1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ NGUYỄN THỊ THƠM NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH ĐỆM LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ NGUYỄN THỊ THƠM NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO THẦN KINH ĐỆM Chuyên ngành : Hóa sinh Mã số : 62720112 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS ĐẶNG THỊ NGỌC DUNG HÀ NỘI – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi Nguyễn Thị Thơm, nghiên cứu sinh khóa 34, Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa sinh, xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực hướng dẫn PGS.TS Đặng Thị Ngọc Dung Cơng trình không trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thơng tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Người viết cam đoan CHỮ VIẾT TẮT BCNU : Carmustine EGFR : Epidermal growth factor receptor EGFRvIII : The epidermal growth factor receptor variant III IRM : Chụp cộng hưởng từ TMZ : Temozolomid UNBTKĐ : U nguyên bào thần kinh đệm WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế giới) MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Tế bào thần kinh đệm xem mô liên kết hệ thần kinh trung ương người, với số lượng nhiều gấp 10 đến 50 lần so với số lượng neuron thần kinh Các tế bào thần kinh đệm cơng nhận vai trò thông tin liên lạc hệ thần kinh trung ương hợp tác với neuron [1] U nguyên bào thần kinh đệm (UNBTKĐ) phát triển từ tế bào thần kinh đệm chưa biệt hóa biệt hóa thấp não [2], 100% ác tính WHO xếp vào nhóm u ác tính độ IV [3]; tỷ lệ mắc hàng năm khoảng 3,2/100000 dân, chiếm tỷ lệ cao loại u não ác tính nguyên phát (46,6%), bệnh tiến triển nhanh, người mắc UNBTKĐ có thời gian sống trung bình tháng đến năm điều trị tích cực, tỷ lệ sống sau năm thấp khoảng 5,5% [4] Cơ chế sinh bệnh UNBTKĐ biết đến đa phần đột biến gen, gây rối loạn thông tin di truyền tế bào, tế bào tăng sinh, không ngừng phân chia phát sinh khối u, ung thư [5],[6],[7] Nghiên cứu di truyền cấp độ phân tử cho phép người giải thích mối liên quan cấu trúc chức đại phân tử sinh học vận hành kiểm sốt q trình sinh hóa tế bào Thơng thường, tế bào bình thường để chuyển dạng sang tế bào ung thư phải trải qua vài đột biến số gen định Quá trình liên quan đến hệ thống gen sinh ung thư gen kháng ung thư Hai gen bình thường tế bào đóng vai trò quan trọng kiểm sốt q trình sinh sản tế bào, biệt hóa tế bào q trình chết theo chương trình tế bào, giúp cho ổn định sinh học thể Gen sinh ung thư kiểm soát theo hướng tích cực, mã hóa protein truyền tín hiệu phân bào Khi gen bị đột biến truyền tín hiệu phân bào sai lạc mà thể khơng kiểm sốt dẫn đến sinh ung thư, ví dụ gen EGFR, FGFR, IDH Các gen kháng ung thư trái lại mã hóa cho protein kiểm soát phân bào theo hướng ức chế, làm chu kỳ phân bào dừng pha, thường pha G1; gen kháng ung thư có chức làm biệt hóa tế bào, mã hóa tế bào chết theo chương trình Khi gen kháng ung thư bị bất hoạt đột biến làm biến đổi tế bào lành thành ác tính, ví dụ gen TP53, PTEN… [5] Các nghiên cứu sinh bệnh UNBTKĐ có liên