BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THANH NGÂN x¸c định đột biến gen smn1 số lợng gen smn2 kỹ thuật mlpa bệnh nhân thoáI hóa tủy thành viên gia đình Chuyờn ngành : Xét nghiệm Y học Mã số : 8720601 ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS.TRẦN VÂN KHÁNH HÀ NỘI - 2019 CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Giải thích BN Bệnh nhân NST Nhiễm sắc thê THCT Thối hóa tủy SMA Spinal Muscular Atrophy MLPA Multiplex Ligation- dependent Pobe Amplification CK Creatinine kinase SMN Survial Motor Neuron NAIP Neoronal Apotosis Inhibitory Protein MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Đặc điêm chung bệnh SMA 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh 1.1.2 Đặc điêm lâm sàng bệnh nhân SMA 1.1.3 Đặc điêm cận lâm sàng bệnh nhân SMA 1.1.4 Chẩn đoán phân biệt SMA 10 1.1.5 Đặc điêm về tần số mắc bệnh SMA 10 1.1.6 Di truyền học ý nghĩa xác định phả hệ bệnh SMA 10 1.1.7 Nguyên tắc phòng điều trị bệnh SMA 11 1.2 Cơ chế phân tử di truyền bệnh SMA 14 1.2.1 Cơ chế di truyền 14 1.2.2 Các dạng đột biến cấu trúc gen SMN 17 1.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định đột biến gen SMN1 SMN2 18 1.3.1 PCR-RFLP 18 1.3.2 Kỹ thuật giải trình tự gen máy tự động 19 1.3.3 Kỹ thuật MLPA 19 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.2 Địa điêm nghiên cứu 22 2.3 Thời gian nghiên cứu 22 2.4 Phương pháp nghiên cứu 22 2.4.1 Thiết kế nghiên cứu 22 2.4.2 Cỡ mẫu kỹ thuật chọn mẫu .22 2.5 Sơ đồ nghiên cứu 23 2.6 Công cụ kỹ thuật sử dụng nghiên cứu 23 2.6.1 Vật liệu sử dụng nghiên cứu .23 2.6.2 Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu .25 2.7 Đạo đức nghiên cứu 31 CHƯƠNG 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 3.1 Kết quả tách chiết DNA .32 3.2 Kết quả mục tiêu 1: Xác định đột biến gen SMN1 32 3.3 Kết quả mục tiêu 2: Xác định số bản gen SMN2 33 3.4 Kết quả tỷ lệ phát người lành mang gen bệnh .33 3.4.1 Tỷ lệ phát người lành mang gen bệnh thành viên gia đình bệnh nhân thối hóa tủy 33 3.4.2 Kết quả phân tích phả hệ gia đình bệnh nhân nghiên cứu .34 CHƯƠNG 4: DỰ KIẾN BÀN LUẬN 35 DỰ KIẾN KẾT LUẬN 36 DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ .36 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Tên, kích thước vị trí sản phẩm PCR Kit MLPA phát SMN1, SMN2 bệnh THCT 21 Bảng 3.1 Kết quả đo nồng độ độ tinh sạch mẫu DNA sau tách chiết từ máu ngoại vi bệnh nhân nhóm chứng 32 Bảng 3.2 Tỷ lệ đột biến gen SMN1 bệnh nhân 32 Bảng 3.3 Số bản gen SMN2 bệnh nhân 33 Bảng 3.4 Tỷ lệ người lành mang gen bệnh nhóm bố mẹ bệnh nhân 33 Bảng 3.5 Tỷ lệ người lành mang gen bệnh nhóm anh chị bệnh nhân 33 Bảng 3.6 Tỷ lệ thành viên gia đình có khơng mang gen đợt biến 34 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Teo tủy sống .8 Hình 1.2: Mơ hình điện đờ Hình 1.3 Sơ đồ di truyền cả ba mẹ đều người mang gen bệnh 12 Hình 1.4: Nối hai phân tử mRNA mã hóa SMN 14 Hình 1.5: Các gen SMN liên quan đến SMA 14 Hình 1.6: Sơ đờ khác biệt SMN1, SMN2 15 Hình 2.1 Các giai đoạn kỹ thuật MLPA 27 Hình 2.2 Mẫu chứng nam bình thường 28 