguyên lợng chất mang thử nhng tăng thể tích môi trờng Cho vào môi trờng lợng vừa đủ chất khử hoạt tính thích hợp Phối hợp cách làm (1) (2) để vi khuẩn mang cấy mọc đợc Tuỳ theo thành phần nồng độ mẫu thử, thêm vào môi trờng để trung hoà chất ức chế loại sau: lecithin đậu tơng 0,5 %, polysorbat 20: % Làm lại thí nghiệm với điều kiện chất ức chế lợng mẫu mang kiểm tra đợc trung hoà Môi trờng Môi trờng nuôi cấy pha theo cách dới dùng môi trờng khô hãng sản xuất môi trờng vi sinh vật cung cấp Các môi trờng tự pha chế phải hÊp tiƯt khn b»ng nåi hÊp ë nhiƯt ®é 115 oC 30 trõ cã nh÷ng chØ dÉn riêng loại môi trờng đặc biệt Thạch dùng cho pha chế môi trờng có độ ẩm dới 15% Nớc chất dùng công thức phải tinh khiết Môi trờng lỏng casein lecithin đậu tơng polysorbat Casein pancreatic Lecithin đậu tơng Polysorbat 20 Nớc 20,0 5,0 40,0 960 g g ml ml Hoµ tan casein pancreatic lecithin đậu tơng vào 960 ml nớc, đun cách thủ ë 48 - 50oC kho¶ng 30 cho tan hoàn toàn Thêm 40 ml polysorbat 20, trộn đều, phân chia vào dụng cụ thích hợp Môi trờng thạch casein đậu tơng Casein pancreatic Natri clorid Thạch 15,0 g 5,0 g 15,0 g Bột đậu tơng thủy phân papain Níc pH sau tiƯt khn: 7,3 + 0,2 5,0 g 1000 ml Môi trờng lỏng casein đậu tơng Casein pancreatic 17,0 g Dikali hydrophosphat 2,5 g Bét ®Ëu tơng thuỷ phân 3,0 g papain 2,5 g Glucose 5,0 g Natri clorid 1000 ml Nớc Hoà tan chất rắn vào nớc đun nóng nhẹ để tan hoàn toàn Để nguội dung dịch nhiệt độ phòng, phân chia vào bình thích hợp tiệt khuẩn pH sau tiệt khuẩn:7,3 + 0,2 Môi trờng thạch muối - manitol Casein pancreatic 5,0 g Th¹ch 15,0 g Pepton 5,0 g Cao thÞt 1,0 g Natri clorid 75,0 g D - Manitol 10,0 g §á phenol 0,025 g Níc 1000 ml Trộn, đun nóng, khuấy đều, đun sôi khoảng phút để tan hoàn toàn, pH sau tiệt khuẩn : 7,4 + 0,2 Môi trờng thạch Baird - Parker Casein pancreatic 10,0 g Cao thÞt 5,0 g Cao men bia 1,0 g Lithi clorid 5,0 g Th¹ch 20,0 g Glycin 12,0 g Natri pyruvat 10,0 g Níc 950 ml Đun nóng, khuấy sau đun sôi khoảng phút, tiệt khuẩn, để nguội tới 45 50oC, thêm 10 ml dung dịch kali telurit 1% vô khuẩn 50 ml nhũ dịch lòng đỏ trứng Trộn kỹ, nhẹ nhàng rót vào hộp Chế tạo nhũ dịch lòng đỏ trứng cách: Sát khuẩn toàn bề mặt trứng, đập vỡ vô khuẩn trứng, lấy lòng đỏ trứng vào ống trụ chia vạch vô khuẩn Thêm nớc muối vô khuẩn để có tỷ lệ lòng đỏ trứng so víi níc mi lµ 3/7 Bá vµo mét cèc khuấy vô khuẩn, trộn với tốc độ lớn pH sau tiƯt khn 6,8 + 0,2 M«i trêng th¹ch Vogel – Johnson Casein pancreatic 10,0 g Cao men bia 5,0 g Manitol 10,0 g Natri pyruvat 10,0 g Th¹ch 16,0 g Glycin 10,0 g Lithi clorid 5,0 g Dikali hydrophosphat 5,0 g §á phenol 25,0 mg Níc 1000 ml Đun sôi để hoà tan chất rắn khoảng phút Tiệt khuẩn, để nguội đến 45 - 500C Thêm 20 ml dung dịch kali telurit 1% v« khn pH sau tiƯt khn 7,2 + 0,2 Môi trờng thạch cetrimid Gelatin pancreatic 20,0 g Cetrimid (Cetyl trimethylamoni 0,3 g bromid) 1,4 g Magnesi clorid 13,6 g Thạch 10,0 ml Glycerin 1000 Nớc ml Hoà tan tất chất rắn vào nớc, thêm glycerin Đun nóng, khuấy đều, đun sôi phút cho tan hoàn toµn pH sau tiƯt khn : 7,2 + 0,2 Môi trờng thạch Pseudomonas để phát Fluorescin Casein pancreatic 10,0 g Peton 10,0 g Dikali hydrophosphat khan 1,5 g Magnesi sulfat (MgSO4.7H2O) 