quan đến nhiều gen: gen kháng ung thư gen TP53, PTEN, gen sinh ung thư như: EGFR, FGFR, IDH, MGMT, ATRX, TERT, xóa 1p/19q, nhiễm sắc thể 10… tập trung nghiên cứu đột biến số gen gen TP53, EGFR, FGFR, đột biến gen TP53, EGFR, FGFR chứng minh đóng vai trò quan trọng chế sinh bệnh phân tử định hướng điều trị bệnh u nguyên bào thần kinh đệm [4],[8],[9],[10] Gen TP53 có vai trò kiểm sốt hoạt động sống chết tế bào theo chu trình Đột biến TP53 liên quan chặt chẽ với tiên lượng xấu cho sống tổng thể bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm, đột biến TP53 làm tăng nhạy cảm với hóa chất temozolomide điều trị bệnh, làm tăng tỉ lệ sống so với điều trị semustine bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm [11], [12] Gen EGFR gen FGFR mã hóa tổng hợp thụ thể màng tế bào có tên gọi protein tyrosin kinase, thụ thể có vai trò tiếp nhận truyền tín hiệu nội bào theo chế phosphoryl hóa, sản phẩm chúng điều hòa tăng sinh, sống còn, biệt hóa vận động tế bào Hoạt động thụ thể kiểm sốt điều hòa chặt chẽ Sự rối loạn hoạt động tyrosin kinase đột biến hay biến đổi di truyền khác gây điều hòa hoạt động enzym hậu tế bào trở nên ác tính [5], [6] Một số chất ức chế hoạt động bất thường tyrosin kinase thử nghiệm thành công số ung thư đột biến gen EGFR, FGFR như: ung thư phổi không tế bào nhỏ, ung thư vú, đại tràng [14], [15], [16] Và chất ức chế EGFR, FGFR thử nghiệm bệnh nhân mắc u nguyên bào thần kinh đệm, để thử nghiệm thành công định cần phải xác định thay đổi cấu trúc phân tử gen EGFR, FGFR Đây hướng điều trị đích triển vọng điều trị ung thư Như nghiên cứu đột biến gen TP53, EGFR, FGFR… sở cho nghiên cứu điều trị đích bệnh UNBTKĐ, cần thiết với thầy thuốc lâm sàng để đưa tiên lượng hướng điều trị tốt cho người bệnh u nguyên bào thần kinh đệm Tại Việt nam chưa thấy có nghiên cứu vấn đề Xuất phát từ lý trên, thực đề tài: "Nghiên cứu đột biến gen bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm", với mục tiêu: Xác định đột biến số gen bệnh u nguyên bào thần kinh đệm Phân tích số đặc điểm người bệnh u nguyên bào thần kinh đệm có đột biến gen CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Đại cương u nguyên bào thần kinh đệm 1.1.1 Tình hình mắc u nguyên bào thần kinh đệm nước giới Tổng thể điều tra mắc UNBTKĐ giới chưa đồng đều, ví dụ Mỹ năm có nghiên cứu báo cáo tình hình mắc bệnh, hay Anh, Phần lan, Đan mạch thường năm báo cáo lần…, song châu lục khác, châu Á hay châu Phi, thống kê bệnh lẻ tẻ Qua báo cáo cho thấy tỷ lệ mắc UNBTKĐ không giống giới, nước Châu Âu Mỹ có tỷ lệ mắc cao nước châu Á, Mỹ tỉ lệ mắc hàng năm 3,2/100000 dân [4], tỷ lệ mắc cao Anh (4,64/100.000 dân/năm) [Error: Reference source not found6] Các nước Bắc Âu số người mắc bệnh giao động từ 3,3 - 5,1/100.000 nam giới 2,1-3,5/100.000 phụ nữ, tỷ lệ mắc bệnh gia tăng hàng năm, tăng trung bình hàng năm nam giới: 9,2% phụ nữ: 8,8%, gia tăng cao nhóm tuổi già nhất, nam 12,4%, nữ 10,5% [Error: Reference source not found7], tỷ lệ mắc thấp Phần Lan 2,0/100.000 người/năm [Error: Reference