TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH –KTNN ====== NGUYỄN VÕ HÀ THU NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người động vật HÀ NỘI, 2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH –KTNN ====== NGUYỄN VÕ HÀ THU NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC DICLOFENAC NATRI CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người động vật Người hướng dẫn khoa học ThS Phạm Thị Kim Dung HÀ NỘI, 2019 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, Ban chủ nhiệm khoa, thầy, cô giáo Sinh – KTNN, thầy cô giáo Viện nghiên cứu khoa học ứng dụng trường Đại học Sư phạm Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ em q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Th.S Phạm Thị Kim Dung người theo sát hướng dẫn em q trình hồn hồn thành khóa luận tốt nghiệp Do lần làm nghiên cứu khoa học mặt kiến thức em nhiều hạn chế, nên việc thiếu sót khơng thể tránh khỏi Vì em mong góp ý q thầy, bạn sinh viên để khóa luận cuả em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2019 Sinh viên Nguyễn Võ Hà Thu LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn Th.S Phạm Thị Kim Dung Những số liệu kết hồn tồn trung thực khơng trùng lặp với đề tài khác Nếu sai xin chịu hoàn toàn trách nhiệm Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2019 Sinh viên Nguyễn Võ Hà Thu MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Nội dung nghiên cứu NỘI DUNG CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan chủng vi khuẩn 1.1.1 Vị trí, phân loại Gluconacetoacter xylinus 1.1.2 Đặc điểm Gluconacetoacter xylinus 1.1.3 Môi trường nuôi cấy Gluconacetoacter xylinus 1.1.4 Đặc điểm cấu trúc màng tạo từ Gluconacetoacter xylinus 1.1.5 Tính độc đáo màng cellulose vi khuẩn 1.1.6 Ứng dụng màng cellulose vi khuẩn 1.2 Tổng quan thuốc Diclofenac natri 1.2.1 Sơ lược thuốc Diclofenac natri 1.2.1.1 Công thức 1.2.1.2 Nguồn gốc tính chất 1.2.1.3 Dược động học tác dụng 1.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng thuốc Diclofenac natri 1.3.1 Tình hình nghiên cứu ứng dụng thuốc Diclofenac natri giới 1.3.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng thuốc Diclofenac natri Việt Nam CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Chủng vi khuẩn 2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 2.1.3 Thiết bị dụng cụ 2.2 Phạm vi, nội dung nghiên cứu, địa điểm, thời gian nghiên cứu 10 2.2.1 Phạm vi nghiên cứu 10 2.2.2 Nội dung nghiên cứu 10 2.2.3 Địa điểm nghiên cứu 10 2.2.4 Thời gian nghiên cứu 10 2.3 Phương pháp nghiên cứu 10 2.3.1 Phương pháp chế tạo vật liệu cellulose 10 2.3.1.1 Lên men thu vật liệu cenlulose từ môi trường nước vo gạo 11 2.3.1.2 Xử lý vật liệu cenllulose trước hấp thụ thuốc 11 2.3.1.3 Đo độ dày màng 12 2.3.1.4 Đánh giá độ tinh khiết vật liệu màng cellulose 12 2.3.2 Xây dựng đường chuẩn 13 2.3.3 Xác định lượng thuốc hấp thụ vào vật liệu cellulose 14 2.3.4 Phương pháp xử lý thống kê 15 