TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN ====== ĐÀO THỊ PHƯƠNG THẢO NGHIÊN CỨU SỰ HẤP THỤ THUỐC BERBERINE HYDROCHLORIDE CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người động vật HÀ NỘI, 2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN ====== ĐÀO THỊ PHƯƠNG THẢO NGHIÊN CỨU SỰ HẤP THỤ THUỐC BERBERINE HYDROCHLORIDE CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học người động vật Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN XUÂN THÀNH HÀ NỘI, 2019 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, lời em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy: TS Nguyễn Xuân Thành - Viện trưởng Viện Nghiên cứu Khoa học Ứng dụng, giảng viên khoa SinhKTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2- người tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, bảo em suốt thời gian nghiên cứu khóa luận vừa qua để em đạt kết ngày hôm Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ban giám hiệu Trường ĐHSP Hà Nội 2, thầy cô giáo khoa Sinh – KTNN thầy cô Viện Nghiên cứu Khoa học Ứng dụng tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ cho em trình làm thực nghiệm hồn thành khóa luận Do lần đầu tham gia nghiên cứu khoa học, kiến thức chuyên mơn hạn chế, kĩ thực hành thiếu nhiều bỡ ngỡ nên khóa luận khơng tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận góp ý q báu q thầy bạn sinh viên để khóa luận tốt nghiệm em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô! Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2019 Sinh viên Đào Thị Phương Thảo LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu khả hấp thụ thuốc berberine hydrochloride vật liệu cellulose tạo từ Gluconacetobacter xylinus nuôi cấy môi trường nước vo gạo” tơi thực hướng dẫn trực tiếp TS Nguyễn Xuân Thành Tất số liệu khóa luận thu được thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, khơng có số liệu bịa đặt Tất trích dẫn, nguồn tài liệu khóa luận lấy từ cơng bố thức có ghi rõ ràng phần tài liệu tham khảo Các số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực, chưa công bố hình thức trước khơng trùng lặp với cơng trình nghiên cứu tác giả khác Nếu sai tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2019 Sinh viên Đào Thị Phương Thảo DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CVK Cellulose vi khuẩn G xylinum Gluconacetobacter xylinus HS Hestrin - Schramm TH1 Trường hợp TH2 Trường hợp OD Optical Density- Mật độ quang phổ v/p Vòng/phút c.s cộng ĐHSP Đại học Sư phạm MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn NỘI DUNG .4 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu tổng quan đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu 1.1.1 Cellulose vi khuẩn (CVK) .4 1.1.2 Thuốc berberine hydrochloride 1.