source not found8] Tại Ấn độ hàng năm có từ 5-10/100,000 dân mắc u não thần kinh trung ương, tỷ lệ mắc UNBTKĐ chiếm 22,8%/[Error: Reference source not found9] Tỷ lệ mắc bệnh thấp Hàn quốc 0,66/100000 dân/năm [20] Nam giới thường mắc UNBTKĐ nhiều nữ giới, người da trắng có tỷ lệ mắc bệnh cao người da màu [4] Tại Việt Nam chưa thấy có báo cáo tỷ lệ mắc u nguyên bào thần kinh đệm nước, số nghiên cứu đưa kết cho thấy tỉ lệ bệnh cao: theo thống kê Lê Xuân Trung Nguyễn Như Bằng năm 10 1975, u nguyên bào thần kinh đệm chiếm 18% 408 ca mổ u não bệnh viện Việt Đức [Error: Reference source not found1] Nghiên cứu Kiều Đình Hùng (2006), loại u thần kinh đệm ác tính UNBTKĐ chiểm tỷ lệ cao 62,7% [Error: Reference source not found2] Nghiên cứu Trần Chiến (2011) tỉ lệ mắc u nguyên bào thần kinh đệm 39,3% số u thần kinh đệm hình sao, nam mắc bệnh cao nữ, tuổi trung bình 43,03 ± 3,37, tuổi hay gặp từ 51-60 tuổi, thấp 13 tuổi, cao 71 tuổi [23] Theo Dương Chạm Uyên, Dương Đại Hà (2013), u tế bào thần kinh đệm chiếm 39,2% (trong UNBTKĐ nhiều nhất), cao loại u não thần kinh trung ương [24] Tất nghiên cứu kết luận nam giới mắc bệnh UNBTKĐ cao nữ giới, tỷ lệ mắc tăng theo lứa tuổi [4], [Error: Reference source not found], [Error: Reference source not found7], [Error: Reference source not found] Về độ tuổi mắc Việt nam trẻ so với nước: tuổi trung bình mắc UNBTKĐ 43 ± 3,71, tuổi hay gặp từ 51-60 tuổi (28,8%) [Error: Reference source not found], Mỹ tỷ lệ mắc bệnh cao nhóm 75 tuổi chiếm 24,43% [4] Nhìn chung bệnh u nguyên bào thần kinh đệm ngày gia tăng, gặp nhiều tuổi trung niên trở lên, nam mắc bệnh cao nữ, ác tính tỉ lệ sống thường thấp, khoảng 5,5% sống qua năm [4], [Error: Reference source not found], [Error: Reference source not found], [Error: Reference source not found3]… 1.1.2 Phân loại u nguyên bào thần kinh đệm Tổ chức não thần kinh trung ương đa dạng, bao gồm nhiều tuyến, nhiều loại tế bào; tổn thương đa dạng, tùy vị trí, chức mà tế bào đảm nhiệm gây bệnh lý khác Do gọi u não song với loại tế bào bị bệnh có biểu 10 11 Xiang Wang et al (2014) Gain of Function of Mutant TP53 in Glioblastoma: Prognosis and Response to Temozolomide, Annals of 12 Surgical Oncology , 21,(4), pp 1337-1344 Van Meir EG, Kikuchi T, et al, (1994) Analysis of the p53 Gene and Its Expression 13 in Human Glioblastoma Cells Cancer Research 1994;54,649-652 Nicola Montano, Tonia Cenci, Roberto Pallini et all (2011) Expression of EGFRvIII in Glioblastoma: Prognostic Significance Revisited 14 Neoplasia, 13(12), 1113-1121 Tạ Thành Văn (2014), Xác định đột biến gen định tính đáp ứng 15 điều trị ung thư đại tràng ung thư phổi, Hà Nội Vikki Rand, Huang J, Stockwell T.E et al (2005) Sequence survey of receptor tyrosine kinases reveals mutations in glioblastomas Proc Natl Acad Sci U S A, 102, 14344-9 16 Andrew Brodbelt, David Greenberg, Tim Winters, et al (2015), Glioblastoma in England: 2007-2011, European journal of cancer, 17 March 2015 Volume 51, Issue 4, Pages 533-542 Lönn S1, Klaeboe L, Hall P, et al (2004), Incidence