viện HàN LÂM khoa học công nghệ việt nam ViƯn c«ng nghƯ sinh häc CHÂU NGỌC ĐIỆP NGHIÊN CỨU TÌM KIẾM CÁC HOẠT CHẤT GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ TỪ LỒI SAN HƠ MỀM MENELLA WOODIN Ở VÙNG BIỂN CƠ TƠ Chun ngành: Hóa sinh học Mã số: 9420116 LuËn ¸n tiÕn sÜ sinh häc Hà Nội, 2019 Cơng trình hồn thành tại: Viện Hóa sinh biển, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Viện Hóa sinh Hữu Thái Bình Dương (PIBOC), Liên Bang Nga Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Hồi Nam Viện Hóa sinh biển PGS.TS Đỗ Thị Thảo Viện Công nghệ sinh học Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ phiên thức tại: Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Vào hồi , ngày tháng năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án tại: * Thư viện Quốc gia Việt Nam * Viện Công nghệ sinh học * Trang web Bộ GDĐTDANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Chau Ngoc Diep, Ekaterina G Lyakhova, Dmitrii V Berdyshev, Anatoly I Kalinovsky, Vu Anh Tu, Nguyen Xuan Cuong , Nguyen Hoai Nam, Chau Van Minh, Valentin A Stonik (2015) Structures and absolute stereochemistry of guaiane sesquiterpenoids from the gorgonian Menella woodin Tetrahedron Letters 56: 7001-7004 Vu A Tu, Ekaterina G Lyakhova, Chau N Diep, Anatoly I Kalinovsky, Pavel S Dmitrenok, Nguyen X Cuong, Nguyen V Thanh, Ekaterina S Menchinskaya, Evgeny A Pislyagin, Nguyen H Nam, Phan V Kiem, Valentin A Stonik, Chau V Minh (2015) Polyoxygenated steroids from the gorgonian Menella woodin with capabilities to modulate ROS levels in macrophages at response to LPS Steroids 104: 246–251 Ekaterina G Lyakhova, Chau Ngoc Diep, Dmitrii V Berdyshev, Sophia A Kolesnikova, Anatoly I Kalinovsky, Pavel S Dmitrenok, Vu Anh Tu, Nguyen Xuan Cuong, Nguyen Van Thanh, Nguyen Hoai Nam, Phan Van Kiem, Valentin A Stonik and Chau Van Minh (2016) Guaiane Sesquiterpenoids from the Gorgonian Menella woodin Natural Product Communications 11(7): 913-916 MỞ ĐẦU Các hợp chất tự nhiên chứng minh nguồn nguyên liệu vô tuyệt vời cho khám phá phát triển loại thuốc Từ năm 1981 đến năm 2014, có tới 73% thuốc chống ung thư có mặt thị trường có nguồn ngốc thiên nhiên tổng hợp theo mẫu hình cấu trúc hợp chất tự nhiên Từ năm 1940 đến 2014 có 246 loại thuốc chống ung thư phê duyệt số có 207 loại thiết kế dựa dạng có cấu trúc phân tử nhỏ, loại trừ thuốc có kích thước phân tử lớn vacxin Hơn 77,3% (160 207) loại thuốc chống ung thư có nguồn gốc từ tự nhiên, cho thấy hợp chất tự nhiên nguồn ngun liệu đóng góp cho nghiên cứu loại thuốc chống ung thư Trong 30 năm qua, nghiên cứu hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ sinh vật biển nghiên cứu rộng rãi, tìm nhiều hợp chất có cấu trúc hoạt tính sinh học tốt Cho đến có nhiều thuốc điều trị ung thư có nguồn gốc sinh vật biển FDA Hoa Kỳ chứng nhận bán thị trường hãng lớn giới cung cấp thuốc điều trị ung thư có tên thương mại Prialt® (Ziconotide), Halaven® (Eribulin mesylate), Yondelis® (Trabectedin) Việt Nam nằm khu vực biển Thái Bình Dương, với bờ biển dài 3.260 km từ Bắc xuống Nam, đứng thứ 27 số 157 quốc gia ven biển, quốc đảo lãnh thổ giới Kết thống kê đến thơng báo có 12.000 loài động thực vật biển Việt Nam, có nhiều lồi có độc tố có hoạt tính sinh học tiềm Do vậy, hướng nghiên cứu công nghệ chiết xuất, phân lập hoạt chất theo định hướng hoạt tính sinh học từ nguồn dược liệu biển có trữ lượng lớn rong biển, hải sâm, san hô mềm quan tâm đặc biệt Do vậy, định lựa chọn đề tài khuôn khổ luận án Tiến sỹ: “Nghiên cứu tìm kiếm hoạt chất gây độc tế bào ung thư từ lồi san hơ mềm Menella woodin vùng biển Cơ Tơ” Mục tiêu nghiên cứu đề tài luận án: - Đánh giá số hoạt tính sinh học dịch chiết tổng nhằm định hướng cho nghiên cứu - Nghiên cứu tách chiết, xác định cấu trúc hóa học hoạt tính gây độc tế bào ung thư số hợp chất phân lập từ lồi san hơ mềm Menella woodin thu thập vùng biển Cô Tô - Quảng Ninh Những đóng góp luận án Từ lồi san hơ mềm Menella woodin phân lập, xác định cấu trúc hóa học 17 hợp chất (MW1-MW17) gồm có 08 hợp chất 09 hợp chất đã, chia thành lớp chất sesquiterpenoid steroid Trong có hợp chất steroid Menellsteroid E (MW1), Menellsteroid F (MW2), Menellsteroid