Hình 2.3 Kết quả MLPA người lành mang gen .28 Hình 2.4: Kết quả MLPA bệnh nhân 28 Hình 2.5: Kết quả MLPA bệnh nhân 29 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh thối hóa tủy (Spinal muscular atrophy: SMA) mợt rối loạn thối hóa thần kinh, tự phát, đặc trưng yếu tiến triên SMA mô tả đầu tiên Werding vào năm 1891 sau Hoffman vào năm 1893 Đây một bệnh lý thần kinh di truyền, phổ biến thứ hai trẻ em Tần số mắc bệnh cũng cao ước tính khoảng 1/6000 ÷ 1/10000 trẻ sinh sống với tần suất người lành mang gen đợt biến 1/38÷ 1/50 ,, Bệnh SMA gây thối hóa t̀n tiến tế bào thần kinh sừng trước tủy sống dẫn đến suy yếu thối hóa đối xứng gốc chi, trương lực giảm, phản xạ gân xương giảm mất, lưỡi rung, biến dạng lồng ngực cứng khớp Đây một đột biến di truyền lặn nằm nhiễm sắc thê số 5, cả bố mẹ đều người mang gen bệnh khả sinh bị bệnh 25% [5] Gen SMN quy định tổng hợp protein SMN biêu chủ yếu tế bào thần kinh vận đợng tủy sống (spinal motor neuron) Gen SMN có hai bản rất giống SMN1 SMN2 Cả hai gen SMN1 SMN2 đều tổng hợp protein tương ứng, nhiên khác mợt vài nucleotid nên SMN1 tổng hợp protein có chức năng, protein gen SMN2 tổng hợp có chức rất hạn chế Các tác giả khẳng định đợt biến gen SMN1 ngun nhân gây nên bệnh SMA Theo nhiều nghiên cứu 94-99% bệnh nhân SMA đợt biến xóa đoạn exon 7; exon gen SMN1, 3-6% đột biến điêm Đợt biến xóa đoạn đợt biến dễ xác định, đợt biến điêm khó xác định nhiều đợt biến khơng có tính tập trung vào mợt số vị trí đặc hiệu mà nằm rải rác khắp chiều dài gen Đối với gen SMN2, phương phảp PCR định lượng, nhà nghiên cứu phát hầu hết bệnh nhân thối hóa tủy thê I mang bản gen SMN2 bệnh nhân thê II, thê III mang tới 3-4 bản gen SMN2 Chính vậy mà nhà khoa học cho đợt biến xố đoạn thực exon 7, exon gen SMN1 gây nên bệnh nhân thê I Trong bệnh nhân thê II, thê III, exon 7, exon gen SMN1 bị mất trình chuyên ngược gen (gen conversion) từ SMN1 sang SMN2 Trong cộng đồng, với tỷ lệ người lành mang gen đợt biến cao 1/38÷ 1/50, tần số mắc bệnh cũng rất cao 1/6000 ÷ 1/10000, bệnh với dấu hiệu nguy hiêm, tỷ lệ tử vong cao, đê lại di chứng nặng nề Do vậy bệnh thực không một vấn đề lớn bản thân người bệnh mà còn gánh nặng gia đình xã hợi Mặc du SMA nguy hiêm vậy chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu, phần lớn điều trị triệu chứng nên hầu hết bệnh nhân tử vong sớm Do vậy cần phải chẩn đốn sớm đợt biến gen SMN1 bệnh nhân, từ tiến hành phát người lành mang gen bệnh (bố, mẹ, anh chị em,…) đê quản lý hạn chế lan truyền gen bệnh cợng đờng Bên cạnh đó, cần tiến hành chẩn đoán trước sinh nhằm phát thai nhi mắc bệnh đê có hướng xử tri kịp thời, hạn chế tổn thương cho gia đình xã hội Hiện Việt Nam, một số tác giả sử dụng kỹ thuật PCR enzyme cắt giới hạn đê chẩn đốn bệnh thối hóa tủy, nhiên phương pháp phát bệnh nhân bị đột biến mất đoạn SMN1 đồng hợp tử mà không phát kiêu gen dị hợp tử, vậy bỏ sót bệnh nhân Hiện nay, Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) phương pháp ưu tiên chọn lựa chẩn đốn đợt biến mất đoạn ngắn, lặp đoạn cũng phát kiêu gen dị hợp tử với đợ xác