trends of adult primary intracerebral tumors in four Nordic countries, Int J Cancer 2004 18 Jan 20;108(3):450-5 Suvi Larjavaara, Riitta Mäntylä, Tiina Salminen, Hannu Haapasalo, Jani Raitanen, Juha Jääskeläinen, and Anssi Auvinen, Incidence of gliomas 19 by anatomic location, Neuro Oncol 2007 Jul; 9(3): 319-325 Archya Dasgupta, Tejpal Gupta, and Rakesh Jalali (2016) Indian data on central nervous tumors: A summary of published work, South Asian J 20 Cancer 2016 Jul-Sep; 5(3): 147-153 Lee CH1, Jung KW, Yoo H, Park S, Lee SH (2010), Epidemiology of primary brain and central nervous system tumors in Korea (2010), Journal korean neurosurg Soc 2010 Aug; 10.3340/jkns.2010.48.2.145 Epub 2010 Aug 31 140 48(2):145-52 doi: 21 Lê Xuân Trung, Nguyễn Như Bằng (1975), Confrontations anatomo clinnique des tumeurs intra crâniennes opérées l’hopital universitaire VietDuc Travaux de la Clinique chirurgical universitaire de l’Hoopital 22 VietDuc, 1975, I, 91-105 Kiều Đình Hùng (2006), Nghiên cứu ứng dụng quang động học điều 23 trị Gliome não ác tính, Luận án tiến sỹ y học Trần Chiến (2011) Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, chẩn đoán hình ảnh kết phẫu thuật u não tế bào hình (actrocytoma) bán cầu đại não, 24 Luận án tiến sỹ y học Dương Chạm Uyên, Dương Đình Hà (2013) Đặc điểm dịch tễ học 25 phân loại mô bệnh học u não Y học Việt Nam tháng 12 số 1/2013 Baley P Cushing H.A (1926) Classification of the tumors of the glioma group on a histogenetic basic with a correlated study of program JB 26 Lippincon, Philadelphia Kernohan J.W et all (1949), A simpliffed classification of gliomas, Proc 27 Staff meet Mayo clin 24: 71-75 Paul Kleihues, Peter C Burger and Bernd W (1993), The New WHO 28 Classification of Brain Tumours, Brain Pathology 3: 255268 Paul Kleihues MD, David N., Louis, MD Bernd W., Scheithauer MD., et al (2002), The WHO Classification of Tumors of the Nervous System, Journal of Neuropathology & Experimental Neurology, Volume 61, Issue 3, March 29 2002, Pages 215-225 David N., Hiroko Ohgaki, Otmar D Wiestler, et al (2007) The 2007 WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System, Acta 30 Neuropathologica 114(2): 97-109 Stewart LA (2002) Chemotherapy in adult high-grade glioma: a systematic review and meta-analysis of individual patient data from 12 31 randomised trial Lancet 359(9311):1011-8 McBride OW, Merry D and Givol D, (1986) The gene for human p53 cellular tumor antigen is located on chromosome 17 sht arm (17p13) Proc Natl acad Sci USA, 83(1) 130-134 141 32 Ken SE, et al (1991), Identification of p53 as a sequence-specific DNA- 33 binding protein, Sience, 252(5013), 1708-1711 Vogelstein B and Kinzler KW (1992), p53 function and dysfunction, 34 Cell, 70, 523-526 Toshinori Ozaki and Akira Nakagawara (2011), Role of p53 in cell Death 35 and human Cancers, Cancer, 3, 994-1013 Sung T, Miller DC, Hayes RL, Alonso M, Yee H, Newcomb EW, (2000) Preferential inactivation of the TP53 tumor suppressor pathway and lack of EGFR amplification distinguish