BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ CÔNG THƯƠNG VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM NGUYỄN THỊ TRANG NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT BỘT NẤM MEN GIÀU KẼM LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT THỰC PHẨM BỔ SUNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT Công nghệ sinh học Hà Nội - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ CÔNG THƯƠNG VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM NGUYỄN THỊ TRANG NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT BỘT NẤM MEN GIÀU KẼM LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT THỰC PHẨM BỔ SUNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số chuyên ngành: 62.42.02.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Đức Mạnh TS Nguyễn Thị Minh Khanh Hà Nội - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi số kết nghiên cứu hợp tác với cộng khác Các số liệu, kết Luận án trung thực, khách quan, phần tơi cơng bố tạp chí khoa học chun ngành nước quốc tế, phần lại chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Trang năm 2019 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian học tập nghiên cứu Viện Công nghiệp thực phẩm, biết ơn kính trọng, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Lãnh đạo, Hội đồng Khoa học Đào tạo, Phòng Kế hoạch Khoa học Hợp tác quốc tế, Trung tâm Hóa sinh công nghiệp Môi trường - Viện Công nghiệp Thực phẩm nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận án tiến sĩ Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Đức Mạnh TS Nguyễn Thị Minh Khanh người thầy tận tình hướng dẫn, định hướng, động viên giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Chu Đình Bính cán khoa Hóa Phân tích Trường đại học Bách Khoa Hà Nội giúp đỡ tơi q trình phân tích mẫu Tơi xin cảm ơn bạn đồng nghiệp Viện tạo điều kiện thuận lợi, động viên, khuyến khích tơi q trình học tập nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin gửi lòng ân tình tới gia đình, chồng nguồn động viên, truyền nhiệt huyết giúp tơi hồn thành luận án./ Hà Nội, ngày tháng Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Trang năm 2019 MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 1.1 Giới thiệu nguyên tố vi lượng kẽm 1.1.1 Tầm quan trọng nguyên tố vi lượng kẽm 1.1.2 Nhu cầu kẽm thể 1.1.3 Tình hình thiếu kẽm giới Việt Nam 1.1.4 Những dạng hợp chất phổ biến kẽm hấp thu vào thể 1.2 Đặc tính ưu việt nấm men sản xuất công nghiệp 1.3 Khả hấp thụ kim loại chế tích lũy kẽm tế bào nấm men 11 1.3.1 Khả hấp thụ kim loại nấm men 11 1.3.2 Cơ chế tích lũy kẽm tế bào nấm men 12 1.3.3 Vị trí tích lũy kẽm tế bào nấm men 16 1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới q trình tích lũy kẽm nấm men .17 1.3.4.1 Ảnh hưởng nguồn muối kẽm 17 1.3.4.2 Ảnh hưởng nguồn khoáng 18 1.3.4.3 Ảnh hưởng nguồn cacbon .18 1.3.4.4 Ảnh hưởng nguồn nitơ 20 1.3.4.6 Ảnh hưởng số yếu tố khác .21 1.4 Các phương pháp lên men sử dụng sản xuất sinh khối nấm men giàu kẽm .23 1.4.1 Phương pháp lên men gián đoạn (batch fermentation) 23 1.4.2 Phương pháp lên men gián đoạn bổ sung chất (fed-batch fermentation) 