cao cho kết quả nhanh chóng Xuất phát từ thực tiễn chúng tiến hành đề tài với hai mục tiêu: Xác định đột biến gen SMN1 kỹ thuật MLPA bệnh nhân mắc bệnh thối hóa tủy thành viên gia đình Xác định số bản copy gen SMN2 kỹ thuật MLPA bệnh nhân mắc bệnh thối hóa tủy thành viên gia đình CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm chung bệnh SMA 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh Từ năm 1891 Guido Werdnig một nhà thần kinh học người Australia, lần đầu tiên mơ tả đặc điềm lâm sàng bệnh thối hóa tủy hai anh em bị bệnh tuổi bú mẹ Cho đến năm 1893 Johan Hoffmann một nhà thần kinh học người Đức, cũng mô tả biêu lâm sàng bệnh nhân hai gia đình bị bệnh thối hóa tủy Sau nhiều năm, Brandt (1949) nghiên cứu 112 bệnh nhân thuộc 70 gia đình đưa kết luận bệnh di truyền lặn NST thường Sau nghiên cứu này, nhiều cơng trình nghiên cứu cơng bố sau cũng cho kêt luận tương tự Kugelberg Welander (1956) mô tả đặc điêm 12 bệnh nhân mắc bệnh thối hóa tủy thê III có đợ tuổi từ đễn 17 đều có khả lại nhất 8-9 năm sau triệu chứng đẩu tiên xuất Dựa triệu chứng lâm sàng, Fried Emery (1971) đưa thê bệnh trung gian hay còn gọi thối hóa tủy thê II, nhóm bệnh nhân tḥc thê đặc điêm trung gian bệnh thối hóa tủy thê I thê III Nhờ tiến bộ không ngừng ngành di truyền học phân tử, vào năm 1990 bệnh thoái hóa tủy nghiên cứu xác định vung gen gây bệnh nằm cánh dài NST số vung 5q11.2 … 5q 13.3 Hội nghị quốc tế về bệnh thối hóa tủy diễn vào tháng năm 1992 tại Bonn (Đức) đưa tiêu chuẩn lâm sàng chẩn đoán bệnh SMA Năm 1995, việc phát đột biến mất đoạn vị trí cánh dài NST số tiếp khẳng định Lefebvre Các nghiên cứu cho thấy có hai gen liên quan đến bệnh thối hóa tủy gen SMN1 (telomeric survial motor neuron) NAIP (neoronal apotosis inhibitory protein), gen SMN1 nguyên nhân bệnh, 94-99% bệnh nhân SMA đột biến mất đoạn exon 7; exon gen SMN1, 3-6% đột biến điêm Năm 1999, tại hội nghị quốc tế lần thứ 59 trung tâm thân kinh Châu Âu (ENMC: Euro Neuromuscular Centrer) tiếp tục bổ xung tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh thoái hóa tủy Y học đại ngày phát triên, chúng ta với cách mạng công nghệ lần thứ có lĩnh vực cơng nghệ sinh học dần làm rõ cấu trúc phân tử bệnh SMA Tuy nhiên Việt Nam còn hạn chế nhất định cỡ mẫu nghiên cứu còn nhỏ Năm 2002, Trần Vân Khánh cợng có nghiên cứu phối hợp với đại học Kobe Nhật Bản phát đột biến gen SMA bệnh nhân Việt Nam số lượng bệnh nhân cũng rất hạn chế [20] Lê Minh năm 2003 với đề tài: Bệnh teo tủy sống type III “Nhận xét về hai trường hợp điêm lại y văn” nhận xét nhận xét về trường hợp thối hóa tủy thê III [17] Các tác giả mơ tả đặc điêm lâm sàng, hình ảnh phả hệ hai trường hợp chị em ruột bị SMA thê III Năm 2005 Nguyễn Ngọc Khánh với nghiên cứu đặc điêm lâm sàng xét nghiệm chẩn đốn bệnh thối hóa tủy [18] Ở Việt Nam cũng có nhiều nghiên cứu về mơ hình bệnh tật di trùn nghiên cứu tại bệnh viện Nhi Trung Ương 10 năm SMA chiếm 2,99% hệ thống da xương sụn (Phan Lương Quyết 2005) Đến năm 2011, Lê Thị Hương Lan, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Hà, Tạ Thành Văn thực đề tài “Xác định đợt biến xóa đoạn gen SMN1 gây bệnh thối hóa tủy” làm rõ vai trò gen SMN1 SMA, từ nền tảng cho việc sàng lọc chẩn đoán SMA tại Việt Nam [32] Những năm gần nhà khoa học quan tâm đến gen SMN1 còn quan tâm đến nhiều gen khác có liên quan đến SMA 1.1.2 Đặc điểm lâm sàng bệnh nhân SMA 1.1.2.1 Đặc điểm chung và phân loại Bệnh thối hóa tủy có biêu triệu chứng lâm sàng rất đặc trưng tổn thương tế bào thần kinh sừng trước tủy sống, làm cho trẻ có biêu nhược sớm, không phát triên vận động, teo bệnh tiến triên nặng dần, mất khả vận động, suy hô hấp tử vong mắc bệnh nhiễm trung viêm phổi Tuy vậy, bệnh cũng dễ chẩn đoán nhầm với bệnh lý về nguyên nhân khác Ngay bản thân bệnh thối hóa tủy, triệu chứng lâm sàng cũng khác thê lâm sàng nguyên nhân gây bệnh khác nhau: đột biến gen khác nhau, loại đợt biến khác cũng gây kiêu hình (phenotype) khác lâm sàng 26 - Ly tâm 14000 vòng/phút phút - Bỏ dịch nổi, đê khô 56ºC 20 phút - Thêm 50 µl DNA Rehydration Solution - Ủ 65ºC đê qua đêm nhiệt độ phòng DNA tách chiết se kiêm tra độ tinh sạch phương pháp đo mật đợ quang bước sóng 260/280 nm * Nguyên lý đo mật độ quang học: - Acid nucleic có phổ hấp phụ cực đại bước sóng 260nm có mặt base purin base pyrimidin Giá trị mật độ quang bước sóng 260nm (OD260nm) mẫu cho phép xác định nờng đợ acid nucleic có mẫu nghiên cứu - Protein hấp thụ ánh sáng tử ngoại bước sóng 280nm hấp thụ acid amin nhân thơm dị vòng, bao gồm: tyrosin, tryptophan phenylalanin - Dựa vào tỷ lệ OD260nm/OD280nm đê kiêm tra độ tinh sạch DNA Nếu OD260nm/OD280nm = 1,8 – 2,0 DNA coi tinh sạch * Tiến hành đo mật độ quang học - Khởi động phần mềm đo mật độ quang NanoDrop - Dung pipet nhỏ µl DNA Dehydration Solution vào vị trí đo đê làm dung dịch đối chiếu Sau nhấn vào biêu tượng Blank hình - Sử dụng giấy thấm khăn lau sạch lượng dung dịch tại vị trí đo - Tiếp tục dung pipet nhỏ µl mẫu DNA cần đo Và nhấn vào biêu tượng Measure hình Sau giây phần mềm se hiên thị nồng độ DNA độ tinh sạch mẫu đo - Sau mỗi lần đo, cần chú ý lau sạch mẫu đo cũ tại vị trí đo 2.6.2.2 Kỹ thuật MLPA 27 Hình 2.1 Các giai đoạn kỹ thuật MLPA 28 Hình 2.2 Mẫu chứng nam bình thường Hình 2.3 Kết quả MLPA người lành mang gen (1bản gen SMN1, 2bản genSMN2) Hình 2.4: Kết quả MLPA bệnh nhân (3bản genSMN1, 1bản gen SMN2) 29 Hình 2.5: Kết quả MLPA bệnh nhân (4bản genSMN1, 0bản gen SMN2) Các bước tiến hành phản ứng MLPA - Bước 1: Biến tính DNA: Cho 5µl dung dịch DNA (nồng độ 50 – 100ng tối ưu) cần phân tích vào ống PCR biến tính 980C phút, chuyên về giữ 250C trước biến tính trở lại -Bước 2: Gắn (lai) probe vào gen đích + Ch̉n bị hỡn hợp lai: hóa chất lấy cần votex nhẹ cho đều Thành phần Thê tích Dung dịch đệm MLPA( nắp vàng) 1,5µl Hỡn hợp probe( nắp đen ) 1,5µl Tổng 3µl + Cho 3µl hỡn hợp lai vào mẫu DNA biến tính (trộn đều pipet,lưu ý không tạo bọt), nâng nhiệt đợ lên 950C phút đê biến tính probe, hạ nhiệt độ xống 600C ủ qua đêm (16 – 20h) Đây nhiệt độ đê probe gắn đặc hiệu vào đoạn gen đích - Bước 3: Nối đầu probe Chuẩn bị dung dịch đệm gắn probe: hóa chất lấy