de novo high grade pediatric astrocytomas 36 from de novo adult astrocytomas Brain Pathol;10:249-259 Van Meir EG, Kikuchi T, et al, (1994) Analysis of the p53 Gene and Its Expression 37 in Human Glioblastoma Cells Cancer Research 1994;54,649-652 Shoji Shiraishi M.D, Kenji Tada M.D, Yukitaka Ushio M.D, et al (2002) Influence of p53 mutations on prognosis of patients with glioblastoma 38 Cancer J 95(2), Pg 249-257 Bernard Leroy, Jean Louis Fournier, Thierry Soussi et al (2013), The TP53 website: an integrative resource centre for the TP53 mutation database and TP53 mutant analysis, Nucleic Acids Res 41(Database 39 issue): D962-D969 Linn Hjortsberg and Thierry Soussi (2008) MUT-TP53 2.0: A novel versatile matrix for statistical analysis of TP53 mutations in human cancer Journal: Human Mutation, Manuscript ID: humu-2010-0129.R1; 40 http://p53.frree.fr Caorpenter G, King Jr, and Cohen S (1978), Epidemal growth factor 41 atimulates phosphoryllation in membrane preparations in vitro Petri E.T, Halmos B, Boggon T.J kuma A (2008), Structure and clinical relevance of the epidermal growth factor receptor in human cancer, J clin 42 Oncol, 26(10), 1742-1751 Sliwkowski MX, Yarden Y (2001), Untangling the ErbB signaling network, Nat Rev Nol cell biol, 2, 137-2001 142 43 Marmor M.D, Skaria K.B and Yarden Y (2004), Signal trandution and oncogennesis by ErbB/HER receptors, Int J Radiat Oncol Biol Phy, 44 58, 903-913 R.S, Heymach J.V and Lipman,S.M Herbst (2008), Lung cancer, N Engl 45 J Med 354, 1367-1380 Jeffrey C Lee et al (2006) Epidermal Growth Factor Receptor Activation in Glioblastoma through Novel Missense Mutations in the Extracellular 46 Domain journal.pmed 3(12): e485 Frederick L, Wang XY, Eley G, James CD (2000) Diversity and frequency of epidermal growth factor receptor mutations in human 47 glioblastomas, Cancer Res 60: 1383-1387 Shinojima Naoki, Tada K, et al (2003) Prognostic value of epidermal growth factor receptor in patients with glioblastoma multi1forme 48 Cancer Res 2003; 63(20):6962-6970 Youngmin Choi, Young-Jin Song, Hyung-Sik Lee, Won-Joo Hur, Ki-Han Sung, Ki-Uk Kim, Sun-Seob Choi, Su-Jin Kim, and Dae-Cheol Kim (2013), Epidermal Growth Factor Receptor Is Related to Poor Survival in Glioblastomas: Single-Institution Experience, Journal List Yonsei 49 Med J , 54(1): 101-107 Huang PH, Mukasa A, et al (2007) Quantitative analysis of EGFRvIII cellular signaling networks reveals a combinatorial therapeutic strategy 50 for glioblastoma Proc Natl Acad Sci, U S A, 104(31), 12867-12872 Tuner N and Grose R (2010) Fibroblast growth factor signaling: from 51 development to cancer Nature Rev Cancer, 10, 116-129 Dienstmann R., Rodon J., Prat A et al (2014) Genomic aberrations in the FGFR pathway: opportunities for targeted therapies in solid tumors 52 Ann oncol, 25(3), 552-563 Haugsten E.M., Wiedlocha A., Olsnes S Ellen et al (2010) Roles of Fibroblast Growth Factor Receptors in Carcinogenesis Mol Cancer Res, 53 10, 1158-1541 Agarwala S.S., Kirkwood J.M (2000) Temozolomide, a