1,5 g Th¹ch 15,0 g Glycerin 10,0 ml Nớc 1000 ml Hoà tan tất chất rắn vào nớc trớc thêm glycerin Đun nóng, khuấy đều, đun sôi phút cho tan hoàn toàn pH sau tiệt khuẩn: 7,2 + 0,2 Môi trờng thạch Pseudomonas để phát Pyocyanin Gelatin pancreatic 20,0 g Kali sunfat khan 10,0 g Th¹ch 15,0 g Magnesi clorid khan 1,4 g Glycerin 10,0 ml Níc 1000 ml Hoµ tan chất rắn nớc trớc thêm glycerin Đun nóng, khuấy đều, đun sôi khoảng phút để tan hoµn toµn pH sau tiƯt khn: 7,2 + 0,2 Môi trờng lỏng lactose Cao thịt Lactose Gelatin pancreatic Nớc 3,0 g 5,0 g 5,0 g 1000 ml Làm lạnh rÊt nhanh m«i trêng sau tiƯt khn pH sau tiƯt khn : 6,9 + 0,2 M«i trêng láng selenit - cystin Casein pancreatic Natri selenit acid Dinatri phosphat Lactose L- Cystin Níc 5,0 g 4,0 g 10,0 g 4,0 g 10,0 mg 1000 ml Đun nóng để tan hoàn toàn Đun tiếp 15 phút Không cần tiệt khuÈn tiÕp theo pH sau tiÖt khuÈn : 7,0 +0,2 M«i trêng láng tetrathionat Casein pancreatic Calci carbonat Muèi mËt Pepton Natri thiosulfat Níc 2,5 g 10,0 g 1,0 g 2,5 g 30,0 g 1000 ml Đun nóng để hoà tan chất rắn Khi sử dụng thêm vào môi trờng dung dịch gồm: 5,0 g kali iodid 6,0 g iod 20 ml nớc Sau thêm 10ml dung dịch xanh brilliant 1% trộn Không đun nóng môi trờng sau thêm dung dịch xanh brilliant Môi trờng thạch xanh brilliant Pepton Đờng trắng Cao men bia Casein pancreatic Lactose Natri clorid Thạch Đỏ phenol Xanh brilliant Níc 5,0 g 10,0 g 3,0 g 5,0 g 10,0 g 5,0 g 20,0 g 80,0 mg 12,5 mg 1000 ml Đun sôi để hoà tan tất chất rắn phút Chỉ tiệt khuẩn tr ớc dùng Rót vào hộp Petri để ngi pH sau tiƯt khn: 6,9 +0,2 M«i trêng thạch xylose - lysin - desoxycholat Xylose 3,5 g Đỏ phenol 0,08 g L-Lysin 5,0 g Th¹ch 13,5 g Lactose 7,5 g Natri desoxycholat 2,5 g Đờng trắng 7,5 g Natri thiosulfat 6,8 g Natri clorid 5,0 g Săt (III) amoni citrat 0,8 g Cao men bia 3,0 g Níc 1000 ml Đun nóng, lắc tròn để trộn chất rắn với nớc Chú ý không để nóng Chuyển vào bình cách thuỷ giữ nhiệt độ 50 oC Rót vào đĩa trớc môi trêng ngi hoµn toµn pH sau tiƯt khn: 7,4 + 0,2 Môi trờng thạch bismuth sulfit Cao thịt 5,0 g S¾t (II) sulfat 0,3 g Casein pancreatic 5,0 g Bismuth sulfit 8,0 g Pepton 5,0 g Th¹ch 20,0 g Glucose 5,0 g Xanh brilliant 25,0 Dinatri hydrophosphat mg Níc 4,0 g 1000 ml Đun nóng, lắc tròn để hoà chất rắn với nớc, không để nóng Chuyển vào bình cách thuỷ giữ nhiệt độ 50 0C Rót vào đĩa để nguội pH sau tiệt khuẩn: 7,6 + 0,2 Môi trờng thạch - sắt - ba đờng Casein pancreatic Sắt (II) amoni sulfat Pepton Natri clorid Lactose Natri thiosulfat Đờng trắng Thạch 10,0 g 0,2 g 20,0 g 5,0 g 10,0 g 0,3 g 10,0 g 13,0 g D-Glucose monohydrat §á phenol Nớc 1,0 g 0,025 g 1000 ml Hoà nóng chất rắn với nớc, đun sôi phút cho tan hoàn toàn Chuyển vào dụng cụ thích hợp để tiÖt khuÈn pH sau tiÖt khuÈn: 7,3 + 0,2 M«i trêng Mac - Conkey Casein pancreatic Natri clorid Gelatin pancreatic Thạch Pepton Lactose Muối mật Đỏ trung tính Tím tinh thĨ Níc 1,5 g 5,0 g 17,0 g 13,5 g 1,5 g 10,0 g 1,5 g 30,0 mg 1,0 mg 1000 ml Hoà nóng chất rắn với nớc, đun sôi phút cho tan hoàn toàn pH sau tiệt khuẩn : 7,1 + 0,2 Môi trờng thạch Levine - eosin - xanh methylen Gelatin pancreatic 10,0 g Dikali hydrophosphat 2,0 g Th¹ch 15,0 g Lactose 10,0 g Eosin 0,4 g Xanh methylen 0,065 g Níc 1000 