cần votex nhẹ cho đều 30 Thành phần Thê tích Dung dịch đệm A( nắp suốt) 3µl Dung dịch đệm B( nắp trắng) 3µl Nước 25µl Enzym ligase 65 (nắp xanh cây) 1µl Tổng 32µl + Cho 32µl dung dịch đệm gắn probe vào hỡn hợp lai ủ qua đêm mẫu 540C , tiếp tục chạy theo chu trình nhiệt sau: 540C/ 15 phút→ 980C/ phút→giữ 200C - Bước 4: Khuếch đại sản phẩm lai (probe) + Chuẩn bị hỡn hợp phản ứng PCR: Thành phần Nước Thê tích 7.5µl SALSA PCR primer( nắp màu nâu) 2µl SALSA polymerase (nắp màu cam) 0.5µl Tổng 10µl Cho 10µl vào hỗn hợp máy, trộn lần pipet khơng tạo bọt Tiếp tục chu trình nhiệt: 950C :30 giây 600C :30 giây x 35 chu kỳ 720C :60 giây 720C : 20 phút Giữ 150C Sản phẩm khuếch đại probe se điện di mao quản huỳnh quang máy giải trình tự đê phân tích kết quả 2.7 Đạo đức nghiên cứu Các gia đình bệnh nhân tham gia vào đối tượng nghiên cứu tinh thần tự nguyện, hợp tác gia đình có bị bệnh chẩn đốn xác định thối hóa tủy 31 - Các xét nghiệm phân tích gen thực có đờng ý bệnh nhân, cha mẹ thành viên gia đình người bệnh - Các thơng tin cá nhân bệnh nhân người nhà bệnh nhân giữ bí mật đặc biệt kết quả chẩn đốn bệnh - Bệnh nhân gia đình người bệnh có thê rút khỏi chương trình nghiên cứu bất cứ lúc không muốn - Các kỹ thuật thao tác bệnh nhân đảm bảo đúng chuyên môn - Đề tài nghiên cứu thực hồn tồn mục đích khoa học chứ khơng mục đích khác 32 CHƯƠNG DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết quả tách chiết DNA DNA bệnh nhân, người nhà bệnh nhân mẫu đối chứng tách chiết theo kit PROMEGA Bảng 3.1 Kết quả đo nồng độ độ tinh mẫu DNA sau tách chiết từ máu ngoại vi bệnh nhân nhóm chứng Mã số bệnh nhân Nờng đợ DNA(ng/µl) Đợ tinh sạch (A260/A280) 3.2 Kết quả mục tiêu 1: Xác định đột biến gen SMN1 Bảng 3.2 Tỷ lệ đột biến gen SMN1 bệnh nhân Kết quả Có đợt biến Khơng đợt biến Tổng số n Tỷ lệ % 33 3.3 Kết quả mục tiêu 2: Xác định số bản gen SMN2 Bảng 3.3 Số bản gen SMN2 bệnh nhân Kết quả bản gen SMN2 bản gen SMN2 bản gen SMN2 bản gen SMN2 bản gen SMN2 Tổng số n Tỷ lệ % 3.4 Kết quả tỷ lệ phát người lành mang gen bệnh 3.4.1 Tỷ lệ phát hiện người lành mang gen bệnh thành viên gia đình bệnh nhân thối hóa tủy Bảng 3.4 Tỷ lệ người lành mang gen bệnh nhóm bố me bệnh nhân Kết quả n Tỷ lệ % Có mang gen Không mang gen Tổng số Bảng 3.5 Tỷ lệ người lành mang gen bệnh nhóm anh chị bệnh nhân Kết quả Có mang gen Khơng mang gen Tổng số n Tỷ lệ % 34 3.4.2 Kết quả phân tích phả hệ gia đình bệnh nhân nghiên cứu Bảng 3.6 Tỷ lệ thành viên gia đình có khơng mang gen đột biến Gia đình bệnh nhân Có tiền sử gia đình Khơng có tiền sử gia đình Tổng số Mang gen đợt biến n Tỷ lệ Không mang gen đột biến n Tỷ lệ Tổng số n Tỷ lệ 35 CHƯƠNG DỰ KIẾN BÀN LUẬN Dự kiến bàn luận theo mục tiêu kết quả thu từ nghiên cứu 36 DỰ KIẾN KẾT LUẬN Kết luận theo mục tiêu kết quả thu từ nghiên cứu DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ Dựa vào kết quả nghiên cứu thu đê đề xuất TÀI LIỆU THAM KHẢO Pearn J (1980) Classification of spinal muscular atrophies The Lancet, 315 (8174), 919-922 Ben-Shachar S, Orr-Urtreger A, Bardugo E, et al (2011) Large-scale