novel alkylating agent with activity in the central nervous system, may 143 improve the treatment of advanced metastatic melanoma Oncologist, 54 5(2), 144-151 O’Brien C., Wallin J.J., Sampath D et al (2010) Predictive biomarkers of sensitivity to the phosphatidylinositol 3' kinase inhibitor GDC-0941 in breast cancer preclinical models Clin Cancer Res, 16(14), 3670-3683 55 Carrie Marquette, Lisle Nabell (2012), Chemotherapy-Resistant Metastatic 56 Breast Cancer, June 2012, Volume 13, Issue 2, pp 263-275 Brittany C Parker et all (2013), The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma, J Clin Invest 2013 57 Feb 1; 123(2): 855-865 Devendra Singh, Joseph Minhow Chan, Pietro Zoppoli, (2012) Transforming Fusions of FGFR and TACC Genes in Human 58 Glioblastoma National Institutes of Health, US, pp 1231-1235 Anna Luisa Di Stefano, Alessandra Fucci, Veronique Frattini, et all (2015); Detection, characterization and inhibition of FGFR-TACC fusions in IDH wild type glioma, Clin Cancer Res 2015 Jul 15; 21(14): 3307-3317 59 Gan HK, Kaye AH, Luwor RB (2009) The EGFRvIII variant in 60 glioblastoma multiforme, J Clin Neurosci 2009; 16(6):748-754 Tạ Thành Văn (2010), PCR số kỹ thuật sinh học phân tử, Nhà 61 xuất Y học, Hà Nội, 103 - 104 Mullis K.B and Faloona FA (1987), Specific synthesis of DNA in vitro via a 62 polymerase-catalyzed chain reation Methods Enzymod 155:335-50 Judith Jeuken (2009), Robust Detection of EGFR Copy Number Changes and EGFR Variant III: Technical Aspects and Relevance for Glioma 63 Diagnostics Brain Pathol 2009 Oct; 19(4): 661-671 Sanger F, Nicklen S, Coulson AR (1977) DNA sequencing with chainterminating inhibitors Proc Natl Acad Sci U S A 1977;74:5463-7 [PMC free article] [PubMed] 144 64 Zascavage RR, Shewale SJ, Planz JV (2013) Deep-sequencing technologies and potential applications in forensic DNA testing Forensic 65 Sci Rev 2013;25:79-105 [PubMed] Switzeny OJ, Christmann M, Renovanz M, Giese A, Sommer C, Kaina B (2016) MGMT promoter methylation determined by HRM in comparison to MSP and pyrosequencing for predicting high-grade 66 glioma response Clin Epigenetics 2016;8:49 Cykowski MD, Allen RA, Fung KM, Harmon MA, Dunn ST (2016) Pyrosequencing of IDH1 and IDH2 mutations in brain tumors and non- 67 neoplastic conditions Diagn Mol Pathol 2012;21:214-20 Quillien V, Lavenu A, Ducray F, et al (2016) Validation of the highperformance of pyrosequencing for clinical MGMT testing on a cohort of glioblastoma patients from a prospective dedicated multicentric 68 trial Oncotarget 2016;7:61916-29 Roger H Frankel, William Bayona, Maxim Koslow, and Elizabeth W (1992) p53 Mutations in Human Malignant Gliomas: Comparison of Loss of Heterozygosity with Mutation Frequency, Cancer research, 52, 69 1427-1433 Ohgaki H1, Dessen P, Jourde B, Horstmann S, T Nishikawa, Di Patre PL, Burkhard C, D Schuler, Probst-Hensch NM, Maiorka PC, Baeza N, P Pisani, Yonekawa Y, Yasargil MG, Lütolf UM, Kleihues P (2004) `Genetic pathways to glioblastoma: a population-based