ml Hoà tan nóng thành phần gelatin pancreatic, dikali hydrophosphat thạch nớc, để lạnh Các thành phần lại thêm vào sử dụng cách đun chảy môi trờng thêm vào theo tỷ lệ: Cứ 100 ml môi trờng thêm ml dung dịch lactose (1:5), ml dung dịch eosin ml dung dịch xanh methylen (1:300) Môi trờng sau hoà trộn ph¶i pH sau tiƯt khn: 7,1 + 0,2 Môi trờng thạch Sabouraud Glucosa Casein pancreatic Pepton Thạch Nớc Hoà tan, đun sôi cho tan hoàn toàn 40,0 g 5,0 g 5,0 g 5,0 g 1000 ml pH sau tiƯt khn : 5,6 + 0,2 M«i trêng thạch - khoai tây - glucose Nấu 300 g khoai tây bóc vỏ thái nhỏ 500 ml nớc cất, lọc qua vải, thêm nớc cất để đợc 1000 ml, thêm vào thành phần sau: thạch 15 g; glucose 20 g Hoµ tan nãng TiƯt khn Khi dùng đun nóng chảy, để nguội đến 45 oC Điều chỉnh môi trờng dung dịch acid tartric (1:10) đến pH 3,5 + 0,1 Rót vào đĩa Chú ý: Không dùng môi trờng đun nóng trở lại lần thứ Để ức chế vi khuẩn thờng gặp mọc môi trờng phát nấm, mốc men (môi trờng Sabouraud môi trờng thạch - khoai tây- glucose) thêm vào lít môi trờng 0,1g tetracyclin 50 mg cloramphenicol, làm trớc dùng Dung dch đệm Natri clorid – pepton pH 7,0 Kali dihydro phosphat 3,56 g Natri hydro phosphat 7,23 g Natri clorid 4,30 g Pepton 1,00 g Nước cất 1000 ml Có thể thêm chất hoạt động bề mặt chất khử tác dụng kháng khuẩn vào dung dịch Polysorbat 80 0,1 đến 1,0% Hấp tiệt trùng 1210C 15 phút Môi trờng nớc thịt Cao thịt 5,0 g Nớc 1000 ml Môi trờng thạch thờng Pepton Natri clorid Thạch Nớc pH sau tiÖt khuÈn 10,0 g 5,0 g 15 - 20 g 1000 ml 7,4 + 0,2 M«i trêng pepton - natri clorid Pepton 10,0 g Natri clorid 5,0 g Níc 1000 ml pH sau tiƯt khn 7,0 + 0,2 Môi trờng tăng sinh cho Clostridia Cao thịt 10,0 g Pepton 10,0 g Cao men bia 3,0 g Tinh bét dÏ tan 1,0 g Glucose monohydrat 5,0 g Cystein hydroclorid 0,5 g Natri clorid 5,0 g Natri acetat 3,0 g Thạch 0,5 g Nớc cất 1000 ml Hoà tan thạch cách đun nóng tới sôi, khuấy liªn tơc HÊp tiƯt khn 121oC 15 NÕu cần điều chỉnh pH cho sau tiệt khuẩn khoảng 6,8 Môi trờng thạch Columbia Casein pancreatic 10,0 g ThÞt 5,0 g DÞch tim pancreatic 3,0 g Cao men bia 5,0 g Tinh bét ng« 1,0 g Natri clorid 5,0 g Th¹ch bét 15,0 g Níc cÊt 1000 ml Hoà tan thạch cách đun nóng tới sôi, khuấy liên tục Nếu cần điều chỉnh pH cho sau tiƯt khn kho¶ng 7,3 + 0,2 HÊp tiƯt khuẩn 121oC 15 phút Làm lạnh tới 45oC đến 50oC Khi cần thêm 20 mg gentamycin base rót vào hộp Petri Môi trờng sulfit - lactose Casein pancreatic 5,0 g Cao men bia 2,5 g Cystein hydroclorid 0,3 g Natri clorid 2,5 g Lactose 10,0 g Nớc cất 1000 ml Hoà tan tất thành phần nớc điều chỉnh để có pH 7,1 + 0,1 Đóng vào ống nghiệm 16 x 160 mm ống ml ống nhỏ Durham HÊp tiƯt khn 121oC 15 B¶o qu¶n ë 4oC M«i trêng láng Enterobacteria - Mossel Genlatin pancreatic D-Glucose monohydrat Mật bò khô Kali dihydrophosphat Dinatri hydrophosphat Xanh brilliant Níc cÊt 10,0 g 5,0 g 20,0 g 2,0 g 8,0 g 15 mg 1000 ml §iỊu chØnh pH cho sau đun 7,0 - 7,4 Đun sôi 30 phút làm lạnh Môi trờng muèi mËt violet - red Cao men bia Gelatin pancreatic Muèi mËt Lactose Natri clorid D-Glucose monohydrat 3,0 g 7,0 g 1,5 g 10,0 g 5,0 g 10,0 g §á trung tÝnh TÝm tinh thĨ Th¹ch Níc cÊt 30 mg mg 15.0 g 1000 ml §iỊu chØnh pH cho sau đun 7,2 - 7,6 Môi trờng đợc đun sôi để