population screening for spinal muscular atrophy: clinical implications Genetics in Medicine, 13 (2), 110 Rodríguez M, Vaillant T, Guillot M, et al (2017) PCR-RFLP evidences peculiarities in Spinal Muscular Atrophy among Cuban Patients J Neurol Neurol Sci Disord, (2), 051-052 Alías L, Barceló M, Bernal S, et al (2014) Improving detection and genetic counseling in carriers of spinal muscular atrophy with two copies of the SMN1 gene Clinical genetics, 85 (5), 470-475 Munsat T L, Davies K E (1992) International SMA consortium meeting (26–28 June 1992, Bonn, Germany) Neuromuscular Disorders, (5), 423-428 Anhuf D, Eggermann T, Rudnik‐Schöneborn S, et al (2003).Determination of SMN1 and SMN2 copy number using TaqMan™ technology Human mutation, 22 (1), 74-78 Hồng Thị Hùn, Đỡ Thị Thanh Thủy, Ngũn Thị Thu Tâm, et al (2012).Ứng dụng kỹ thuật PCR-RFLP (Restriction fragment length polymorphism) xác định đột biến gen SMN1 gây bệnh thối hóa tủy.Y học Thành phố Hờ Chí Minh, Tập 16: Tr.79-85 Schouten J P, McElgunn C J, Waaijer R, et al (2002) Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation- dependent probe amplification Nucleic acids research, 30 (12), e57-e57 Brandt S (1949) Hereditary factors in infantile progressive muscular atrophy: Study of one hundred and twelve cases in seventy families American Journal of Diseases of Children, 78 (2), 226-236 10 Korf B (1995) Molecular diagnosis New England Journal of Medicine, 332 (22), 1499-1502 11 Gilliam T, Brzustowicz L, Castilla L, et al (1990) Genetic homogeneity between acute and chronic forms of spinal muscular atrophy Nature, 345 (6278), 823 12 Miskovic M, Lalic T, Radivojevic D, et al (2011) Lower incidence of deletions in the survival of motor neuron gene and the neuronal apoptosis inhibitory protein gene in children with spinal muscular atrophy from Serbia The Tohoku journal of experimental medicine,225 (3), 153-159 13 Calì F, Ruggeri G, Chiavetta V, et al (2014) Carrier screening for spinal muscular atrophy in Italian population Journal of genetics, 93 (1), 179-181 14 Lefebvre S, Bürglen L, Reboullet S, et al (1995) Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene Cell, 80 (1), 155-165 15 Ogino S, Wilson R B (2002) Genetic testing and risk assessment for spinal muscular atrophy (SMA) Human genetics, 111 (6), 477-500 16 Lai A, Tan E, Law H, et al (2005) SMN1 deletions among Singaporean patients with spinal muscular atrophy Ann Acad Med Singapore, 34(1), 73-77 17 Lê Minh (2003) Bệnh teo tủy sống type III, nhận xét về hai trường hợp điêm lại y văn Y học Thành phố Hồ Chí Minh, tập san đặc biệt về thần kinh, tập 7, số tr 150-155 18 Nguyễn Ngọc Khánh (2005) Nghiên cứu đặc điêm lâm sàng xét nghiệm chẩn đốn bệnh thối hóa tủy Ḷn văn thạc sỹ y học,Đại học Y Hà Nội 19 Luo M, Liu L, Peter I, et al (2014) An Ashkenazi Jewish SMN1 haplotype specific to duplication alleles improves pan-ethnic carrier screening for spinal muscular atrophy Genetics in Medicine, 16 (2),149 20 Van Khanh T, Takeshima Y, Harada Y, et al (2002) Molecular genetic