24 1.5 Các nghiên cứu nấm men giàu kẽm 26 1.6 Các phương pháp phá tế bào nấm men 27 1.6.1 Phương pháp học .27 1.6.2 Phương pháp phi học .29 1.6.3 Sử dụng kết hợp phương pháp 32 1.7 Các sản phẩm chức giàu kẽm giới 34 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.1 Vật liệu hóa chất 37 2.2 Dụng cụ thiết bị 38 2.3 Phương pháp nghiên cứu 38 2.3.1 Phương pháp phân tích .38 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 44 2.3.3 Phương pháp xử lí số liệu 53 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54 3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có khả tích lũy kẽm cao từ tự nhiên Sưu tập VSVCN – Viện CNTP .54 3.1.1 Phân lập chủng nấm men 54 3.1.2 Nghiên cứu sàng lọc chủng nấm men có khả tích lũy kẽm cao 57 3.1.3 Xác định đặc tính chủng nấm men tuyển chọn .65 3.2 Nghiên cứu điều kiện lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm 70 3.2.1 Nghiên cứu xác định điều kiện phù hợp cho q trình ni cấy nhân giống chủng nấm men lựa chọn .70 3.2.2 Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng tới trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm .76 3.2.3 Nghiên cứu nâng cao hiệu lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm phương pháp lên men bổ sung chất (Fed-batch fermentation) .98 3.3 Nghiên cứu công nghệ thu hồi tạo sản phẩm bột nấm men giàu kẽm 105 3.3.1 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp phá tế bào nấm men .105 3.3.2 Phương pháp nâng cao chất lượng cảm quan (giảm màu, mùi dịch thủy phân nấm men) 114 3.3.3 Nghiên cứu lựa chọn thơng số q trình sấy phun dịch nấm men 118 3.4 Xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất bột nấm men giàu kẽm hữu quy mô thực nghiệm 123 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .130 Tài liệu tham khảo 133 PHỤ LỤC 151 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần axit amin, khoáng chất vitamin nấm men 10 Bảng 1.2 Những protein vận chuyển kẽm tham gia vào trình cân nội bào kẽm 14 Bảng 1.3 Ảnh hưởng nhiệt độ lên hiệu tự phân nấm men 31 Bảng 1.4 Một số sản phẩm bổ sung kẽm thị trường 35 Bảng 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc, hình thái tế bào, khả lên men rượu sinh khí CO2 chủng nấm men phân lập .55 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ Zn(NO3)2 tới hàm lượng kẽm sinh khối khô chủng nấm men (mg/g) 58 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nồng độ Zn(NO3)2 tới khối lượng sinh khối khô chủng nấm men (g/100 ml) 59 Bảng 3.4 Hàm lượng kẽm hữu tồn 12 chủng nấm men giàu kẽm 62 Bảng 3.5 Khả phát triển điều kiện khác 66 Bảng 3.6 Khả đồng hóa nguồn cacbon chủng nấm men .67 Bảng Ảnh hưởng nồng độ yeast extract tới sinh trưởng phát triển S cerevisiae A112 .72 Bảng 3.8 Ảnh hưởng pH tới sinh trưởng S cerevisiae A112 73 Bảng 3.9 Ảnh hưởng nguồn muối kẽm tới khả tích lũy kẽm sinh khối nấm men 77 Bảng 3.10 Ảnh hưởng nguồn cacbon tới hàm lượng kẽm tích lũy lượng sinh khối khơ chủng nấm men S cerevisiae A112 78 Bảng 3.11 Ảnh hưởng nguồn nitơ tới hàm lượng kẽm tích lũy lượng sinh khối khô chủng nấm men S cerevisiae A112 80 Bảng 3.12 Ảnh hưởng việc bổ sung MgSO4 tới khả sinh trưởng tích lũy kẽm