tiệt trùng nhng không đợc hấp tiệt trùng Chuẩn bị thí nghiệm Lấy mẫu: Đối với thử nghiệm dới đây, thử nghiệm lấy 10ml 10g chế phẩm Cách thử nghiệm: Một mẫu chế phẩm cần xác định giới hạn vi khuẩn phải thực đầy đủ thử nghiệm sau: Đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại đợc, tính số lợng vi khuẩn, nấm mốc có 1g 1ml chế phẩm Thử nghiệm tìm vi khuẩn gây bệnh sau: Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Salmonella Escherichia coli ChuÈn bÞ mẫu Chế phẩm mang thử nghiệm trình hoà tan nhũ hoá phải đảm bảo không làm thay ®ỉi chđng lo¹i vi khn, nÊm mèc cã thc Để có dung dịch nhũ dịch thích hợp cho thử nghiệm, tiến hành nh sau: Đối với chế phẩm rắn, hoà tan trực tiếp nghiền mịn chế phẩm bình với dung môi chất nhũ hoá thích hợp Đối với chế phẩm dạng lỏng nh dung dịch thực, nhũ dịch nớc, chất rắn hòa tan dƠ dµng vµ hoµn toµn níc , dïng dung dịch đệm phosphat pH 7,2 dung dịch natri clorid 0,9% để hoà loãng Những chế phẩm lỏng hoà lẫn nớc nh dầu, kem sáp: Chế tạo nhũ dịch cách thêm lợng vừa đủ tác nhân nhũ hoá vô khuẩn thích hợp nh loại polysorbat Dùng phơng pháp khuấy trộn học đồng thời làm ấm nhiệt nhng không đợc vợt 45oC để có nhũ dịch chế phẩm đồng Các chế phẩm dạng khí dung - lỏng: Làm lạnh bình để khí hoá lỏng mở nắp để lấy lợng thích hợp mang thử Tiến hành Đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí: Đối với chế phẩm hoà tan tốt tạo thành dung dịch đục, dùng phơng pháp đĩa thạch Còn chế phẩm khác dùng phơng pháp hoà loãng ống nghiệm Hoà tan làm nhũ hoá 10 g 10 ml chế phẩm vừa đủ 100 ml dung dịch đệm phosphat pH 7,2 100 ml dung môi thích hợp với loại chế phẩm, để đợc dung dịch chế phẩm có độ pha loãng tỷ lệ 1/10 Đối với chế phẩm dạng nhầy lÊy chÝnh x¸c b»ng pipet ë tû lƯ 1/10, cã thể pha loãng tiếp để lấy đợc xác, nghĩa pha loãng đến tỷ lệ 1/50 1/100 v.v Thùc hiƯn thư nghiƯm ph¸t hiƯn chÊt ức chế trớc xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí Chế phẩm pha loãng phải cho vào môi trờng nuôi cấy mà không đợc để Dung dịch đệm pH 7,2: Hoà 34g kali dihydrophosphat (KH 2PO4) vào khoảng 500 ml nớc cất bình định mức 1000 ml Điều chỉnh pH tới 7,2 + 0,1 cách thêm dung dịch natri hydroxyd 2% Thêm nớc cất tới vạch Trộn đều, phân chia vào bình, tiệt khuẩn, bảo quản lạnh Khi dùng, hoµ lo·ng víi níc cÊt theo tû lƯ 1: 800 tiệt khuẩn a) Phơng pháp đĩa thạch Hoà loãng chÕ phÈm cho cÊy ml dÞch chÕ phẩm vào môi tr ờng hộp Petri, số khuẩn lạc mọc khoảng 30 đến 300 khuẩn lạc Lấy dung dịch có độ pha loãng cuối cho vào hộp Petri, hộp 1ml Thêm vào hộp 15 20 ml môi trờng thạch casein đậu tơng môi trờng thạch thờng đun chảy để nguội đến 45 oC Đậy hộp, trộn cách xoay qua, xoay lại Sau để yên cho thạch đông cứng nhiệt độ phòng Lật ngợc hộp, mang ủ ë 35oC tõ 24 - 48 h Sau thêi gian đ, kiĨm tra vi khn mäc ë ®Üa, ®Õm sè l ợng khuẩn lạc Lấy giá trị đĩa có số lợng khuẩn lạc lớn mà số khuẩn lạc đĩa không lớn 300 tính số lợng khuẩn lạc 1g 1ml chế phẩm Nếu thấy khuẩn lạc mọc đĩa có độ pha lo·ng 1/10 th× kÕt luËn chÕ phÈm cã Ýt 10 khuẩn lạc g ml b) Phơng pháp pha loãng ống nghiệm Cho vào 14 ống nghiệm cỡ thông thờng, ống 9,0 ml môi trờng lỏng casein đậu tơng Lấy dãy 12 ống chia thành lô, lô ống Dùng lô ống để kiểm tra Thêm vào