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu ngồi nước 1.2.1 Tình hình nghiên cứu màng Cellulose vi khuẩn .8 1.2.2 Tình hình nghiên cứu thuốc berberine hydrochloride 10 Chương ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Vật liệu nghiên cứu 12 2.1.1 Hóa chất dung mơi sử dụng nghiên cứu 12 2.1.2 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 12 2.1.3 Vật liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo vật liệu CVK 13 2.2 Phương pháp nghiên cứu 13 2.2.1 Tạo màng CVK lên men từ môi trường nước vo gạo 13 2.2.2 Xây dựng đường chuẩn thuốc berberine hydrochloride 15 2.2.3 Phương pháp xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng CVK 15 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18 3.1 Kết tạo vật liệu CVK 18 3.1.1 Thu CVK từ môi trường nước vo gạo 18 3.1.2 Tạo màng CVK tinh khiết 19 3.1.3 Kết trình xử lý CVK trước hấp thụ thuốc 19 3.2 Khả hấp thụ thuốc màng cellulose vi khuẩn 21 3.3 Xây dựng phương trình đường chuẩn thuốc berberine hydrochloride22 3.4 Kết đo hấp thụ thuốc berberine hydrochloride vật liệu CVK 23 3.5 Xác định thơng số tối ưu q trình hấp thụ thuốc berberine hydrochloride vào CVK 25 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO 28 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 12 Bảng 2.2 Môi trường lên men tạo vật liệu CVK 13 Bảng 2.3 Các trường hợp hấp thụ thuốc berberine hydrochloride 16 nồng độ Bảng 3.2 Giá trị trung bình lần đo màng gạo .23 hấp thụ thuốc berberine hydrochloride Bảng 3.3 Lượng thuốc hấp thụ berberine hydrochloride qua màng CVK TH1: 1h (n = 3) 24 Bảng 3.4 Lượng thuốc hấp thụ berberine hydrochloride qua màng CVK TH2: 1,5h (n = 3) 24 Bảng 3.5 Lượng thuốc hấp thụ berberine hydrochloride qua màng CVK TH3: 2h (n = 3) 25 DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Màng cellulose vi khuẩn nuôi cấy môi trường nước vo gạo 18 Hình 3.2 Màng CVK tinh khiết .19 Hình 3.3 Thí nghiệm kiểm tra độ tinh màng 20 Hình 3.4 Màng CVK tinh khiết d = 1,5cm 20 Hình 3.5 Màng CVK hấp thụ thuốc 21 Hình 3.6 Phương trình đường chuẩn thuốc berberine hydrochloride 22 Hình 3.7 Hiệu suất hấp thụ thuốc berberine hydrochloride 26 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Thuốc berberine hydrochloride (BH) loại thuốc phổ biến, quen thuộc gia đình Berberine hydrochloride loại hoạt chất chiết xuất từ hồng đằng (còn có tên vàng đắng, hồng liên, tên khoa học Coptis teeta),… chứa chủ yếu thân rễ với tỷ lệ 1,5-3% Berberine hydrochloride có tác dụng chất kháng khuẩn tự nhiên việc điều trị bệnh tiêu chảy vi khuẩn gây ra, ký sinh trùng đường ruột, viêm đường tiêu hóa vi khuẩn tả, amip đường ruột Berberine hydrochloride bào chế thành thuốc nhỏ mắt điều trị bệnh viêm kết mạc, đau mắt đỏ kích thích bên ngồi (gió, nắng, lạnh, bụi, khói ) điều trị bệnh mắt hột Ngồi ra, BH có tác dụng tốt việc điều trị số bệnh mãn tính tiểu đường, viêm khớp, hạ lipid, choresterol máu, đặc biệt bệnh viêm đại tràng[2] Berberine hydrochloride có ưu điểm chống loại vi khuẩn, ký sinh trùng đường ruột gây hại cho thể mà không làm ảnh hưởng tới hoạt động vi sinh vật có lợi đường tiêu hóa Vì vậy, dùng số thuốc kháng sinh mà phối hợp với Berberine hydrochloride hạn chế tác dụng phụ thuốc kháng sinh hệ vi sinh vật có lợi đường ruột Tuy nhiên sinh khả dụng đường uống chúng thấp, với đường vận chuyển thuốc ngồi đường tiêu hóa thuốc có