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 16 3.1 Kết tạo loại vật liệu cellulose 16 3.2 Phương trình đường chuẩn thuốc Diclofenac natri 18 3.3 Khối lượng thuốc Diclofenac natri hấp thu vào màng 21 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 23 TÀI LIỆU THAM KHẢO 24 DANH MỤC HÌNH Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo thuốc Diclofenac natri Hình 3.1 Màng dày 0,5 cm 16 Hình 3.2 Màng nuôi cấy môi trường nước vo gạo 17 Hình 3.3 Màng dày 0,5 cm 17 Hình 3.4 Màng tinh chế 18 Hình 3.5 Màng gạo tinh khiết 0, cm; d = 1,5 cm 18 Hình 3.6 Phương trình đường chuẩn Diclofenac natri OD = 283 19 Hình 3.7 Rút mẫu đo 20 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Môi trường lên men tạo vật liệu cenlulose 11 Bảng 3.1 Giá trị OD màng sau khoảng thời gian 20 Bảng 3.2 Lượng thuốc Diclofenac natri hấp thụ vào màng gạo sau 21 Bảng 3.3 Hiệu suất hấp thụ thuốc Diclofenac natri vào màng gạo sau 22 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Màng cellulose tạo từ Gluconacetoacter xylinus loại màng sinh học đặc biệt có cấu trúc đặc tính giống với cellulose thực vật Tuy nhiên màng cellulose vi khuẩn khác với màng cellulose thực vật ở: màng cellulose vi khuẩn có đặc tính dẻo dai, bền màng cellulose thực vật màng cellulose vi khuẩn không chứa hợp chất cao phân tử như: ligin, peptin, sáp nến, [9] … Cellulose tạo từ Gluconacetoacter xylinus có số tính chất hóa lý đặc biệt như: độ bền học, khả thấm hút nước cao, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer hóa lớn, có khả phục hồi độ ẩm ban đầu, Vì vậy, ứng dụng nhiều lĩnh vực như: thực phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, mỹ phẩm, y học, đáng ý kiểm soát hệ thống vận chuyển thuốc [2] Dùng màng cenlulose vi khuẩn làm môi trường phân tách cho q trình xử lí nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho pin lượng cho tế bào, làm môi trường chất sinh học, thực phẩm hay thay thực phẩm, công nghiệp dệt, mỹ phẩm, công nghệ giấy [2] Trong lĩnh vực y học, màng cenlulose vi khuẩn ứng dụng làm da tạm thời thay da trình điều trị bỏng, làm mạch máu nhân tạo, điều trị bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da cho người Ngoài màng cenlulose vi khuẩn sử dụng vài hệ thống để phân phối thuốc, sợi cellulose vi khuẩn có cấu trúc mạng hệ thống vận chuyển phân phối thuốc làm tăng sinh khả dụng thuốc, giúp thuốc không bị phá hủy môi trường acid Trên giới có nhiều nghiên màng cellulose vi khuẩn Amin cộng nghiên cứu sử dụng màng cellulose vi khuẩn làm màng bọc cho paracetamol cách phun phủ Kết cho thấy màng cellulose vi khuẩn có khả giữ thuốc giải phóng thuốc chậm lại, làm tăng hiệu sử dụng thuốc[3] Ở nước ta việc nghiên cứu ứng dụng màng cellulose vi khuẩn quan tâm năm gần Năm 2006, Nguyễn Văn Thanh nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu chế tạo màng cellulose dung môi tương tự (A) 10 ml dung dịch (A) thu hồi thể tích điều chỉnh đến 300 ml (B) Lấy 10 ml từ dung dịch (B) thu hồi pha loãng