lô gåm èng vµ mét èng thø (èng A) g (hoặc1 ml) chế phẩm trộn Thêm vào lô gồm ống ống thø (èng B) ml dung dÞch lÊy tõ ống A trộn Thêm vào lô gồm ống, ống ml dung dịch lấy từ ống B trộn Bỏ không sử dụng ống A ống B Theo cách pha có lô 1, lô 2, lô 3, tơng ứng với lợng chế phẩm là: 100; 10; mg l ống Đậy kín ống mang ủ 32 - 35 oC 24 giê, quan s¸t vi khuÈn mọc ống chứa chế phẩm, mang đối chiếu với bảng để biết số lợng vi khuẩn có g 1ml chế phẩm Bảng 1: Tổng sè vi khn chÕ phÈm Sè mg (hc l) chế phẩm cho ống 100 10 Số lợng vi khn lín nhÊt cã thĨ cã g hc ml 3 >1100 3 1100 3 500 3 200 3 290 2 210 150 90 Sè èng cã vi khuÈn mäc 1 1 0 0 3 160 120 70 40 95 60 40 23 khuÈn mäcvicã èngSè 3 3 3 3 c)Phương pháp màng lọc: Dùng màng lọc có kích thước lỗ lọc khơng lớn 0,45 µm, có khả giữ lại vi khuẩn cần kiểm tra Chọn loại màng lọc làm nguyên liệu giữ lại vi khuẩn không ảnh hưởng đến mẫu thử Thí dụ dùng màng Cellulose nitrat để lọc dung dịch nước, dầu cồn thấp độ Dùng màng cellulose acetat để lọc dung dịch cồn cao độ Dùng hệ thống lọc có thiết kế cho phép chuyển màng lọc vào môi trường ni cấy Chuyển lượng thích hợp dung dịch mẫu thử pha theo mục “Chuẩn bị mẫu”, (Tốt lấy lượng dung dịch mẫu chuẩn bị tương đương với 1g 1ml mẫu cần thử; lượng vi khuẩn có nhiều mẫu thử, lấy lượng dung dịch mẫu hơn) Mỗi mẫu thử cần màng lọc, dung dịch mẫu thử chuẩn bị phải lọc qua màng Rửa màng lọc lần, lần khoảng 100ml dung dịch thích hợp dung dịch đệm natri clorid – pepton pH 7,0 Khi cần thêm chất hoạt động bề mặt polysorbat 80 chất khử hoạt tính chất kháng khuẩn vào dung dịch dùng để rửa Cũng rửa màng với số lần hơn, thấy đủ loại hết thuốc tác nhân ảnh hưởng đến kết thử nghiệm khỏi màng Chuyển màng lọc lên môi trường thạch dùng phát vi khuẩn Ủ 30° to 35°C, theo dõi, đếm số vi khuẩn mọc màng Chuyển màng lọc lại lên mặt môi trường phát nấm Ủ 20° to 25°C, theo dõi khoảng ngày, đếm số nấm mọc màng Nếu chắn thời gian mọc nấm cần phát theo dõi, đếm khoảng thời gian ngắn Chọn đếm đĩa có số khuẩn lạc cao 100 khuẩn lạc màng Tính số khuẩn lạc có gam 1ml mẫu thử Mẫu thử thuốc dạng miếng đắp thấm qua da: Chuyển vô trùng 10 miếng dán vào bình có sẵn 500 ml dung dịch đệm natri clorid – pepton pH 7,0, Lắc 30 phút Lọc qua màng lọc để tìm vi khuẩn nấm màng 50ml dung dịch Tiếp tục ủ, theo dõi, đếm vi khuẩn nấm mốc nh trờn Thử nghiệm tìm vi khuẩn a) Tìm Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Cho chế phẩm vào 100 ml môi trờng lỏng casein đậu tơng, ủ 35 - 370C, kiĨm tra vi khn mäc ë m«i trêng NÕu thÊy mäc, dïng que cÊy lÊy m«i trêng, cấy lên đĩa thạch Vogel - Johnson (hoặc thạch Baird - Parker thạch manitol - muối) môi trờng thạch cetrimid Đậy đĩa, lật ngợc hộp Petri, mang ủ Sau ủ kiểm tra không thấy có khuẩn lạc với đặc tính nh ghi bảng bảng (nêu phần sau) môi trờng sử dụng chế phẩm Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Nếu thấy có khuẩn lạc nghi ngờ tiếp tục làm phản ứng sinh hoá Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa nh sau: *Phản øng coagulase (®èi víi Staphylococcus aureus): Dïng que cÊy chun khuẩn lạc nghi ngờ đặc trng từ mặt thạch Vogel-Johnson (hoặc thạch Baird - Parket, thạch manitol - muối) thêm vào ống nghiệm, ống 0,5 ml huyết tơng thỏ ngựa Đem