khả gây tác dụng phụ khơng mong muốn Trong q trình sử dụng thuốc hiệu hấp thụ thuốc bị ảnh hưởng nhiều tác nhân khác Do đó, cần thiết kế loại màng giúp thuốc hấp thụ cách nhanh chóng tăng khả điều trị bệnh berberine hydrochloride msau: khối lượng thuốc sau hấp thụ vào màng CVK (mg); mhấp thụ: khối lượng thuốc hấp thụ vào màng CVK (mg) Sau áp dụng cơng thức (2) tính phần trăm lượng thuốc berberine hydrochloride hấp thụ vào màng Hiệu suất nạp thuốc vào màng CVK tính theo công thức: EE (%) = (Qt  Qd )  100% Qt (2) Trong đó: EE: phần trăm thuốc hấp thụ vào màng (%); Qt: lượng thuốc lí thuyết; Qd : lượng thuốc lại - Phân tích thống kê Lặp lại lần thí nghiệm để lấy kết trung bình mẫu phân tích thống kê số liệu qua phần mềm Excel 2013 để phân tích phương sai xác định khoảng tin cậy Tất liệu trình bày theo giả định trung bình độ lệch chuẩn “MEAN ± SD” Những khác biệt coi có ý nghĩa thống kê giá trị p < 0,05 Các thông số động học giải phóng thuốc tính tốn, xử lý công cụ DDSolver Excel 17 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết tạo vật liệu CVK 3.1.1 Thu CVK từ môi trường nước vo gạo - Khi ni cấy tĩnh điều kiện nhiệt độ phòng, màng đủ điều kiện phát triển tốt - Vi khuẩn cho vào môi trường sử dụng chất dinh dưỡng từ môi trường nước vo gạo để sinh trưởng phát triển, từ tổng hợp nên cellulose - Sau thời gian từ 10-14 ngày lớp màng dày dần lên độ dày màng cellulose vi khuẩn thu 0,5 - 1cm - Lấy màng sau đạt độ dày theo kích thước cần để hấp thụ thuốc - Màng thơ tạo thành có tính chất dai, nhẵn; màng màu vàng ngà, khả chịu lực khả thấm hút màng tốt Hình 3.1 Màng cellulose vi khuẩn ni cấy môi trường nước vo gạo 18 3.1.2 Tạo màng CVK tinh khiết - Màng sau lấy xử lý NaOH 30% (pha 12g NaOH với 1000ml nước cất lần) - Sau cho màng vào nồi hấp để xử lý - Thu màng sau xả vòi nước từ 24 – 48 - Màng CVK tinh khiết đạt tiêu chuẩn: mềm mại, linh hoạt, dễ gấp mà không cần thêm vật liệu dẻo nào, độ bền kéo độ đàn hồi tốt Hình 3.2 Màng CVK tinh khiết 3.1.3 Kết trình xử lý CVK trước hấp thụ thuốc 3.3 Kết thí nghiệm kiểm tra độ tinh màng CVK thể hình Kết sau cho thuốc thử vào ống thí nghiệm có chứa màng CVK lắc lên dung dịch khơng bị vẩn đục, chứng tỏ màng CVK tinh khiết, sử dụng màng để hấp thụ thuốc - Sau thử độ tinh màng dùng khn để tạo hình cho màng để nạp thuốc với đường kính 1,5cm với hai chiều dày 0,3cm 0,5cm 19 Hình 3.3 Thí nghiệm kiểm tra độ tinh màng - Vật liệu CVK đục khuôn mẫu có kích thước để hấp thụ thuốc (hình 3.4) Hình 3.4 Màng CVK tinh khiết d = 1,5cm 20 3.2 Khả hấp thụ thuốc màng cellulose vi khuẩn - Nồng độ sau khảo sát tìm 10mg/ml - Tiến hành thí nghiệm: + Cân 0,1g thuốc cân phân tích + Đổ vào bình tam giác 200ml + Đong 100ml dung dịch cồn cho vào bình tam giác có thuốc + Đem lắc thời gian 15 phút với nhiệt độ 40oC + Sau cho màng vào dung dịch thuốc, đặt bình vào máy lắc với chế độ lắc 180 vòng/phút, nhiệt độ 40oC thời gian 1h, 1,5h, 2h Hình 3.5 Màng CVK hấp thụ thuốc - Lấy màng khỏi dung dịch đo máy UV- 2450 với OD345nm để xác định lượng thuốc hấp thụ vào màng + Lặp lại thí