G (MW3), Menellsteroid H (MW4) hợp chất sesquiterpenoid (1S,2R,8S,10R)-1,8epoxy-2-hydroxy-guaian-3,5,7-trien-12,8-olide (MW8), (1R,2S,8S,10R)-1,2 dihydroxy-8-methoxy-guaian-3,5,7-trien-12,8-olide (MW9), Menelloide F (MW10) Menelloide G (MW11) Hợp chất MW1 có mức hoạt tính tốt với giá trị IC 50 = 3,02 - 4,69 µg/ml dòng tế bào ung thư thử nghiệm MW4 có mức hoạt động với giá trị IC 50 = 6,72 – 12,65 µg/ml MW6 có giá trị IC50 = 8,05 – 14,40 µg/ml CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Phần tổng quan tài liệu tổng hợp nghiên cứu nước nước đề cập đến vấn đề sau 1.1 Đặc điểm chung san hô mềm 1.2 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính gây độc tế bào ung thư giống Menella 1.2.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.2.2 Tình hình nghiên cứu số lồi san hơ mềm Việt Nam 1.3 Giới thiệu lồi san hô mềm Menella woodin CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Vật liệu - Mẫu san hô mềm Menella woodin thu thập vùng biển thuộc quần đảo Cô Tô, tỉnh Quảng Ninh vào tháng 04/2014 - Tổng số 17 chất phân lập từ lồi san hơ mềm Menella woodin - 07 dòng tế bào ung thư thử nghiệm HepG2 (ung thư gan), HL60 (ung thư máu), KB (ung thư biêt mô), SKMel2 (ung thư da), LU-1 (ung thư phổi), MCF7 (ung thư vú), LNCaP (ung thư tuyến tiền liệt) dòng tế bào lành (NIH/3T3) GS.TS J.M Pezzuto, Trường Đại học Long Island, Hoa kỳ GS Maier J, trường Đại học Milan, Ý cung cấp - Dòng tế bào RAW 264.7 thu từ mơi trường chọn lọc (Manassas, VA) Tế bào nuôi cấy môi trường DMEM bổ sung 10% huyết thai bò (BioloT, St.Peterburg, Russia), gentamicin (50 µg/ml), 37°C với 5% CO tủ nuôi cấy (MCO-18AIC, Sanyo, Japan) 2.2.2 Hóa chất: Các hóa chất dùng cho nghiên cứu tách chiết hợp chất thứ cấp đánh giá hoạt tính sinh học mua hãng uy tín Đức, Mỹ, Ấn Độ Sigma, GIBCO, Invitrogen v.v 2.2.3 Thiết bị: Máy móc thiết bị sử dụng nghiên cứu phân lập hợp chất: Sắc ký lớp mỏng (TLC), Sắc ký lớp mỏng điều chế, Sắc ký cột (CC) Hệ thống sắc ký lỏng trung áp (MPLC), Hệ thống sắc ký lỏng điều chế (Preparative HPLC-Agilent 1100 series) - Viện Hóa sinh hữu Thái Bình Dương (PIBOC), Liên Bang Nga Hệ thống sắc ký lỏng phân tích (HPLC-Agilent 1200 series) - Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Hệ thống lấy mẫu tự động (Fraction collector - DC1200), máy đo điểm nóng chảy (Kofler micro-hotstage), máy đo độ quay cực [α]D (Perkin-Elmer 343 digital polarimeter), đo phổ hồng ngoại (Bruker Tensor 37 FT-IR infrared spectrophotometer), thiết bị đo phổ khối lượng (ESI-MS) (Agilent 1100 HPLCD Trap), máy đo phổ khối lượng phân giải cao (HRESIMS) (Agilent 6510 QTOF LC/MS mass spectrometer) - Viện Hóa sinh hữu Thái Bình Dương (PIBOC), Liên Bang Nga Thiết bị đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Bruker AM500 FTNMR Spectrometer Viện Hóa học Avance III 700 Bruker spectrometer Viện Hóa sinh hữu Thái Bình Dương (PIBOC), Liên Bang Nga Phổ CD (Jasco J-500A spectropolarimeter) Cân phân tích, hệ thống máy đo sinh hóa tự động AU680 Beckman Coulter 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp xử lý mẫu, tạo dịch chiết 2.2.2 Phương pháp phân lập xác định cấu trúc hố học 2.2.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư thử nghiệm 2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính ức chế sản sinh ROS CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết thu mẫu, xử lý, tạo dịch chiết Kết khảo sát cồn ngầm Bắc Hồng Vàn san hô mềm giống Menella phân bố có độ phủ cao độ sâu 8-15 m nước giống Dendronephthya dải đá ngầm Vàn Chảy độ sâu 6-12 m nước (Hình 3.1) Kết phân loại từ mẫu san hô mềm thu từ chuyến khảo sát Bắc Hồng Vàn quần đảo Cơ Tơ xác định lồi san hơ mềm thuộc họ Plexauridae lồi Menella woodin (Hình 3.2) Hình 3.1 Sơ đồ phân bố san hơ mềm theo độ sâu cồn ngầm Bắc Hồng Vàn dải đá ngầm Vàn Chảy vùng biển Cô Tô (Nguồn: Đậu Văn Thảo, 2014) - Tập đoàn: Tập đoàn dạng cây, phân nhánh, nhiều nốt sần sùi, có màu đỏ thẫm Nhánh thường ngắn Đường kính thân từ 2-5 mm, nhánh từ 1-3 mm Có màu đỏ tươi, tua không màu Ảnh mẫu lưu - Polip: đơn polip, phân bố khắp thân nhánh - Vi xương: Vi xương lớp bề mặt thân nhánh có nhiều dạng khơng đều, dạng hình chùy có chiều dài 