study Cancer 70 Res Oct 1;64(19):6892-9 Stupp Rmason, WPvan den, Bent MJ et al (2005) Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma N Engl J Med 352987- 996 145 146 PHỤ LỤC QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA 1.1 Quy trình tách DNA từ mẫu mơ paraffin: - Cạo phần ung thư khoanh vùng từ mô đúc paraffin, (khoảng 20mg mô) - Thêm 1ml Toluen, Vortex, Li tâm 15000 vòng/3-5 phút, loại bỏ dịch - Thêm 1ml Ethanol 100%, Vortex, Li tâm 15000 vòng/ 3-5 phút - Loại bỏ dịch Để khơ cặn 56 độ C - Thêm 650 µl Lysis buffer HD + 5µl Protein K - Ủ 56 độ C qua đêm - Thêm 500 µl PCI (25:24:1) - Vortex, ly tâm 15000 vòng/20 phút/4oC, sau thu lớp suốt - Thêm 500 µl CI (24:1) - Vortex, ly tâm 15000 vòng/10 phút/4oC, sau thu lớp suốt - Thêm: 1000 µl ethanol 100% 40 µl CH3COONa 3M, sau lắc để -20oC - Ly tâm 15000 vòng/20 phút/4oC thu tủa - Thêm 1ml cồn 70%, ly tâm 15000 vòng/20 phút/4oC - Thu tủa DNA để khơ, hòa tan 60 µl TE 1.2 Đo mật độ quang học DNA sau tách chiết máy Nanodrop - Trừ trắng dung dịch pha DNA (TE nước cất): hút 1,5 µl TE nhỏ vào điểm đo mật độ quang, nhấn nút đo - Hút 1,5 µl DNA tổng số tách nhỏ vào điểm đo máy, nhấn 147 nút đo 148 PHỤ LỤC QUY TRÌNH KỸ THUẬT PCR 2.1 Các bước quy trình - Chuẩn bị đầy đủ dụng cụ, hóa chất, mồi mẫu DNA - Thành phần ống chạy PCR bao gồm: + Nước cất: 3µl + Taq polymerase: µl + Mồi xuôi: 0,5 µl + Mồi ngược: 0,5 µl + DNA: µl Tổng ống 10 µl - Trộn thành phần, đưa vào máy chạy PCR - Chu trình nhiệt PCR: + Biến tính: 940C phút + Biến tính: 950C 30 giây + Gắn mồi: 570C 30 giây + Kéo dài: 720C phút + Kéo dài: 720C phút x 35 chu kỳ - Lấy kết sản phẩm DNA sau chạy PCR để kiểm tra kết 2.2 Kiểm tra kết PCR 149 Điện di DNA kiểm tra kết PCR + Tra mẫu marker vào giếng: - Tra µl marker loại 100 bp vào giếng - Với giếng lại, giếng tra µl sản phẩm DNA tương ứng + Chạy điện di: - Cài đặt máy tiến hành điện di với hiệu điện 120 V 30 phút + Nhuộm gel: - Ngâm gel dung dịch ethidium bromide µg/ml 5' - Sau rửa gel lần để loại bỏ phần ethidium bromide dư tiến hành chụp ảnh + Quan sát chụp ảnh: - Cho gel vào máy chụp ảnh tử ngoại tự động, quan sát băng sáng DNA xuất gel chụp hình lưu trữ kết 150 PHỤ LỤC QUY TRÌNH GIẢI TRÌNH TỰ GEN - Tinh mẫu: + Thêm 60µL cồn 100% + 5µL EDTA vào mẫu cần tinh + Lắc mạnh, để phòng tối 15 phút, nhiệt độ phòng + Lấy ly tâm 15.000 vòng/phút 20 phút + Loại bỏ dịch + Thêm 200µL cồn 70%, ly tâm 15.000 vòng/phút 10 phút + Loại bỏ dịch nổi, để khô + Thêm 20µL Hi-di, ủ 95°C phút + Cho vào tủ lạnh khoảng phút + Lấy mẫu DNA tinh sử dụng làm khuôn cho giải trình tự gen - Pha mẫu giải trình tự: Thành phần mẫu giải trình tự Thành phần H2O Buffer Big dye 5X Big dye Terminator v3.1 Mồi F R (10pmol/µL) DNA (đã tinh sạch) Tổng thể tích Thể tích (µL) 6,5 1,5 0,5 0,5 10 µL - Chu trình nhiệt: 96°C: phút 96°C: 10 giây 57°C: giây 60°C: phút x 25 chu kỳ Bảo quản 15°C - Đọc kết giải trình tự lưu máy 151 PHỤ LỤC QUY TRÌNH KỸ THUẬT KHUẾCH ĐẠI DNA DỊ (MLPA) (Sử dụng hóa chất kit SALSA MLPA P105-D2, hãng MRC- Hà Lan) - - Bước 1: Biến