ủ 37oC, kiểm tra èng sau giê đ råi tiÕp tơc đ thªm 24h Nếu thấy có đông huyết t ơng (ở mức độ nào), chế phẩm có Staphylococcus aureus Bảng 2: Đặc điểm hình thái Staphylococcus aureus môi trờng lựa chọn Môi trờng Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Thạch Thạch Vogel manitol - muối Johnson Màu đen đợc Khuẩn lạc màu bao bọc vàng với một vùng vàng vùng vàng xung quanh Thạch Baird - Parker Khuẩn lạc màu đen bóng, viền quanh vùng sáng rõ - mm *Phản ứng oxydase sinh sắc tố ( Pseudomonas aeruginosa): Lấy khuẩn lạc nghi ngờ đặc trng từ mặt môi trờng thạch cetrimid cấy ria mặt môi trờng thạch Pseudomonas phát Fluorescin môi trờng Pseudomonas phát Pyocyanin hộp Petri Nếu nhiều khuẩn lạc cần đợc cấy truyền, chia bề mặt hộp thành bốn phần, phần cấy loại khuẩn lạc lựa chọn Đậy lật ngợc hộp môi trờng cÊy trun vµ đ ë 35 + 2oC Ýt nhÊt ngày kiểm tra đờng cấy dới ánh sáng đèn tử ngoại Kiểm tra đĩa để xác định có khuẩn lạc đặc trng theo bảng hay không Xác nhận khuẩn lạc nghi ngờ mọc nhiều môi trờng Phát Pseudomonas aeruginosa phản ứng oxydase: Nhỏ lên khuẩn lạc chuyển khuẩn lạc lên mẩu (hoặc khoanh) giấy tÈm tríc N - dimethyl phenylen diamin dihydroclorid NÕu thÊy màu đỏ hồng chuyển sang màu tím, chế phẩm có Pseudomonas aeruginosa Có thể xác định Pseudomonas aeruginosa phép thử sinh hoá nuôi cấy thích hợp khác Bảng Đặc điểm hình thái Pseudomonas aeruginosa môi tr ờng lựa chọn Thạch Thạch Môi trờng Thạch Pseudomonas để Pseudomonas để cetrimid phát phát Fluorescin Pyocyanin Đặc điểm hình Màu lục nhạt Không màu đến Màu vàng nhạt thái khuẩn lạc thông thờng màu vàng nhạt Huỳnh quang ánh sáng tia cực tím Phản ứng oxydase Nhuộm Gram Màu lục Màu vàng Màu xanh nớc biển Dơng tính Dơng tính Dơng tÝnh Trùc khuÈn Trùc khuÈn Trùc khuÈn Gram ©m Gram âm Gram âm b) Tìm Salmonella Escherichia coli Cho chế phẩm vào khoảng 100 ml môi trờng lỏng lactose, đ KiĨm tra nÕu cã vi khn mäc, l¾c nhĐ nhàng Lấy 1ml cho vào ống chứa sẵn 10 ml hỗn hợp môi trờng lỏng selenit - cystin môi trờng lỏng tetrathionat, trộn đều, ủ 18 - 24 h Phần lại môi trờng lactose dùng để tìm Escherichia coli Tìm Salmonella: Lấy quai cấy từ canh thang selenit cystin tetrathionat ria lên mặt môi trờng thạch xanh brilliant, môi trờng thạch bismuth sulfit đĩa Petri Đậy đĩa, lật ngợc, ủ Kiểm tra, không thấy có khuẩn lạc dạng nh mô tả bảng 4, chế phẩm không chứa nòi Salmonella Bảng Đặc điểm hình thái Salmonella môi trờng lựa chọn Môi trờng Thạch xanh brilliant Mô tả khuẩn lạc Khuẩn lạc không màu màu hồng nhạt tới trắng đục, nhỏ, rõ nét (thờng bao quanh vùng màu hồng tới đỏ) Thạch xylose - lysin Khuẩn lạc màu đỏ, chấm đen trung tâm - desoxycholat Thạch bismuth Khuẩn lạc màu đen màu xanh sulfit Nếu thấy khuẩn lạc, đem nhuộm soi thấy gồm trực khuẩn hình gậy, Gram âm phù hợp với mô tả bảng 4, thực tiếp cách chuyển khuẩn lạc nghi ngờ riêng biệt sang ống môi trờng thạch - sắt - ba đờng (nghiêng) Trớc tiên cấy ria mặt thạch nghiêng, sau cấy sâu xuống phần đứng thạch, ủ Kiểm tra không thấy môi trờng bị kiềm hoá (màu đỏ) phần nghiêng acid hoá (màu vàng) phần dựng đứng, có kèm theo màu đen phần dựng đứng sinh H2S Chế phẩm không chứa nòi Salmonella Tìm Escherichia coli: Cấy ria quai cấy từ môi trờng lactose