0,01 - 0,05 mm Ảnh vi xương Hình 3.2 Mơ tả loài Menella woodin (Nguồn: Grasshoff M, 1999; Đậu Văn Thảo, 2014) Xử lý mẫu: mẫu tươi san hô mềm Menella woodrin (5kg tươi) thu thập vùng biển thuộc quần đảo Cô Tô, tiến hành xử lý mẫu tươi, làm khô, tạo bột mịn loại thành phần muối vô Lấy 100 g bột khô mẫu san hô mềm tiến hành tạo dịch chiết phục vụ sàng lọc hoạt tính sinh học 3.2 Kết sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào mẫu dịch chiết thô Bảng 3.1 Kết xác định giá trị IC50 mẫu MW Giá trị IC50 Dòng tế bào MW Ellipticin e SKLU- HepG 15,5 ± 2,53 0,45 MCF LNCa KB 14,1 P 12,50 13,15 ± ± ± 1,59 0,52 1,62 0,47 1.85 0,42 SKMel NIH/3T HL60 17,42 10,03 11,31 16,11 ± ± ± ± 2,06 0,38 1,95 0,46 1,65 0,39 2,06 0,38 ± ± ± ± ± ± ± ± 0,02 0,08 0,09 0,02 0,07 0,03 0,05 0,02 Từ kết trên, nhận thấy mẫu san hơ mềm Menella woodrin có hoạt tính diệt tế bào ung thư thử nghiệm nồng độ khác mức Mẫu cặn chiết MeOH MW ức chế 50% phát triển dòng tế bào ung thư thử nghiệm tiếp tục xác định giá trị IC 50 mẫu dịch chiết, kết cho thấy mẫu MW có hoạt tính mức tương đối tốt với giá trị IC 50 = 10,03 - 17,42 µg/ml (Bảng 3.1) Do vậy, mẫu dịch chiết sử dụng để phân lập, tìm kiếm hoạt chất tiềm 3.3 Kết phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất từ lồi san hơ mềm Menella woodin Bằng cách kết hơp phương pháp sắc ký kết hợp, phân lập xác định cấu trúc 17 hợp chất từ lồi san hơ mềm Menella woodin chia thành lớp chất steroid sesquiterpenoid bao gồm: - 07 Steroid (MW1, MW2, MW3, MW4, MW5, MW6, MW7) - 10 Sesquiterpenoid (MW8, MW9, MW10, MW11, MW12, MW13, MW14, MW15, MW16, MW17) Trong có chất mới: MW1, MW2, MW3, MW4, MW8, MW9, MW10, MW11 (Hình 3.3) MW1 (chất mới) MW8 (chất mới) MW7 MW2, MW3, MW4 (chất mới) MW9 (chất mới) MW13 MW14 MW12 MW10 (chất mới) MW11 (chất mới) MW15 MW16 MW17 Hình 3.3 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ lồi Menella woodin 3.4 Thơng số vật lý hợp chất phân lập 3.4.1 Hợp chất MW1 (Menellsteroid E): 1β,3β,5α,11β-Tetrahydroxycholestan-6-one (chất mới) Chất bột màu trắng, [α]D27 -4,0 (c 0,10, MeOH); (+) ESI-MS m/z: 473 [M+Na]+, 455 [M+Na-H2O]+, 437 [M+Na-2H2O]+, 413, 397, 374, 301, 149; phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS m/z 473.3237 [M+Na]+ (tính tốn lý thuyết cho công thức C22H46O5Na: m/z 473,3232) CTPT: C27H46O5, M = 450 3.4.2 Hợp chất MW2 (Menellsteroid F): Cholest-24-ene-3β,5α,6β,11β-tetraol (chất mới) Chất bột màu trắng, [α]D27 +12,0 (c 0,05, MeOH); (+) ESI-MS m/z: 457 [M+Na]+, 413, 399, 381, 363, 301, 261, 219; phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS m/z 457,3299 [M+Na]+ (tính tốn lý thuyết cho cơng thức C 27H46O4Na: 457,3288) CTPT: C27H46O4, M = 434 10 3.4.3 Hợp chất MW3 (Menellsteroid G): 24-methylcholest-24(28)-ene-3β,5α,6β,11βtetraol (chất mới) Chất bột màu trắng, [α]D27 +4,0 (c 0,15, MeOH); (+) ESI-MS m/z: 471 [M+Na] + , 457, 441, 408, 360, 338, 301, 250; phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS m/z: 471,3450 [M+Na]+ (tính tốn lý thuyết cho cơng thức C 28H48O4Na, 471,3450); CTPT: C28H48O4, M = 448 3.4.4 Hợp chất MW4 (Menellsteroid H): 24-Norcholest-22(E)-ene-3β,5α,6β,11βtetraol (chất mới) Chất bột màu trắng, [α]D27 +5,8 (c 0,12, MeOH); phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS m/z: 443,3124 [M+Na]+ (tính tốn lý thuyết cho cơng thức C26H44O4Cl 443,3137) CTPT: C26H44O4, M = 420 3.4.5 Hợp chất MW5: cholest-3β,5α,6β,11β-tetraol Chất bột màu trắng, [α]D27 -11,3 (c 0,35, MeOH); phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS m/z: 435,3319 [M-H]- (tính tốn lý thuyết cho cơng thức C 27H47O4 435,3317); CTPT: C27H48O4, M = 436 3.4.6 Hợp chất MW6: Menellsteroid B Chất bột màu trắng, [α]D27 -18,5 (c 0,12, MeOH); ESI-MS m/z: 459 [M+Na]+, phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS m/z: 437,3552 [M+H] + (tính tốn lý thuyết cho công thức C27H49O4: 437,3553); CTPT: C27H46O4, M = 434 3.4.7 Hợp chất MW7: (22E,24S)-24-methyl-5α-cholesta-7,22-diene-3β,5,6β,9-tetraol Chất bột màu trắng, CTPT: C28H46O4, M = 446 3.4.8 Hợp chất MW8: (1S,2R,8S,10R)-1,8-epoxy-2-hydroxy-guaian-3,5,7-trien-12,8olide (chất mới) Chất dầu không màu, [α]D26 +217,3 (c 