thành 100ml để lấy 10 (µg/ml) dung dịch HCl 0,1 N [2], [5] Pha dãy dung dịch chuẩn chứa thuốc Diclofenac natri dung môi HCl 0,1 N nồng độ (µg/ml) khác Quét phổ dung dịch Diclofenac natri có nồng độ 10 (µg/ml) khoảng bước sóng từ 200 đến 800nm, lựa chọn bước sóng đạt cực đại (λmax) hấp thụ [4] Đo độ hấp thụ dung dịch chuẩn bước sóng lựa chọn với mẫu trắng dung dịch HCl 0,1N xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối tương quan độ hấp thụ nồng độ Diclofenac natri Dùng máy đo quang phổ tử ngoại UV – 2450 để đo mật độ quang phổ (OD) dung dịch pha hấp thu cực đại (λmax) [4] Tiến hành đo lần, lấy giá trị trung bình quang phổ thuốc Diclofenac natri để xây dựng đường chuẩn thuốc Phương trình tuyến tính biểu diễn mối quan hệ nồng độ Diclofenac natri độ hấp thụ Phương trình biểu diễn mối quan hệ nồng độ độ hấp thụ có dạng: y = ax + b với R hệ số tương quan Trong đó: y: độ hấp thu dung dịch λ max x: nồng độ dung dịch Giá trị mật độ quang (OD) dung dịch thuốc Diclofenac natri nồng độ khác 2.3.3 Xác định lượng thuốc hấp thụ vào vật liệu cellulose - Sử dụng vật liệu cellulose tạo từ nước vo gạo có kích thước 0,5cm độ dày 0,5 cm cm nhau, đem hấp thụ + Mẫu Màng có độ dày 0,5 cm khơng sấy + Mẫu Màng có độ dày 0,5 cm ép nước + Mẫu Màng có độ dày cm khơng sấy + Mẫu Màng có độ dày cm ép nước - Cho mẫu vào bình tam giác chuẩn bị sẵn bình chứa 100 ml dung dịch thuốc Sau cho vào máy lắc, lắc với tốc độ 150 vòng/phút thời gian 30 phút, giờ, 1,5 giờ, sau lấy mãu dung dịch đo máy đo quang phổ máy UV – 2450 để xác định lượng thuốc lại dung dịch thời điểm lấy mẫu, từ xác định nồng độ thuốc, xác định khối lượng thuốc dung dịch m2 lượng thuốc hấp thụ vào vật liệu cellulose theo công thức mht = m1 – m2 (mg) (1) Trong đó: mht: khối lượng thuốc hấp thu vào vật liệu m1: khối lượng thuốc ban đầu dung dịch m2: khối lượng thuốc có dung dịch sau khoảng thời gian định vật liệu hấp thu thuốc - Thực đo lần để lấy giá trị OD trung bình để tính tốn Lấy giá trị OD trung bình thay vào phương trình đường chuẩn, tính nồng độ tương ứng - Hiệu suất thuốc hấp thụ vào màng tính theo cơng thức sau: EE (%) = Qt - Qd/ Qt x 100% (2) Trong đó: EE: phần trăm thuốc nạp vào vật liệu Qt: Lượng thuyết lý thuyết (mg) Qd: Lượng thuốc lại (mg) 2.3.4 Phương pháp xử lý thống kê Các số liệu phân tích, xử lý thơng qua phần mềm Excel 2013 Kết biểu diễn dạng số trung bình ± độ lệch chuẩn Kiểm định giả thiết giá trị trung bình mẫu cách sử dụng test thống kê Những khác biệt coi có ý nghĩa thống kê trị số p < 0,05 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết tạo loại vật liệu cellulose Sau ngày ni cấy ta thu màng có độ dày 0,5 cm sau 14 ngày ta thu màng có độ dày cm Tại thời điểm khác ta thu màng có độ dày, mỏng khác mơi trường chất dinh dưỡng vi khuẩn tiếp tục phát triển tạo lớp màng có độ dày khác Sau số hình ảnh chụp lại q trình làm thí nghiệm: Hình 3.1 Màng dày 0,5 cm Hình 3.2 Màng ni cấy mơi trường nước vo gạo Hình 3.3 Màng