có vi khuẩn mọc bề mặt môi trờng thạch Mac - Conkey Đậy nắp, lật ngợc hộp, ủ Kiểm tra khuẩn lạc phù hợp với mô tả bảng chế phẩm Escherichia coli Nếu có khuẩn lạc phù hợp với mô tả bảng chuyển khuẩn lạc nghi ngờ lên mặt thạch Levine - eosin - xanh methylen đĩa Petri Nếu có nhiều khuẩn lạc nghi ngờ, chia đĩa thành phần, phần cấy loại khuẩn lạc lựa chọn Đậy đĩa, lật ngợc, ủ Kiểm tra khuẩn lạc thể hai đặc tính ánh kim dới ánh sáng phản chiếu, màu ®en xt hiƯn ë ¸nh s¸ng trun qua, mÉu chÕ phẩm Escherichia coli Kết hợp phản ứng thử nghiệm sinh hoá đặc điểm nuôi cấy để kÕt ln sù cã mỈt cđa Escherichia coli chÕ phẩm Bảng 5: Đặc điểm hình thái Escherichia coli thạch Mac - Conkey Đặc điểm hình khuẩn lạc Nhuộm Gram thái Khuẩn lạc màu đỏ gạch, cã vïng mËt kÕt tña bao quanh Trùc khuÈn Gram âm c) Phát Enterobacteria vi khuẩn Gram âm khác Làm đồng chế phẩm đem kiểm tra cách xử lý lợng thích hợp nh mô tả phần chế tạo mẫu thử nghiệm ñ ë 35 - 37 oC mét thêi gian thÝch hợp (thờng từ - h) môi trờng canh thang lactose để phục hồi lại vi khuẩn mà không làm tăng vi khuẩn Lắc bình chứa chuyển lợng đồng chế phẩm tơng đơng khoảng g ml chế phẩm vào 100 ml môi trờng lỏng Enterobacteria Mossel ủ 35 - 37oC 18 - 24 h Cấy lên đĩa thạch muối mật violet-red có chứa lactose glucose ủ ë 35 -37oC 18 - 48 h ChÕ phÈm Enterobacteria không thấy mọc khuẩn lạc vi khuẩn Gram âm đĩa Đánh giá số lợng: ủ lợng thích hợp môi trờng lỏng Enterobacteria - Mossel với lợng chế phẩm đem kiểm tra đợc làm đồng chứa 1,0 g; 0,1 g 10 mg 1,0 ml; 0,1 ml 10 l NÕu cÇn cã thĨ pha lo·ng chÕ phÈm, đ ë 35 -37 oC 24 - 48 h C¸c khuÈn lạc phát triển tốt thờng đỏ đĩa đỏ, nhuộm vi khuẩn bắt màu Gram âm, chứng tỏ kết dơng tính Ghi lợng nhỏ chế phẩm mà cho kết dơng tính lợng lớn chế phẩm mà cho kết âm tính Xác định số lợng Bacteria theo bảng Bảng Tính lợng Bacteria chế phẩm Kết lợng sản phẩm 1,0 g 0,1 g hc 0,01 g hc hc 0,1 ml 0,01 ml ml + + + + + + - Sè Bacteria có gam sản phẩm Lớn 102 Ýt h¬n 102 nhng lín h¬n 10 Ýt h¬n 10 nhng lớn Đếm tổng số nấm, mốc, men Dùng phơng pháp đĩa thạch tơng tù nh ®Õm tỉng sè vi khn hiÕu khÝ, nhng sử dụng môi trờng thạch Sabouraud môi trờng thạch - khoai tây- glucose, ủ đĩa nhiệt độ 20 - 25oC, theo dõi ngày Tìm Clostridia Thử nghiệm thứ dùng cho sản phẩm qui định Clostridia Thử nghiệm thứ hai bán định lợng Clostridium perfringens ỏp dng với sản phẩm có tiêu chuẩn số lợng Clostridium perfringens Thử nghiệm tìm Clostridia Chuẩn bị mẫu thử nh mơc “ chn bÞ thÝ nghiƯm” LÊy hai mÉu để kiểm tra khoảng g (ml) mẫu, cho vào hai bình chứa sẵn 100 ml môi tr ờng tăng sinh cho Clostridia Một mẫu đem đun nóng tới 80oC 10 phút làm lạnh ủ hai mẫu điều kiện kỵ khí, 35 - 37 oC 48h Sau ủ từ bình cấy chuyển sang ống môi trờng thạch Columbia thêm gentamycin tiếp tục ủ 35 - 37 oC 48h NÕu kh«ng thÊy cã vi khuÈn mọc, mẫu thử đạt yêu cầu Khi thấy vi khuẩn mọc, chọn khuẩn lạc điển hình cấy chuyển sang môi trờng thạch Columbia gentamycin ủ hai điều kiện kỵ khí hiếu khí Khi thấy mọc điều kiện kỵ khí, trực khuẩn Gram dơng (có nội bào tử); phản ứng catalase âm tính tức có Clostridium spp Nếu cần so sánh phát triển khuẩn lạc hai đĩa dùng thử nghiệm catalase để loại trừ nòi Bacillus spp kỵ khí hiếu khí có phản ứng