0,15, CHCl3); phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS m/z 283,0938 [M+Na]+ (tính tốn lý thuyết cho cơng thức C15H16O4Na+: 283,0941) CTPT: C15H16O4, M = 260 3.4.9 Hợp chất MW9: (1R,2S,8S,10R)-1,2-dihydroxy-8-methoxy-guaian-3,5,7-trien12,8-olide (chất mới) Chất dầu không màu, [α]D26 +217,3 (c 0,15, CHCl3); phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS 315,1202 [M+Na]+ (tính tốn lý thuyết cho cơng thức C 16H20O5Na+: 315,1205); CTPT: C16H20O5, M = 292 3.4.10 Hợp chất MW10: Menelloide F (chất mới) Chất dầu không màu, [α]D26 +76,0 (c 0,10, CD3OD); UV (MeOH) λmax (log ε) 221 (3,60) nm; CD (c 2,3 × 10-3 M, MeOH): λmax ([θ]): 204 (+17086), 226 (−12304) 14 Hz, H-11) gợi ý cho hợp chất polyhydroxysterol dạng khung cholestan với nhóm CH-O, nhóm >CC= >C=O, Hai tín hiệu metyl singlet phổ 1H-NMR (δH 1,91 1,98) có tương tác HSQC với cacbon δC 8,2 (Me-13) 12,3 (Me-14), tín hiệu metyl doublet (δH 0,85) tương tác với carbon δC 15,1 (Me-15), Nhóm oximetin xác định tín hiệu cộng hưởng δH 4,53 δC 75,7, Cùng với tín hiệu carbonyl γ-lactone δC 171,7 (C-12) nhóm ketal δC 107,0 (C-8), số liệu phổ NMR cho phép dự đoán MW8 sesquitecpen có cấu trúc khung guaiane có chứa hệ liện hợp triene, nhóm chức γ-lactone, ketal oximetin 18 Hình 4.5 Cấu trúc hóa học hợp chất MW8 Vị trí nhóm oximetin C-2 xác định tương tác HMBC H2 C-3, C-4, C-5 C-10 Các tín hiệu proton vùng trường thấp δH 6,23 (H-3) 6,37 (H-6) có tương tác HSQC với tín hiệu δC 139,2 109,1 Tương tác xa HMBC H-3 C-1, C-2, C-4, C14; H3-14 C-3, C-4, C-5; H-6 C-1, C-5, C-6, C-7 H3-13 C-7, C-11, C-12 chứng minh có mặt cấu trúc liên hợp trien với hai nhom metyl C-4 C-11 Xem xét công thức phân tử MW8 với liệu mơ hình hóa phân tử giá trị độ dịch chuyển hóa học C-1 (δC 90,5) C-8 (δC 107,0), gợi ý cho có mặt cầu epoxy C-1/C-8 Các tín hiệu nhóm metilen (δH 1,68 (dd, J =12,7, 6,4 Hz), 2,68 (dd, J =12,7, 11,2 Hz) δC 38,8) gán cho CH2-9 sở tương tác HMBC H2-9 với C-15, C-10, C-8 C-7 Các kiện nêu chứng minh xác cấu trúc phẳng MW8 Lập thể tuyệt đối vị trí C-2 xác định phương pháp Mosher cải tiến (Seco JM, 2004) Xử lý MW8 với (R)(-)- (S)(+)-α-methoxy-α (trifluoromethyl) phenylacetyl chloride cho dẫn xuất tương ứng (S)- (R)-MTPA ester Các tín hiệu 1H-NMR dẫn xuất MTPA ester xác định phổ COSY Phân tích số liệu ΔδH(S–R) cho thấy thay đổi tăng độ dịch chuyển hóa học H-3 (+0.14 ppm) H3-14 (+0.07 ppm) giảm H 2-9 (H-9a: −0.02 ppm, H9b: −0.02 ppm), chứng minh cấu hình 2R MW8 Lập thể cầu epoxy xác định β (1S,8S) sở phân tích phổ ROESY experiment Tương tác NOE rõ ràng từ H-2 sang Me-15 H-10 ghi nhận Phân tích mơ hình tối ưu hóa lượng cho hai dạng lập thể 1S,2R,8S 1R,2R,8R cho thấy tương tác NOE phù hợp cho lập thể β nhóm epoxy Phù hợp với tương tác NOE Me-15 H-9a (δH 1,68, dd, J =12,7; 6,4 Hz) và giá trị số tương tác, H-10 (δH 2.59, dquint J =11,2, 6,6 Hz) nằm vị trí cis với H-9b (δH 2,68, dd, J =12,7; 6.4 Hz), nhiên việc xác định proton H2-9 α hay β kiện chưa đủ để quy kết cấu hình C-10 Tính tốn hóa lượng tử (Quantum-chemical calculations) sử dụng B3LYP (Stephens PJ, 1994) với hệ 6-311G(d,p) PCM (polarisation-continuum 19 model) (Miertuš S, 1981), thực gói phần mềm Gaussian 03W sử dụng cho nghiên cứu sâu lập thể MW8 Cụ thể, lý thuyết TD-DFT (timedependent density functional) sử dụng cho tính tốn phổ ECD Các biến thể GIAO lý thuyết sử dụng để tính số chắn đẳng hướng NMR So sánh phổ ECD theo lý thuyết thống kê trung bình dạng đồng phân 1S,2R,8S,10R (1a), 1S,2R,8S,10S (1b), 1R,2S,8R,10S (1c) 1R,2S,8R,10R (1d) (các dạng đồng phân có tương tác NOE tương tự nhau) với phổ ECD thực tế cho thấy phù hợp phổ thực tế với phổ tính tốn 1a 1b, chứng minh cấu hình tuyệt đố 1S,2R,8S MW8, hoàn toàn phù hợp với kết phổ ROESY phương pháp Mosher Tuy nhiên, phổ ECD tính toán lý thuyết 1a 1b giống nên chưa đủ sở khoa học để xác định lập thể C-10 So sánh giá trị độ dịch chuyển hóa học thực tế theo tính tốn C-9, C-10 Hα-9, Hβ-9 so sánh giá trị số tương tác tính tốn theo lý thuyết JH9α,H9β, 3JH9α,H10 3JH9β,H10 với giá trị thực tế ghi nhận cho phép xác định xác lập thể C-10 Cụ thể, giá trị tính toán δC C-9 (1a) = 44,4, δC C-10 (1a) = 47,3; δC C-9 (1b) = 46,7, δC C-10 (1b) = 437 ppm cho