analyses of five Vietnamese patients with spinal muscular atrophy KOBE JOURNAL OF MEDICAL SCIENCES, 48 (5/6), 177-182 21 Landaburu I, Gonzalvo M-C, Clavero A, et al (2013) Genetic testing of sperm donors for cystic fibrosis and spinal muscular atrophy:evaluation of clinical utility European Journal of Obstetrics &Gynecology and Reproductive Biology, 170 (1), 183-187 22 Tạ Thành Văn (2011) Bệnh học phân tử, nhà xuất bản Y học, tr 26-40 23 Burnett B G, Muñoz E, Tandon A, et al (2009) Regulation of SMN protein stability Molecular and cellular biology, 29 (5), 1107-1115 24 Coady T H, Shababi M, Tullis G E, et al (2007) Restoration of SMN function: delivery of a trans-splicing RNA re-directs SMN2 pre-Mrna splicing Molecular Therapy, 15 (8), 1471-1478 25 Amara A, Adala L, Charfeddine I B, et al (2012) Correlation of SMN2, NAIP, p44, H4F5 and Occludin genes copy number with spinal muscular atrophy phenotype in Tunisian patients european journal of paediatric neurology, 16 (2), 167-174 26 Daffos F, Capella-Pavlovsky M, Forestier F (1985) Fetal blood, sampling during pregnancy with use of a needle guided by ultrasound: a study of 606 consecutive cases American journal of obstetrics and gynecology, 153 (6), 655-660 27 Su Y N, Hung C C, Li H, et al (2005) Quantitative analysis of SMN1 and SMN2 genes based on DHPLC: A highly efficient and reliable carrierscreening test Human mutation, 25 (5), 460-467 28 Fang P, Li L, Zeng J, et al (2015) Molecular characterization and copy number of SMN1, SMN2 and NAIP in Chinese patients with spinal muscular atrophy and unrelated healthy controls BMC Musculoskelet Disord, 16 (1), 11 29 Wirth B, Schmidt T, Hahnen E, et al (1997) De novo rearrangements found in 2% of index patients with spinal muscular atrophy: mutational mechanisms, arental origin, mutation rate, and implications for genetic counseling The American Journal of Human Genetics, 61 (5), 1102-1111 30 Varga R-E, Mumtaz R, Jahic A, et al (2012) MLPA-based evidence for sequence gain: pitfalls in confirmation and necessity for exclusion of false positives Analytical biochemistry, 421 (2), 799-801 31 Arkblad E L, Darin N, Berg K, et al (2006) Multiplex ligation-dependent probe amplification improves diagnostics in spinal muscular atrophy Neuromuscular Disorders, 16 (12), 830-838 32 Lê Thị Hương Lan, Trần Vân Khánh, Nguyễn Thị Hà, et al (2011) Xác định đợt biến xóa đoạn gen SMN1 gây bệnh thối hóa tủy Tạp chí Yhọc Việt Nam, 377,tr 351-354 ... đột biến gen SMN1 kỹ thuật MLPA bệnh nhân mắc bệnh thoái hóa tủy thành viên gia đình Xác định số bản copy gen SMN2 kỹ thuật MLPA bệnh nhân mắc bệnh thối hóa tủy thành viên gia đình 3 CHƯƠNG... đột biến gen SMN 1và số bản gen SMN2 kỹ thuật MLPA Phân tích kết quả MLPA phần mềm Coffalyse đê xác định đột biến gen SMN1 số bản gen SMN2 Bệnh nhân có đợt biến gen SMN1 Làm xét nghiệm xác. .. tiêu 1: Xác định đột biến gen SMN1 Bảng 3.2 Tỷ lệ đột biến gen SMN1 bệnh nhân Kết quả Có đợt biến Không đột biến Tổng số n Tỷ lệ % 33 3.3 Kết quả mục tiêu 2: Xác định số bản gen SMN2 Bảng