catalase dơng tính Thử nghiệm đợc dùng để phân biệt khuẩn lạc dạng thạch cách chuyển vi khuẩn lên phiến kính nhỏ dung dịch nớc oxy già loãng, thấy có sủi bọt nghĩa phản ứng catalase dơng tính Đếm Clostridium perfringens Tạo mẫu thử nh mô tả mơc “chn bÞ thÝ nghiƯm” Pha lo·ng b»ng dung dÞch đệm pepton-natri clorid có pH 7,0 đến dung dịch chÕ phÈm cã nång ®é 10 , 10-3 Tiến hành xác định tổng số vi khuẩn giống nh xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại đợc mục Tiến hành Mỗi lần chuyển 1ml làm đồng sang ống chứa sẵn ml môi trờng sulfit - lactose ống nhỏ Durham Lắc nhẹ nhàng đem ủ 46 + 0,5oC khoảng 24 đến 48 h Các ống có màu đen (sắt sulfid) sinh ống Durham (ít 1/10 thể tích) có Clostridium perfringens Tính lợng Clostridium perfringens theo bảng mục 13.6 Những nòi vi khuẩn dïng ®Ĩ kiĨm tra: Thư nghiƯm thø 1: Clostridium sporogenes ATCC 19404 vµ NCTC 532 Thư nghiƯm thø 2: Clostridium perfringens ATCC 13124 NCTC 6125 Nếu cần, kết hợp với dùng Clostridium perfringens để kiểm tra điều kiện nhạy cảm điều kiện kỵ khí Lặp lại thí nghiệm Khi nghi ngờ, cần đợc thử nghiệm lại nh hớng dẫn với lợng chế phẩm tăng gấp đôi Yêu cầu giới hạn nhiễm khuẩn Nếu dẫn chuyên luận riêng giới hạn nhiễm khuẩn cho loại thuốc có trình sản xuất không tiệt khuẩn nh sau: Bảng Yêu cầu giới h¹n nhiƠm khn Mø c Lo¹i chÕ phẩm Yêu cầu Các chế phẩm dùng cho bỏng vết loét sâu Các chế phẩm dùng chỗ nh chữa xng tấy, tổn thơng, màng nhầy (mũi, họng, tai, âm đạo ) Không có vi khn cã thĨ sèng l¹i g (ml) mÉu thử Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại đuợc không 100 g (ml) Mẫu thử phải Enterobacteria, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, nấm mốc g (ml) Các chế phẩm dùng Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại đợc chỗ cho da nh kem bôi, không 500 g (ml) nớc thơm, dầu, dung Mẫu thử phải Enterobacteria, dịch, bột Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, nấm mèc g (ml) C¸c chÕ phÈm dïng Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại đợc uống; qua trực tràng; không 104 g (ml) thấm qua da Tống số Enterobacteria không 500 g (ml) Nấm mốc không 100 trong1 g (ml) Không đợc có Salmonella 10 g(ml) Mẫu kh«ng cã Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus 1g(ml) Các chế phẩm có chứa nguyên liệu có nguồn gốc thực vật, động vật xử lí theo qui trình làm giảm lợng vi khuẩn Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại đợc 5.104 g (ml) Nấm mốc không 500 g (ml) Tống số Enterobacteria không 500 trong1 g (ml) Không đợc có Salmonella 10 g(ml) Mẫu không cã Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus 1g(ml) ... Chuẩn bị thí nghiệm Lấy mẫu: Đối với thử nghiệm dới đây, thử nghiệm lấy 10ml 10g chế phẩm Cách thử nghiệm: Một mẫu chế phẩm cần xác định giới hạn vi khuẩn phải thực đầy đủ thư nghiƯm sau: §Õm... mô tả bảng 4, thực tiếp cách chuyển khuẩn lạc nghi ngờ riêng biệt sang ống môi trờng thạch - sắt - ba đờng (nghiêng) Trớc tiên cấy ria mặt thạch nghiêng, sau cấy sâu xuống phần đứng thạch, ủ Kiểm... Clostridia Thử nghiệm thứ dùng cho sản phẩm qui định Clostridia Thử nghiệm thứ hai bán định lợng Clostridium perfringens ỏp dng với sản phẩm có tiêu chuẩn số lợng Clostridium perfringens Thử nghiệm tìm