thấy khác biệt giá trị độ dịch chuyển hóa học hai dạng đồng phân: ∆δC(10-9) = δC10 − δC9: ∆δC(10-9) (1a) = +2,9 ppm, ∆δC(10-9) (1b) = −3,0 ppm Giá trị tương ứng thực tế thu ∆δC(10-9) (MW8) = +1.2 ppm Giá trị số tương tác spin-spin tính tốn là: 2JH9α,H9β (1a) = −11,9, 3JH9α,H10 (1a) = 5,4, 3JH9β,H10 (1a) = 10,1 2JH9α,H9β (1b) = −12,1, 3JH9α,H10 (1b) = 8,3, 3JH9β,H10 (1b) = 3,2 Hz Các giá trị tính tốn cho dạng đồng phân 1a hồn tồn phù hợp với giá trị thực tế ghi nhận 2JH9a,H9b (MW8) = 11,2 Hz, 3JH9a,H10 (MW8) = 6,4 3JH9b,H10 (MW8) = 11,2 Hz Các kiện nêu cho phép xác định cấu hình H-9a δH 1,68 α, H-9b δH 2,68 β Me15 α Điều này, với kết phổ ROESY chứng minh cấu hình tuyệt đối MW8 1S,2R,8S,10R Hơn nữa, giá trị [α]D 1S,2R,8S,10R- MW8 CDCl3 tính tốn theo phương pháp B3LYP/6-311G(d,p) (Stephens PJ, 1994) Dấu dương và giá trị thống kê trung bình [α]D,calc = +513,7 phù hợp với giá trị thực tế [α]D,exp = +217,3 Từ tất kiện nêu, cấu trúc hóa học MW8 chứng minh (1S,2R,8S,10R)-1,8-epoxy-2-hydroxy-guaian-3,5,7-trien-12,8-olide Đây hợp chất 4.1.9 Hợp chất MW9: (1R,2S,8S,10R)-1,2-dihydroxy-8-methoxy-guaian-3,5,7-trien12,8-olide (chất mới) 20 Phổ HR-ESI-MS hợp chất MW9 xuất pic ion giả phân tử m/z 315,1202 [M+Na]+ cho phép xác định công thức phân tử C 16H20O5 Phân tích tín hiệu phổ 1H 13C-NMR (CDCl3) cho phép xác định hợp chất có cấu trúc tương tự MW8, MW9 có hai nhóm OH nhóm metoxi Tuy nhiên, tín hiệu H-10, H-9 và proton trao đổi bị chồng lấp δH 2,36 dung mơi đo NMR chuyển sang C6D6 Hình 4.6 Cấu trúc hóa học hợp chất MW9 Thực tế, phổ H-NMR đo C6D6 (Bảng 3.9) xuất thêm tín hiệu CH singlet δH 2,85, có tương tác HSQC với tín hiệu cacbon δC 49,8, tín hiệu C-1 δC 79,2 bị dịch chuyển mạnh phía vùng trường cao so sánh với tín hiệu MW8 Nhóm metoxi xác định C-8, dựa tương tác HMBC O Me với C-8 Ngoài ra, phổ 2D-NMR bao gồm COSY, HSQC HMBC với phổ khối lượng chứng minh cho có mặt cấu guaian-12,8-olide liên hợp trien với hai nhóm OH C-1 C-2 nhóm metoxi C-8 Tuy nhiên, giá trị độ quay cực âm lớn ([α] 26D −205,7) với phổ ECD đảo ngược so với MW8 cho phép dự đốn thay đổi lớn hóa lập thể hai hợp chất Theo tính tốn cho thấy, phổ ECD phụ thuộc lớn vào lập thể vòng cạnh dạng hình học hệ trien Do cấu trúc vòng cạnh linh động, việc lựa chọn khác có dạng lập thể để phù hợp với tất các số liệu NMR ECD thực nghiệm trở thành vấn đề khó giải Do đó, cấu hình tương đối tuyệt đối MW9 xác định dựa so sánh phổ NMR ECD tính tốn cho cấu dạng bền dạng đồng phân MW9 với số liệu thực tế đo Lập thể tương đối MW9 dự đốn sở phân tích số tương tác kết phổ ROESY Tín hiệu tương tác NOE rõ ràng proton metoxi với H-9 δH 2,16 (dd, J =13,7, 1,7 Hz) kỹ thuật đo 1D NOE, số tương tác H-9 δH 2.35 (dd, J =13.7, 11.6 Hz) H-10 δH 2.27 (dqd, J =11.6, 6.6, 1.7 Hz) khẳng định rõ ràng vị trí trans-diaxial H-10 H-9 δH 2.35 (JH9,H10 = 11.6 Hz) vòng cạnh có cấu hình dạng ghế bền Tương quan NOE H-2 hai H-10 21 Me-15 Me-15 H 2-9 chứng minh hai nhóm OH Me-15 nằm phía so với mặt phẳng phân tử, nhóm metoxi nằm phía đối diện So sánh số liệu phổ NMR tính tốn thực tế cho thấy có cấu trúc 1R*,2S*,8S*,10R* với vị trí equatorial nhóm Me-15 phù hợp với tất kiện phổ NMR thu được, bao gồm số tương tác 2JH9α,H9β, 3JH9α,H-10 3JH9β,H-10; tỷ lệ số ζ1 = 3JH9β,H10/3JH9α,H10; giá trị độ dịch chuyển hóa học δC (C-15); dấu giá trị tương quan độ dịch chuyển hóa học ΔδC(10-9) = δC10 − δC9 Gán số liệu NMR thu với dạng đồng phân khác nhận sai khác lớn số tương tác giá trị ΔδC(10-9) tính tốn thực tế Thêm nữa, tính tốn phổ ECD cho dạng đồng phân 1R,2S,8S,10R MW9 sử dụng lý thuyết TDDFTB3LYP/6-311G(d,p) PCM, cho thấy tương đồng đường cong CD so với phổ ECD thực tế đo đảo ngược so với phổ ECD tính tốn cho dạng đồng phân 1S,2R,8R,10S Như vậy, so sánh chi tiết số liệu thực tế thu với số liệu tính tốn theo lý thyết cho phép xác định cấu trúc hóa học MW9 (1 R,2S,8S,10R)-1,2dihydroxy-8-methoxy-guaian-3,5,7-trien-12,8-olide Điều khẳng định thêm sau tính tốn giá trị [α]D CHCl3 dạng lập thể 1R,2S,8S,10R-MW9 sử dụng phương pháp B3LYP-SCRF/6-311G(d,p) Dấu âm giá trị trung bình thống kê lớn [α]D,calc = −594o phù hợp với số liệu thực tế đo [α]D,exp = −207o Hợp chất MW9 chất 4.1.10 Hợp