sinh khối nấm men 83 Bảng 3.13 Ảnh hưởng việc bổ sung KH2PO4 tới khả sinh trưởng tích lũy kẽm sinh khối nấm men S cerevisiae A112 84 Bảng 3.14 Kết bổ sung muối Fe2(SO4)3 hàm lượng kẽm tích lũy sinh khối nấm men 85 Bảng 3.15 Ảnh hưởng nhiệt độ tới q trình tích lũy kẽm chủng S cerevisiae A112 88 Bảng 3.16 Ảnh hưởng pH tới q trình tích lũy kẽm chủng S cerevisiae A112 89 Bảng 3.17 Ảnh hưởng chế độ lắc tới q trình tích lũy kẽm chủng 91 Bảng 3.18 Hàm lượng kẽm khối lượng sinh khối sau lên men điều kiện khác 93 Bảng 3.19 Ảnh hưởng nồng độ oxi tới trình tạo sinh khối nấm men giàu kẽm 101 Bảng 3.20 Ảnh hưởng tỷ lệ bi sinh khối nấm men .105 Bảng 3.21 Ảnh hưởng tỷ lệ sinh khối nấm men dung dịch đệm 106 Bảng 3.22 Ảnh hưởng thời gian nghiền bi tới khả thu hồi kẽm .106 Bảng 3.23 Ảnh hưởng tỷ lệ sinh khối dung dịch đệm 107 Bảng 3.24 Ảnh hưởng thời gian phá mẫu tới khả thu hồi kẽm 108 Bảng 3.25 Ảnh hưởng nhiệt độ tới hiệu tự phân 108 Bảng 3.26 Ảnh hưởng pH tới hiệu tự phân 109 Bảng 3.27 Ảnh hưởng thời gian tới trình tự phân 110 Bảng 28 Ảnh hưởng thời gian tới trình thủy phân 112 Bảng 29 Kết sử dụng phương pháp thu hồi dịch chiết nấm men 115 Bảng 30 Ảnh hưởng nồng độ than hoạt tính đến q trình khử màu, mùi dịch chiết nấm men 116 Bảng 31 Ảnh hưởng thời gian đến trình khử màu, mùi dịch thủy phân 117 Bảng 32 Ảnh hưởng nồng độ maltodextrin trình sấy phun 119 Bảng 33 Ảnh hưởng nồng độ dịch chiết tới hiệu xuất thu hồi giá trị cảm quan sản phẩm 120 Bảng 3.34 Ảnh hưởng nhiệt độ đầu vào tới hiệu sấy phun 121 Bảng 3.35 Phân tích chất lượng bột nấm men giàu kẽm 122 Bảng 36 Kết sản xuất bột nấm men giàu kẽm quy mô thực nghiệm 126 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Tình trạng thiếu kẽm giới Hình 1.2 Hình ảnh tế bào nấm men S.cerevisiae Hình 1.3 Sơ đồ vận chuyển kẽm tế bào nấm men 14 Hình 2.1 Quy trình tách phân đoạn kẽm mẫu .40 Hình 3.1 Kết thống kê khả tích lũy kẽm chủng nấm men 61 Hình 3.2 Sắc ký đồ phân tích dạng kẽm sinh khối nấm men 4087 62 Hình 3.3 Sắc ký đồ phân tích dạng kẽm sinh khối nấm men A112 .63 Hình 3.4 Hình thái khuẩn lạc tế bào chủng nấm men tích kẽm cao 65 Hình Trình tự 26S rDNA chủng A112 .69 Hình 3.6 Vị trí phân loại chủng A112 số lồi họ hàng gần 69 Hình 3.7 Ảnh hưởng glucose tới sinh trưởng S cerevisiae A112 71 Hình 3.8 Ảnh hưởng nhiệt độ tới sinh trưởng S.cerevisiae A112 73 Hình 3.9 Ảnh hưởng tốc độ lắc tới sinh trưởng phát triển S.cerevisiae A112 74 Hình 3.10 Ảnh hưởng thời gian nhân giống tới sinh trưởng phát triển S cerevisiae A112 .75 Hình 3.11 Ảnh hưởng nồng độ glucose tới hàm lượng kẽm tích lũy khối lượng sinh khối khơ chủng nấm men S cerevisiae A112 .79 Hình 3.12 Ảnh hưởng nồng độ yeast extract tới hàm lượng kẽm tích lũy lượng sinh khối khô chủng nấm men S cerevisiae A112 .81 Hình 3.13 Ảnh hưởng tỉ lệ tiếp giống tới tích lũy kẽm sinh khối nấm men 86 Hình 3.14 Ảnh hưởng thời điểm bổ sung muối kẽm tới tích lũy kẽm sinh khối nấm men 87 Hình 3.15 Ảnh hưởng thời gian lên men tới q trình tích lũy kẽm chủng S cerevisiae A112 92 Hình 3.16 Kết phân tích JMP hàm lượng kẽm sinh khối hệ số hồi quy thu từ thực nghiệm 94 Hình 3.17 Ảnh hưởng hàm lượng glucose