dày 0,5 cm Màng nuôi cấy từ môi trường gạo sau tinh chế đáp ứng nhu cầu sau: Màng mềm mại, linh hoạt, có độ bền, độ đàn hồi cao, dễ gấp, để ngồi khơng khí khơng bị khơ Ta có màng tinh chế: Hình 3.4 Màng tinh chế Để việc nghiên cứu hấp thụ thuốc diễn dễ dàng ta sử dụng khuôn đục màng thành màng nhỏ với kích thước 1,5 cm hình sau: Hình 3.5 Màng gạo tinh khiết 0, cm; d = 1,5 cm 3.2 Phương trình đường chuẩn thuốc Diclofenac natri Ta có phương trình đường chuẩn Diclofenac natri thể hình sau: 1,8 1,6 y = 0,2432x - 0,1655 R² = 0,996 1,2 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Hình 3.6 Phương trình đường chuẩn Diclofenac natri OD = 283 Với: y giá trị OD tương ứng nồng độ x X nồng độ % (g/ml) R hệ số tương quan Tiến hành đo mật độ quang nồng độ thuốc Diclofenac natri khác máy đo quang phổ UV – 2450 Viện nghiên cứu khoa học ứng dụng, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, sau tiếp tục xử lý phần mềm Excel, ta phương trình đường chuẩn Diclofenac natri: y = 0,2432x - 0,1655, R² = 0,996 Sau đo OD ban đầu, tiếp tục cho màng vào hấp thụ, rút mẫu để tiến hành đo sau khoảng thời gian 30 phút, giờ, 1,5 Ta rút mẫu vào lọ thủy tinh nhỏ hình sau: Hình 3.7 Rút mẫu đo Giá trị OD sau lần rút mẫu thể qua bảng sau: Bảng 3.1 Giá trị OD màng sau khoảng thời gian Độ dày màng 0,5 cm Đặc điểm màng Nguyên nước Giá trị OD theo thời gian 30 phút 1,102 1,105 0,0021 0,0016 1,5 giờ 0,508 0,011 0,0014 Ép nước 50% cm Nguyên nước Ép nước 50% 1,094 0,0025 1,087 0,0016 0,0024 0,0025 1,053 0,0025 0,0026 0,0027 0,598 0,0026 0,898 0, 0,585 0,0013 0,0015 0027 0,0029 3.3 Khối lượng thuốc Diclofenac natri hấp thu vào màng Từ kết đo thu được, ta thấy sau ta nhận kết tối ưu nhất, từ tính khối lượng thuốc hấp thụ vào màng sau Kết ghi lại bảng sau: Bảng 3.2 Lượng thuốc Diclofenac natri hấp thụ vào màng gạo sau Khối lượng hấp thụ (mg) Màng giữ nguyên nước 0,5 cm 22,27 0,0017 cm 21, 66 0,0014 Màng ép nước 50% 0,5 cm 22, 32 0,0018 cm 21,88 0,002 Số liệu bảng 3.2 cho thấy màng dày 0,5 cm, ép nước 50 % hấp thu tốt hơn, tiếp đến màng dày 0,5 cm giữ nguyên, sau màng dày cm, ép nước cuối màng dày cm, giữ nguyên Màng dày 0,5 cm, giữ nguyên hấp thụ màng dày 0,5 cm, ép nước 0,05 mg Màng dày cm, giữ nguyên hấp thụ màng dày cm, ép nước 0,05 mg Ta tính hiệu suất hấp thụ thuốc theo bảng sau: Bảng 3.3 Hiệu suất hấp thụ thuốc Diclofenac natri vào màng gạo sau EE % Màng giữ nguyên nước 0,5 cm 88,35 0,0033 cm 87,43 0,0044 Màng ép nước 50% 0,5 cm 88,98 0,0083 cm 87,63 0,0024 Số liệu bảng 3.3 cho thấy màng dày 0,5 cm, ép nước 50 % có hiệu suất hấp thụ tốt nhất, tiếp đến màng dày 0,5 cm giữ nguyên, sau màng dày cm, ép nước cuối màng dày cm, giữ nguyên Ta có nhận xét: - Hiệu suất hấp thụ khối lượng thuốc tỉ lệ thuận với - Đối với loại màng khác nhau, xét khoảng thời gian hấp thụ thuốc, ta thấy màng có độ dày 0,5 cm hấp thụ thuốc tốt màng có độ dày 1cm màng có độ dày cm có đường thuốc vào màng dài màng có độ dày 0,5 cm KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Khả hấp thụ thuốc Diclofenac natri màng CVK nuôi cấy môi trường nước vo gạo - Màng mỏng khả hấp thu thuốc tốt - Màng chưa ép nước hấp thụ thuốc so với màng ép nước 50% Cụ thể: màng dày 0,5 cm, ép nước 50 % hấp thu tốt hơn, tiếp đến màng dày 0,5 cm giữ nguyên, sau màng dày cm, ép nước cuối màng dày cm, giữ nguyên Hiệu suất hấp thụ khối lượng thuốc tỉ lệ thuận với Đối với loại màng khác nhau, xét khoảng thời gian hấp thụ thuốc, ta thấy màng có độ dày 0,5 cm hấp thụ thuốc tốt màng có độ dày 1cm màng có độ dày cm có đường thuốc vào màng dài màng có độ dày 0,5 cm Kiến nghị Để tăng hiệu sử dụng thuốc cần sử dụng thuốc mơi trường thích hợp Tiến hành nghiên cứu đề tài động vật để đánh giá sinh khả dụng thuốc từ hệ thống màng cellulose vi khuẩn mang thuốc TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Nguyễn Cảnh (2004), Quy hoạch thực nghiệm, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh [2] Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như Quỳnh (2012), “Nghiên cứu vi khuẩn A xylinum tạo màng Bacteril Cellulose ứng dụng điều trị bỏng”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, 50 (4), 453-462 [7] Bộ Y tế (2009), Dược thư quốc gia [9] Hà Nguyên Phương Anh, Trần Hậu Khang, Nguyễn Duy Hưng (2014), “Đánh giá hiệu Cimetidin phòng tái phát bệnh sùi mào gà Bệnh viện Da liễu trung ương”, Tạp chí Da liễu Việt Nam số 16 (7/2014) Tài liệu tiếng Anh [3] Abeer Khattab et al (2017), “Optimization and Evaluation of Gastroretentive Ranitidine HCl Microspheres by Using Factorial Design with Improved Bioavailability and Mucosal Integrity in Ulcer Model”, AAPS PharmSciTech, 18(4), 957-975 [4] Choi Y et al (2004), “Preparation and characterization of acrylic acid treated bacterial cellulose cation exchange membrane”, J Chem Technol Biotechnol, 79,79 – 84 [5] Nguyen T X et al (2014), “Chitosan - coated nano - liposomes for the oral delivery of berberine hydrochloride”, J Mater Chem B, 2, 7149 – 7159 [6] Nisha et al (2013), “Formulation, in-vitro, evaluation and optimization of gi floating tablet of ranitidine HCl.”, World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3(1),1-14 [8] Stanislaw Bielecki, Alina Krystynowies Marianna, Turkiewies, Halina Kalinowska (1981), "Bacterial cellulose", Technical University of Ldz, Stefanowskieg, Poland, 901-924 ... Diclofenac natri vật liệu cenlulose tạo từ Gluconacetoacter xylinus thực đề tài Nghiên cứu hấp thụ thuốc Diclofenac natri vật liệu cenlulose tạo từ Gluconacetoacter xylinus nuôi cấy môi trường nước vo. .. vo gạo Mục đích nghiên cứu Đánh giá khả hấp thụ thuốc Diclofenac natri vật liệu cellulose tạo từ Gluconacetoacter xylinus nuôi cấy môi trường nước vo gạo Nội dung nghiên cứu  Chế tạo vật liệu. .. lý vật liệu màng trước cho hấp thụ thuốc, xác định lượng màng tạo thành  Đánh giá khả hấp thụ thuốc Diclofenac natri vật liệu cellulose tạo từ Gluconacetoacter xylinus nuôi cấy môi trường nước