chất MW10: Menelloide F (chất mới) Hợp chất MW10 phân lập dạng dầu với công thức phân tử, C 15H18O4, xác định phổ HR-ESI-MS m/z 285,1098 [M+Na]+ (tính tốn lý thuyết cho công thức C15H18O4Na+, 285,1097) 297,0911 [M+Cl]− (tính tốn lý thuyết cho cơng thức C15H18O4Cl−, 297,0899) Hình 4.7 Cấu trúc hóa học hợp chất MW10 22 Các phổ NMR MW10 đặc trưng cho hợp chất sesquitecpen dạng khung guaiane, thành phần hóa học lồi Menella (Li L, 2008; Zhang W, 2004) Trên phổ 13C-NMR (đo CDCl3) xuất 15 tín hiệu cacbon bao gồm liên kết đơi đầu mạch [δC 154,2 (C-4) 106,8 (C-14)], liên kết đơi bị hồn tồn [δC 157,4 (s, C-7) 126,0 (C-11)], cacbon đioxi [δC 106,2 (C-8)], cầu epoxy [δC 6IV.2.1 (d, C-9) 63,2 (s, C-10)], cacbonyl lacton [δC 172,5 (C-12)] hai nhóm metyl bậc ba [δC 8,2 (C-13) 25,5 (C-15)] Các tín hiệu proton cacbon nhóm metyl bị dịch chuyển mạnh phía vùng trường cao δH 1,82 (H13) δC 8,2 (C-13) chứng minh cho vị trí liên kết lên liên kết đơi nằm cạnh nhóm cacbonyl lacton Nhận định khẳng định tương tác HMBC H-13 (δH 1,82) với C-7 (δC 157,4), C-11 (δC 126,0) C-12 (δC 172,5) Tương tác xa HMBC H-6 (δH 2,28 2,37) với C-7 (δC 157,4), C-8 (δC 106,2) C-11 (δC 126,0); H-9 (δH 3,34) với C-1 (δC 48,1), C-7 (δC 157,4) C-15 (δC 25,5); H-15 (δH 1,41) với C-1 (δC 48,1), C-9 (δC 64,1) C-10 (δC 63,2), chứng minh cho vị trí cacbon đioxi cầu epoxoy tương ứng C-8 C-9/C-10 Phân tích chi tiết tương tác HMBC khác cho phép xác định cấu trúc phẳng MW10 giống với 1-deoxymenverin F menverin G (Li L, 2008) Tuy nhiên, so sánh số liệu phổ NMR hợp chất cho thấy khác biệt độ dịch chuyển hóa học (Bảng 3.10) Các phổ 1D 2D-NMR MW10 tiến hành đo lại dung môi DMSO-d6 Trên phổ NOESY (đo DMSO-d6), proton H-15 (δH 1,33) có tương tác với H-1 (δH 2,45) H-9 (δH 3,24) gợi ý cho cấu hình β H-1, H-3 nhóm metyl C15 Để xác định lập thể H-5, phổ NOE different đo Kích sung vào tín hiệu proton H-1 (δH 2,45) H-5 (δH 2,38) gây hiệu ứng tăng cường tín hiệu H-15 (δH 1,32) chứng minh H-1, H-5 nhóm metyl C-15 nằm phía Cấu hình β nhóm hydroxyl C-8 xác định phổ CD với xuất đỉnh âm π-π* Cotton vùng λ 205–235 nm ([θ]226 = −12304) (Li L, 2008; Uchida and Kuriyama, 1974) Ngoài ra, hiệu ứng ảnh hưởng mạnh pyridine (Demarco PV, 1968) với tín hiệu H-9 (Δδ −0.41) từ nhóm hydroxyl C-8 chứng minh chúng nằm phía Như vậy, cấu trúc hóa học MW10 xác định cho chất đặt tên menelloide F 23 4.1.11 Hợp chất MW11: Menelloide G (chất mới) Hợp chất MW11 phân lập dạng chất bột vơ định hình có cơng thức phân tử C15H18O5 xác định sở píc ion m/z 301,1044 [M+Na]+ nhận phổ HR-ESI-MS Phân tích số liệu phổ 1H 13C-NMR cho thấy hợp chất dạng khung guaiane Hình 4.8 Cấu trúc hóa học hợp chất MW11 Phổ 13 C-NMR HSQC chứng minh có mặt nhóm cacbonyl γ- lactone δC 171,8, cacbon hemiacetal δC 105,5, ba cacbon mang ôxi (δC 62,7, 76,7 77,5), liên kết đôi đầu mạch δC 151,9 107,0, liên kết đơi bị hồn tồn (δC 125,9, 156,9), hai nhóm metyl (δC 8,5, 20,7), ba nhóm metilen (δC 24,3, 30,2, 31,6) nhóm metin δC 41,7, Phân tích chi tiết số liệu phổ 1D 2D-NMR cho thấy tương đồng MW11 menverine F (Li L, 2008) khác vị trí nhóm chức ơxi Vị trí nhóm hydroxyl xác định dựa tương tác HMBC proton trao đổi δH 4,59 (C8-OH) C-8 (δC 105,5), C-9 (δC 77,5) δH 2,86 (C9-OH) với C-9 (δC 77,5) C-10 (δC 62,7) Cầu epoxy xuất thêm C-1/C-10 khẳng định dựa phân tích độ bất bão hòa phù hợp độc dịch chuyển hóa học C-8 (δC 105,5), C-1 (δC 76,7) Me-15 (δH 1,60; δC 20,7) Vị trí nhóm chức khác chứng minh phổ COSY HMBC, phân tích chi tiết tương tác phổ 1H-1H COSY cho phép xác định mảnh cấu trúc H2-2/ H2-3 H-5/H2-6 Tín hiệu tương tác xa HMBC Me-13 với ba cacbon (C-7, C-11 C-12), Me-15 với C-10, H-9 với C-1, C-7, C-8 C-10 H 214 với C-3, C-4 C-5 cho phép xác định xác cấu trúc phẳng MW11 Cấu hình nhóm hydroxyl C-8 xác định β (8R) sử hiệu ứng Cotton âm nhận phổ CD vùng bước sóng λ 205–235 nm [θ]224 = −9833 (Li L, 2008; Uchida I, 1974) Ngoài ra, tương quan NOE nhận H-9 (δH 4,33) proton trao đổi δH 4,59 (HOC-8)/H-5 (δH 2,88), Me-15 (δH 1,60) H-9 (δH 4,33)/Hβ-2 (δH 2,25) H-5 (δH 2,88) Hβ-2 (δH 2,25)/Hβ-6 (δH 2,80) Các kiện chứng minh H-5, H-9, Me-15 nhóm hydroxyl C-8 có cấu 24 hình β, nhóm 1,10-oxirane nhóm hydroxyl C-9 có cấu hình α Như vậy, hợp chất MW11 xác định chất đặt tên menelloide G 4.1.12 Hợp chất MW12: Menverin A Phổ 1H 13C-NMR MW12 tương tự phổ tương ứng MW11, Sự khác biệt dễ nhận thấy tín hiệu hai nhóm oximetin carbon mang oxy thay vào tín hiệu nhóm metin [δC 55,41] liên kết đơi bị ba vị trí [δC 148,79 (C, C-8) 119,45 (CH, C-9)/δH 5,79 (1H, s, H9)] phổ MW12 so với MW11 Từ kiện thu được, số liệu phổ 13CNMR MW12 so sánh với số liệu công bố hợp chất menverin A, sesquitecpen dạng khung guaiane phân lập từ loài Menella verrucosa (Zhang W, 2004) Sự phù hợp hoàn toàn số liệu phổ NMR hai hợp chất cho phép khẳng định hợp chất MW12 menverin A 4.1.13 Hợp chất MW13: Menverin B Hợp chất MW13 phân lập dạng dầu khơng màu Các phổ NMR đặc trưng cho hợp chất sesquitecpen dạng khung guaiane Số liệu phổ 13CNMR MW13 gần trùng khớp so với số liệu tương ứng MW12, ngoại trừ dịch chuyển mạnh phía vùng trường cao tín hiệu cacbon nhóm metyl C-15 δC 22,48 phổ MW13 so với tín hiệu tương ứng δC 29,85 (C15) phổ MW12 So sánh số liệu phổ 13C-NMR MW13 với số liệu cơng bố, kết hợp với phân tích chi tiết phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều COSY, HMBC ROESY cho phép khẳng định hợp chất menverin B (Zhang W, 2004) 4.1.14 Hợp chất MW14: Menverin C Số liệu phổ 1H 13C-NMR MW14 tương tự số liệu tương ứng MW13 cho phép dự đốn hai hợp chất có cấu trúc hóa học tương tự Sự khác biệt dễ nhận thấy số liệu phổ hai hợp chất xuất tín hiệu carbon bậc bốn mang ôxi (δC 85,23) phổ MW14 thay cho nhóm metin phổ MW13 Tương tác xa HMBC nhận H-15 (δH 1,55) C-1 (δC 85,23)/C-9 (δC 116,30)/C-10 (δC 73,55) chứng minh vị trí nhóm hydroxyl xuất thêm C-1 Phân tích chi tiết tương tác HMBC khác với phù hợp hoàn toàn số liệu phổ 13C-NMR MW14 với số liệu công bố cho phép xác định hợp chất menverin C (Zhang W, 2004) 4.1.15 Hợp chất MW15: Menverin F 25 Các phổ NMR MW15 tương tự phổ MW10 cho phép dự đoán hai hợp chất có cấu trúc hóa học tương tự Sự khác biệt dễ nhận thấy xuất tín hiệu cacbon mang ơxi (δC 83,63) phổ MW15 thay cho nhóm metin phổ MW10 Tương tác xa HMBC nhận H15 (δH 1,50) C-1 (δC 83,63)/C-9 (δC 65,39)/C-10 (δC 62,50) chứng minh vị trí nhóm hydroxyl xuất thêm C-1 Ngoài ra, phù hợp số liệu phổ 13C-NMR MW15 với số liệu công bố kết hợp với phân tích chi tiết tương tác HMBC, cho phép xác định hợp chất MW15 menverin F (Li L, 2008) 4.1.16 Hợp chất MW16: Menelloide B Các phổ NMR MW16 đặc trưng cho hợp chất sesquitecpen dạng khung guaiane, Ngoài ra, phù hợp số liệu phổ 13C-NMR MW16 với số liệu cơng bố kết hợp với phân tích chi tiết tương tác HMBC, cho phép xác định hợp chất MW16 Menelloide B (Kao SY, 2011) 4.1.17 Hợp chất MW17: 1S*,4S*,5S*,10R*-4,10-Guaianediol Các phổ NMR MW17 đặc chưng cho hợp chất sesquiterpene Trên phổ 1H-NMR 13C-NMR xuất tín hai cacbon mang ơxi [δC 80,23 (C-4) 75,29 (C-10)], liên kết đôi bị ba vị trí [δC 121,34 (CH, C-6) 149,65 (C, C-7)/δH 5,50 (1H, br d, J = 2,0 Hz, H-6)], hai nhóm metyl bậc ba [δC 22,56 (C-14) 21,44 (C-15)/δH 1,21 (H-14) 1,29 (H-15), tín hiệu 3H, s] Ngồi ra, hai nhóm metyl bậc hai xác định tín hiệu proton cộng hưởng δH 0,98 (6H, d, J = 7,0 Hz, H-12 H-13) Từ kiện thu được, số liệu phổ 13C-NMR so sánh với số liệu công bố hợp chất 1S*,4S*,5S*,10R*-4,10-guaianediol, sesquitecpen phân lập từ lồi san hơ mềm Sinularia sp (Zhang GW, 2006a) Sự phù hợp hoàn toàn số liệu phổ kết hợp với phân tích chi tiết tương tác HMBC cho phép xác định hợp chất MW17 1S*,4S*,5S*,10R*-4,10-guaianediol 4.3 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư thử nghiệm hợp chất phân lập Kết cho thấy, 17 hợp chất có hợp chất thể hoạt tính tốt MW1, MW4, MW6 MW10 Hợp chất MW1 có mức hoạt tính tốt với giá trị IC50 = 3,02 - 4,69 µg/ml tất dòng tế bào ung thư khác nhau, MW4 có mức hoạt động với giá trị IC 50 = 6,72 - 12,65 µg/ml MW6 có giá trị IC 50 = 8,05 - 14,40 µg/ml, hợp chất MW10 thể hoạt tính trung bình dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 khoảng 25,49 - 55,63 µg/ml 26 Trong đó, xét góc độ hợp chất có cấu trúc hóa học tương tự nhóm hợp chất MW1, MW4, MW6 cho thấy hợp chất cholest-1β,3β,5α,6β-tetrol phân lập từ lồi san hơ sừng Muriceopsis flavida thể hoạt tính tốt dòng tế bào ung thư phổi (A549) với giá trị IC50 = 4,2 ± 1,5 µg/ml u xương ác tính (MG63) với giá trị IC50 = 4,3 ± 1,3 µg/ml, đặc biệt hợp chất thể hoạt tính tương tự chất đối chứng dương adriamycin (IC50 = 2,8 µM A549 IC50 = 3,4 µM MG63) Mặt khác, hợp chất cholest-1β,3β,5α,6β-tetrol gây apoptosis dòng tế bào ung thư phổi (A549) (Liu TF, 2013) Như vậy, nhận định hợp chất steroid MW1, MW4, MW6 phân lập có hoạt tính tốt có tiềm việc nghiên cứu chế tác dụng ức chế phát triển tế bào ung thư 4.4 Hoạt tính ức chế sản sinh ROS Kết cho thấy, hợp chất MW1 MW4 làm giảm hình thành ROS đại thực bào với giá trị 34,03 ± 4,2% (p < 0,05) 27,97 ± 1,7% (p < 0,05) Hợp chất MW6 thể tác dụng hiệu giảm ROS tế bào Raw 264.7 mức 39,16 ± 7,3% (p < 0,05), so sánh với LPS Ngược lại, hợp chất MW3 MW5 lại làm tăng mức độ biểu ROS đại thực bào, nhiên chưa mức có ý nghĩa (p > 0,05) (Hình 3.8) Một nghiên cứu khác cho thấy, hợp chất menellsteroid A (26) có cấu trúc tương tự phân lập từ loài Menella sp thể hoạt tính ức chế sản sinh nitric oxide (NO) đại thực bào cảm ứng lipopolysaccharide (LPS) từ E.coli mức khiêm tốn với giá trị IC50 = 33,9 µM (đối chứng dương aminoguanidine với giá trị IC50 = 25,0 µM) (Chai XY, 2010) Đã có nhiều nghiên cứu cho rằng, tăng ROS tế bào ung thư góp phần vào thay đổi sinh hóa phân tử cần thiết cho khởi đầu, thúc đẩy tiến triển khối u khả chống khối u hóa trị Do đó, tăng ROS tế bào ung thư tạo hội để loại bỏ tế bào ung thư thông qua việc tăng cao ROS lên mức độc hại tế bào, từ kích hoạt đường chết tế bào ROS gây ức chế tế bào ung thư Kết đạt cách sử dụng tác nhân làm tăng ROS ức chế trình chống oxy hóa kết hợp hai (Galadaria S, 2017) Từ đây, chúng tơi nhận định hợp chất MW1, MW4 MW6 ức chế phát triển tế bào ung thư thông qua ức chế tác động ROS 27 Hoặc làm tăng ROS hợp chất MW3 MW5 Ngoài ra, hợp chất cho có tiềm cho nghiên cứu chất chống nội độc tố, điều hòa miễn dịch bảo vệ tế bào KẾT LUẬN Trong trình thực luận án, kết luận án thu tóm tắt sau: Đây nghiên cứu từ lồi san hơ mềm Menella woodin, tiến hành phân lập, xác định cấu trúc hóa học 17 hợp chất (MW1-MW17) gồm có 08 hợp chất 09 hợp chất biết chia thành lớp chất sesquiterpenoid steroid Các chất Menellsteroid E (MW1), Menellsteroid F (MW2), Menellsteroid G (MW3), Menellsteroid H (MW4) thuộc lớp chất steriod chất (1S,2R,8S,10R)-1,8-epoxy-2-hydroxy-guaian-3,5,7-trien-12,8-olide (MW8), (1R,2S,8S,10R)-1,2 (MW9), dihydroxy-8-methoxy-guaian-3,5,7-trien-12,8-olide Menelloide F (MW10) Menelloide G (MW11) thuộc lớp chất sesquiterpenoid Các hợp chất phân lập đánh giá hoạt tính ức chế phát triển 07 dòng tế bào ung thư (HepG2, HL-60, KB, SK-Mel2, LU-1, MCF7, LNCaP) 01 tế bào lành (NIH/3T3) Hợp chất Menellsteroid E (MW1) có mức hoạt tính tốt với giá trị IC50 = 3,02 - 4,69 µg/ml tất dòng tế bào ung thư khác nhau, Menellsteroid H (MW4) có mức hoạt động với giá trị IC 50 = 6,72 - 12,65 µg/ml Menellsteroid B (MW6) có giá trị IC50 = 8,05 - 14,40 µg/ml Nghiên cứu nồng độ 10 µM, hợp chất Menellsteroid E (MW1), Menellsteroid H (MW4) Menellsteroid B (MW6) cho thấy tác dụng làm giảm mức độ biểu ROS đại thực bào với giá trị 34,03 ± 4,2; 27,97 ± 1,7%; 39,16 ± 7,3% (p < 0,05) KIẾN NGHỊ Trên sở kết thu được, tác giả kiến nghị mở rộng nghiên cứu sâu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lớp chất steroid, sesquiterpenoid san hô mềm nhằm nghiên cứu ứng dụng Cần khai thác theo quy trình nghiên cứu để tạo nguồn nguyên liệu chất có hoạt tính sinh học tốt cho thử nghiệm sâu chế tác động sinh học hợp chất mà khuôn khổ luận án chưa có điều kiện nghiên cứu 28 ... hải sâm, san hô mềm quan tâm đặc biệt Do vậy, định lựa chọn đề tài khn khổ luận án Tiến sỹ: Nghiên cứu tìm kiếm hoạt chất gây độc tế bào ung thư từ lồi san hơ mềm Menella woodin vùng biển Cơ... CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1 Hoạt tính gây độc tế bào dịch chiết thơ Từ kết trên, nhận thấy mẫu san hô mềm Menella woodrin có hoạt tính gây độc tế bào ung thư thử nghiệm nồng độ khác mức... hợp nghiên cứu nước nước đề cập đến vấn đề sau 1.1 Đặc điểm chung san hơ mềm 1.2 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính gây độc tế bào ung thư giống Menella 1.2.1 Tình hình nghiên cứu