nghiệm lần + Làm tương tự với thời gian lắc 1,5h 2h 21 3.3 Xây dựng phương trình đường chuẩn thuốc berberine hydrochloride Pha dung dịch berberine hydrochloride nồng độ(mg/ml) khác nhau: 5%; 10%; 20%; 30%; 40%; 50% Đo UV bước sóng 345nm (bước sóng hấp thụ cực đại berberine hydrochloride) Kết thu đường chuẩn mẫu với C% trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Mật độ quang (OD) dung dịch berberine hydrochloride nồng độ C% (mg/ml) OD345nm 0,353 10 20 0,71 1,524 30 40 50 2,205 3,004 3,616 ±0.0032 ±0.0056 ±0,0021 ±0,0075 ±0,0033 ±0,0089 Phương trình đường chuẩn thuốc berberine hydrochloride trình bày hình 3.5 Mật độ quang OD (Abs 345nm) C% (mg/ml) Hình 3.6 Phương trình đường chuẩn thuốc berberine hydrochloride 22 Phương trình đường chuẩn thuốc berberine hydrochloride là: y = 0,0734x + 0,0056 R² = 0,9986 (3) Trong công thức (3): y: Giá trị OD tương ứng với nồng độ x x: Nồng độ % berberine hydrochloride (mg/ml) R2: Hệ số tương quan bình phương 3.4 Kết đo hấp thụ thuốc berberine hydrochloride vật liệu CVK Bảng 3.2 Giá trị trung bình lần đo màng gạo hấp thụ thuốc berberine hydrochloride Màng CV Độ dày màng Giá trị OD thời gian giờ 30 phút Màng 0.3cm gạo 0.676 ± 0.003606 0.5cm 0.696 ± 0.001732 0.618 ± 0.004583 0.627 ± 0.002 0.617 ± 0.002646 0.627 ± 0.003 Từ giá trị OD thu bảng 3.2, thay vào phương trình đường chuẩn (3) ta tìm nồng độ berberine hydrochloride (C%) dung dịch xác định khối lượng berberine hydrochloride có dung dịch (Qd), lấy khối lượng berberine hydrochloride có dung dịch ban đầu trừ lượng thuốc lại dung dịch ta khối lượng berberine hydrochloride hấp thụ vào màng CVK (mht), tiếp tục lấy khối lượng berberine hydrochloride hấp thụ vào màng CVK thay vào công thức (2) ta thu hiệu suất hấp thụ thuốc berberine hydrochloride vào màng CVK, kết trình bày bảng 3.3 23 Bảng 3.3 Lượng thuốc hấp thụ berberine hydrochloride qua màng CVK TH1: 1h (n = 3) Độ dày Qt màng (cm) 0,3 0,5 y Qd (mg) mht (mg) EE (%) (mg) 10 10 0.676 9,1334 0,8665 8,6653 ±0.0036 ±0,049 ±0,049 ±0,4909 0.696 9,4059 0,594 5,9406 ±0.0017 ±0,0236 ±0,0236 ±0,2361 Bảng 3.4 Lượng thuốc hấp thụ berberine hydrochloride qua màng CVK TH2: 1,5h (n = 3) Độ dày Qt màng (cm) 0,3 0,5 y Qd (mg) mht (mg) EE (%) (mg) 10 10 0.618 8,3433 1,6567 16,567 ±0.004583 ±0,0624 ±0,0624 ± 0,6242 0.627 8,4658 1,5341 15,3413 ± 0.002 ±0,0272 ±0,0272 ±0,2725 24 Bảng 3.5 Lượng thuốc hấp thụ berberine hydrochloride qua màng CVK TH3: 2h (n = 3) Độ dày Qt y Qd (mg) mht (mg) màng (cm) 0,3 0,5 EE (%) (mg) 10 0.617 8,3296 1,6703 16,7036 ±0.0026 ±0,036 ±0,0360 ±0,3603 0.627 8,4659 1,5341 15,341 ± 0.003 ±0,0409 ±0,0409 ±0,409 10 3.5 Xác định thông số tối ưu trình hấp thụ thuốc berberine hydrochloride vào CVK Kết từ sơ đồ cho ta thấy: Vật liệu CVK làm từ môi trường nước vo gạo hấp thụ thuốc tốt CVK có độ dày 0,3cm, điều kiện 40oC, chế độ lắc 180 vòng/phút thời gian 2h so với màng có độ dày 0,5 cm thời gian 1h 1,5h Màng 0,3cm hấp thụ 2h có mht lớn thí nghiệm 1,6703±0,0360mg làm cho hiệu suất đạt cao 16,7036 ±0,3603% (tất số liệu có ý nghĩa thống kê với P(T