tới lượng sinh khối thu 95 Hình 3.18 Điều kiện tối ưu hiệu suất dự kiến phần mềm JMP .96 Hình 3.19 Động học trình tạo sinh khối nấm men giàu kẽm theo phương pháp lên men gián đoạn 97 Hình 3.20 Ảnh hưởng tốc độ bổ sung chất đến trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm 99 Hình 3.21 Ảnh hưởng thời điểm bổ sung chất tới trình tạo sinh khối nấm men giàu kẽm 100 Hình 3.22 Động học trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm phương pháp lên men bổ sung chất 103 Hình 3.23 Hình ảnh tế bào S cerevisiae kính hiển vi điện tử quét 104 Hình 3.24 Ảnh hưởng bổ sung enzyme vào trình phá tế bào 112 Hình 3.25 Quy trình cơng nghệ sản xuất bột nấm men giàu kẽm quy mô thực nghiệm 123 Hình 3.26 Hình ảnh sản phẩm viên nấm men giàu kẽm 126 Hình 3.27 Nồng độ kẽm huyết (A) mơ (B) chuột thí nghiệm sau uống ZnY, ZnSO4 liều mg/kgP 127 CÁC SỐ LIỆU MINH CHỨNG CHO HÌNH Hình 3.9, 3.10, 3.11, 3.12, Ảnh hưởng glucose, nhiệt độ, chế độ lắc, thời gian nhân giống tới sinh trưởng phát triển S,cerevisiae A112 Khối lượng sinh khối sau nhân nuôi (g/100ml) 0.76 1.07 1.26 1.31 Độ lệch chuẩn 0.07 0.08 0.09 0.08 giống Khối lượng sinh khối sau nhân nuôi (g/100ml) Độ lệch chuẩn 25 0,77 0,06 28 1,2 0,05 30 1,29 0,07 35 0,8 0,06 (vòng/phút) Khối lượng sinh khối sau nhân ni (g/100ml) Độ lệch chuẩn vòng/phút 0,52 0,07 50 vòng/phút 0,85 0,08 100 vòng/phút 1,12 0,07 150 vòng/phút 1,28 0,08 200 vòng/phút 1,29 0,08 Glucose (g/l) 10 50 100 150 Nhiệt độ nhân Chế độ lắc Thời gian nhân giống Khối lượng sinh khối (g/100ml) Độ lệch chuẩn 0h 0,11 0,05 12h 0,83 0,06 24h 1,28 0,07 36h 1,29 0,09 48h 1,28 0,06 Hình 3.28 Ảnh hưởng nồng độ glucose tới hàm lượng kẽm tích lũy khối lượng sinh khối khô chủng nấm men S, cerevisiae A112 Khối lượng sinh khối sau Hàm lượng kẽm sinh Glucôzơ (g/l) nhân nuôi khối 10g/l 0,71 10,58 50g/l 1,06 10,21 100g/l 1,24 10,21 150g/l 1,28 10,2 0,08 0,52 0,09 0,58 0,09 0,56 0,07 0,55 Độ lệch chuẩn Hình 3.29 Ảnh hưởng nồng độ yeast extract tới hàm lượng kẽm tích lũy lượng sinh khối khơ chủng nấm men S, cerevisiae A112 Cao nấm Khối lượng sinh Hàm lượng kẽm sinh men (g/l) khối sau nhân nuôi khối 5g/l 0,61 9,55 10g/l 0,72 10,41 15g/l 0,79 9,25 20g/l 0,79 9,01 stdev 0,84 0,08 0,51 0,97 0,09 0,54 0,97 0,08 0,43 0,96 0,1 0,61 Hình 3.30 Ảnh hưởng tỉ lệ tiếp giống tới tích lũy kẽm sinh khối nấm men Tỷ lệ tiếp Khối lượng sinh khối sau Hàm lượng kẽm sinh giống lên men khối 2% 0,27 10,68 4% 0,51 10,56 6% 0,68 10,41 8% 0,92 10,32 10% 0,96 9,11 stdev 0,05 0,52 0,06 0,68 0,06 0,46 0,07 0,45 0,06 0,49 Hình 3.31 Ảnh hưởng thời điểm bổ sung muối kẽm tới tích lũy kẽm sinh khối nấm men Thời điểm bổ sung Khối lượng sinh Hàm lượng kẽm muối kẽm khối khô (g/100ml) sinh khối 0h 0,73 10,48 4,5h 0,78 10,45 9h 0,85 10,21 13,5h 0,86 8,56 18h 0,87 6,74 Độ lệch chuẩn Độ lệch chuẩn 0,05 0,53 0,07 0,49 0,07 0,45 0,08 0,23 0,07 0,24 Hình 3.32 Ảnh hưởng thời gian lên men tới q trình tích lũy kẽm chủng S cerevisiae A112 Thời gian lên Lượng sinh khối khô Hàm lượng kẽm men (g/100ml) sinh khối 0h 0,09 0,25 6h 0,16 6,54 12h 0,41 9,38 18h 0,69 10,24 24h 0,73 10,46 30h 0,74 10,48 36h 0,75 10,49 48h 0,75 10,5 Độ lệch chuẩn Độ lệch chuẩn 0,05 0,32 0,06 0,49 0,07 0,46 0,06 0,47 0,05 0,51 0,07 0,48 0,06 0,43 0,06 0,49 Hình 3.33 Động học trình tạo sinh khối nấm men giàu kẽm theo phương pháp lên men gián đoạn Thời gian Hàm lượng kẽm Lượng sinh khối Nồng độ đường (h) sinh khối (mg/g) khô (g/100ml) khử (g/100ml) 0h 0,33 0,12 9,1 3h 0,33 0,12 9,1 6h 0,34 0,16 8,9 9h 0,35 0,32 6,4 12h 8,67 0,96 15h 12,38 1,35 2,7 18h 15,36 1,53 1,3 21h 16,09 1,55 1,1 24h 16,26 1,56 27h 16,46 1,56 0,9 30h 16,69 1,56 0,8 33h 16,88 1,55 0,8 36h 16,95 1,53 0,7 Hình 3.34 Ảnh hưởng tốc độ bổ sung môi trường đến trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm Tốc độ tiếp dịch ml/h 100 ml/h 200 ml/h 400 ml/h 1,52 1,71 1,93 1,79 sinh khối (mg/g) 15,18 16,53 17,53 17,89 Độ lệch chuẩn 0,09 0,1 0,09 0,1 0,36 0,46 0,54 0,61 Lượng sinh khối (g/100ml) Hàm lượng kẽm Hình3.35 Ảnh hưởng thời điểm bổ sung chất tới trình tạo sinh khối nấm men giàu kẽm Thời điểm bổ sung chất 3h 6h 9h 12h 15h Lượng sinh khối (g/100ml) 1,81 1,85 1,91 1,98 1,97 Hàm lượng kẽm sinh khối (mg/g) Độ lệch chuẩn 10 17,68 17,61 17,53 17,44 17,21 0,1 0,09 0,11 0,08 0,09 0,36 0,66 0,54 0,61 0,54 Hình 3.36 Động học trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm phương pháp lên men bổ sung chất Hàm lượng kẽm Lượng sinh khối Nồng độ đường Thời gian (h) sinh khối (mg/g) khô (g/100ml) khử (g/100ml) 0h 0,32 0,13 9,2 3h 0,32 0,13 9,1 6h 0,34 0,17 8,8 9h 0,36 0,32 6,3 12h 8,19 0,99 4,1 15h 12,14 1,47 6,6 18h 14,67 1,91 3,6 21h 16,32 2,1 1,2 24h 17,22 2,16 0,9 27h 17,48 2,17 0,9 30h 17,52 2,18 0,9 33h 17,61 2,16 0,8 36h 17,71 2,17 0,8 Hình 3.37 Ảnh hưởng việc bổ sung enzyme vào trình phá tế bào sau tự phân Nồng độ Flavourzyme (%) Hiệu thu hồi kẽm (%) 0% 45,26 0,1% 0,2% 51,38 62,69 0,4% 0,6% 70,15 70,93 Độ lệch chuẩn 4,34 6,45 4,87 6,29 11 Hình 3.38 Nồng độ kẽm huyết (A) mơ (B) chuột thí nghiệm sau uống ZnY, ZnSO4 liều mg/kgP 1h 3h 6h 12h 24h ZnY 2.76 3.78 2.48 1.68 0.99 ZnSO4 1.83 2.58 1.67 1.21 0.79 Độ lệch chuẩn 0.21 0.31 0.25 0.15 0.11 0.15 0.22 0.24 0.14 0.1 Xương Gan Thận Lách Tim ZnY 78 41 27 19 12 ZnSO4 55 27 19 15 Độ lệch chuẩn 11 5 4 Hình ảnh sắc kí đồ phân tích kẽm hữu mẫu nấm men Mẫu 13 12 Mẫu 21 Mẫu 28 Mẫu 29 13 Mẫu Zn calibration y = 114.31x - 833.25 R² = 0.9999 120000 Intensity / cps 100000 80000 60000 40000 20000 0 200 400 600 800 Concentration / ng/mL Xây dựng đường chuẩn phân tích kẽm 14 1000 1200 ... Việt Nam để sản xuất bột nấm men giàu kẽm hữu  Luận án xây dựng quy trình sản xuất bột nấm men giàu kẽm hữu cơ, có ý nghĩa khoa học thực tiễn, để sản xuất thực phẩm bổ sung kẽm từ nấm men với chất... thực phẩm chức cần thiết Những nhu cầu thực tiễn nêu sở để đề tài: Nghiên cứu công nghệ sản xuất bột nấm men giàu kẽm làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm bổ sung thực Mục tiêu nghiên cứu  Xây dựng. .. BỘ CÔNG THƯƠNG VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM NGUYỄN THỊ TRANG NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT BỘT NẤM MEN GIÀU KẼM LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT THỰC PHẨM BỔ SUNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT Chuyên ngành: Công