tính DNA Cho 5µl dung dịch DNA cần phân tích vào ống PCR 0,2ml Biến tính 980C/5 phút, Giữ 250C Bước 2: Gắn dầu dò vào gen đích + Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng: Thành phần Thể tích (µl) Đệm SALSA MLPA 1,5 Hỗn hợp mồi P105 1,5 Tổng + Cho µl hỗn hợp chuẩn bị vào mẫu DNA biến tính, nâng nhiệt độ 950C/1 phút để biến tính đầu dò, ủ 600C qua đêm (16h) để đầu dò gắn đặc hiệu với đoạn gen đích Bước 3: Nối hai đầu dò + Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng: Thành phần Thể tích (µl) Dung dịch đệm A Dung dịch đệm B Nuclease free water 25 Dung dịch gắn 65 Tổng 32 + Cho 32 µl dung dịch chuẩn bị vào hỗn hợp lai ủ qua đêm, tiếp tục chạy chu trình nhiệt: 540C/15 phút - 980C/5 phút - 40C ( sản phẩm lai giữ tuần/ 40C lâu -200C - Bước 4: Khuếch đại sản phẩm lai (PCR) + Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng: Thành phần Mồi có gắn huỳnh quang 152 Thể tích (µl) Dung dịch đệm Enzyme Nước DNA polymerase Tổng 5,5 0,5 10 µl Cho 10 µl dung dịch chuẩn bị vào hỗn hợp máy tiếp tục chạy chu trình nhiệt: + 95oC : 30 giây + 60oC : 30 giây x 30 chu kỳ o + 72 C : 60 giây + 72oC : 20 phút + 72oC : phút + Giữ 4oC - Điện di mao quản hệ thống phân tích đoạn máy Beckman Coulter GeXP + Tra mẫu marker vào giếng: Tra µl marker (mẫu kiểm tra chuẩn hóa điều kiện) vào giếng Với giếng lại, giếng tra µl sản phẩm DNA tương ứng + Chạy điện di: Cài đặt máy tiến hành điện di - Phân tích kết cơng cụ Coffalyser chuyên biệt (được cung cấp hãng MCR - Hà lan) PHỤ LỤC BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU Hành Họ tên ……………………………………………………………….………… Tuổi ……………………………………………………………………………… Giới (nam/nữ) …………………………………………………………………… Khoa/phòng……………………………………………………………………… Điện thoại liên hệ………………………………………………………………… Mã vào viện………………………………………… ………………………… Tiền sử bệnh tật………………………………………………………………… Mổ u não: rồi/chưa; mổ với chẩn đoán: ………………………… ; độ /2 /3 /4 153 Ngày năm mổ………………… Điều trị sau mổ: + xạ trị: khơng/có - đợt …………………………………… + hóa chất: khơng/có - đợt ………………………………… Kết chụp lại phim sau mổ: khơng/ có ………………………………………… Phát tái phát: ngày tháng năm………………………………………………… Thời gian xuất bệnh đến lúc vào viện……………………………………… Chẩn đoán bệnh ………………………………………………………………… Mã giải phẫu bệnh……………………………………………………………… Kết giải phẫu bệnh…………………………………………………………… Kích thước khối u………………………………………………………… Thời gian sống sau mổ…………………………………………………… 154 ... biến gen bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm" , với mục ti u: Xác định đột biến số gen bệnh u nguyên bào thần kinh đệm Phân tích số đặc điểm người bệnh u nguyên bào thần kinh đệm có đột biến gen. .. U nguyên bào thần kinh đệm, IDH hoang dã U nguyên bào thần kinh đệm, đột biến IDH U tế bào thần kinh đệm đường lan tỏa, đột biến H3K27M U tế bào thần kinh đệm nhánh, đột biến IDH xóa 1p/19q U. .. Chiến (2011), nghiên c u 150 bệnh nhân u tế bào thần kinh đệm hình sao, có 59 bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm (độ IV) chiếm tỉ lệ cao 39,3% Thời gian sống trung bình sau ph u thuật u độ IV 9,7