VN U ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI dP rm ac y, KHOA Y DƯỢC ine an TRẦN NGỌC TUÂN M ed ic NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ATRACTYLENOLIDE III TRONG THÂN RỄ BẠCH TRUẬT (Atractylodes macrophala Koidz) BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO BẮT CẶP DETECTOR DAD Co py rig ht @ Sc ho ol of KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2019 KHOA Y DƯỢC ac y, Người thực : TRẦN NGỌC TUÂN VN U ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI dP rm NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ATRACTYLENOLIDE III TRONG THÂN RỄ BẠCH TRUẬT (Atractylodes macrophala Koidz) BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO BẮT CẶP DETECTOR DAD Khóa: QH2014.Y Người hướng dẫn: ed ic TS Hoàng Lê Sơn ine an KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Co py rig ht @ Sc ho ol of M PGS.TS Nguyễn Thanh Hải HÀ NỘI – 2019 LỜI CẢM ƠN ac y, VN U Trước tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới Tiến sĩ Hoàng Lê Sơn – Khoa Bào chế Chế biến PGS.Tiến sĩ Nguyễn Thanh Hải – Chủ nhiệm môn Bào chế khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Dược Liệu người tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ tơi suốt q trình thực khóa luận dP rm Tôi xin cảm ơn thầy cô môn Bào chế - khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội khoa Bào chế Chế biến – Viện Dược Liệu, tạo điều kiện để thực khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm, Phòng ban khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội tồn thể thầy giáo khoa cho kiến thức quý báu suốt năm học tập, sinh hoạt rèn luyện khoa ine an Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình bạn bè ln bên cạnh, động viên tơi lúc khó khắn q trình thực khóa luận tháng Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ic Hà Nội, ngày Trần Ngọc Tuân năm 2019 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Giới hạn phát (Limit Of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit Of Quantitation) HPLC Sắc ký lỏng hiệu Chromatography) DAD Máy đo quang (Diode Array Detector) RSD Độ lệch chuẩn tương đối ACN Acetonitrile USP Dược điển Hoa Kì ICH Hội nghị quốc tế hài hồ hố thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho người an ine ed ic M of ho ol Sc @ ht rig py Co (High Performance dP rm cao Liquid ac y, VN U LOD DANH MỤC BẢNG BIỂU Số trang Hóa chất thuốc thử dùng nghiên cứu Trang thiết bị, máy móc sủ dụng nghiên cứu 16 Kết sắc ký đồ khảo sát hệ dung mơi pha động với chương trình chạy đẳng dòng HPLC-DAD, bước sóng phát 220nm Kết diện tích pic lần chiết mẫu Bạch truật với Ethanol 96% phân tích HPLC-DAD 17 Các thông số đánh giá HPLC Atractylenolide III 18 Kết độ tuyến tính phương pháp HPLC định lượng Atractylenolide III với dãy nồng độ chuẩn 20 21 Kết đánh giá tính thích hợp hệ thống phương pháp định lượng Atractylenolide III với mẫu chuẩn nồng độ 26µg/ml Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp định lượng Atractylenolide III với mẫu Bạch truật chiết với Ethanol 96% 22 Kết đánh giá độ thu hồi phương pháp định lượng mẫu thử thêm chuẩn Atractylenolide III 22 10 Kết xác định hàm lượng Atractylenolide III mẫu Bạch truật Việt Nam Trung Quốc 23 M ed ic ine an dP rm ac y, of ho ol Sc @ ht rig py Co VN U Tên bảng Bảng DANH MỤC HÌNH ẢNH Tên hình Số trang VN U Hình Cơng thức cấu tạo số chất bạch truật Công thức cấu tạo Atractylenolide III Sắc ký đồ phân tích bước sóng 220nm - 254nm bước sóng hấp thụ cực đại Atractylenolide III 15 Sắc ký đồ HPLCđánh giá độ đặc hiệu phương pháp định lượng Atractylenolide III với mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn mẫu chuẩn 28 Sắc ký đồ HPLC Atractylenolide III với nồng độ 0,065µg/ml 0,65µg/ml 19 Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ nồng độ diện tích pic dung dịch chất chuẩn Atractylenolide III 20 Sắc ký đồ phân tích Atractylenolide III mẫu Bạch truật HPLC-DAD 24 Phổ hấp thụ UV thành phần khác mẫu Bạch truật Việt Nam 24 Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ic ine an dP rm ac y, MỤC LỤC VN U MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG - TỔNG QUAN ac y, 1.1 Giới thiệu chung bạch truật 1.1.1 Tên khoa học dP rm 1.1.2 Mô tả thực vật, phận dùng 1.1.3 Phân bố, thu hái chế biến 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Tác dụng dược lý .5 an 1.2 Tổng quan vị thuốc Bạch thuật ine 1.3 Vài nét hoạt chất Atractylenolide III 1.4 Các nghiên cứu định lượng Atractylenolide III bạch truật .8 ed ic CHƯƠNG - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu M 2.2 Trang thiết bị, dung mơi, hóa chất of 2.3 Phương pháp nghiên cứu 10 2.3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 10 ho ol 2.3.2 Phương pháp xử lý mẫu 10 2.3.3 Thẩm định quy trình phân tích 10 Sc 2.3.4 Phương pháp xử lý đánh giá kết 13 CHƯƠNG - KẾT QUẢ 15 @ 3.1 Xây dựng phương pháp định lượng Atractylenolide III 15 ht 3.1.1 Xác định bước sóng phát chất chuẩn Atractylenolide III 15 rig 3.1.2 Xây dựng điều kiện sắc ký mẫu Bạch truật HPLC-DAD 15 Co py 3.1.3 Xác định điều kiện tối ưu hóa xử lý mẫu 17 3.1.4 Điều kiện chạy sắc ký HPLC 17 3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 18 3.2.1 Tính đặc hiệu phương pháp 18 VN U 3.2.2 Giới hạn phát giới hạn định lượng 19 3.2.3 Độ tuyến tính 19 3.2.4 Độ thích hợp hệ thống 21 ac y, 3.2.5 Độ lặp lại 21 3.2.6 Độ 22 dP rm 3.3 Ứng dụng phương pháp xác định hàm lượng dược chất củ Bạch truật 23 CHƯƠNG - BÀN LUẬN 25 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 26 Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ic ine an TÀI LIỆU THAM KHẢO MỞ ĐẦU VN U Bạch truật vị thuốc từ loài Atractylodes macrocephala Koidz (Họ Compossitae), có vị trí quan trọng cổ phương đơn độc Đông Á ngàn năm để điều trị số chứng bệnh đau dày, bụng ac y, trướng đầy, ung thư, chứng lỗng xương béo phì Khoảng bảy mươi hợp chất xác định cấu trúc hóa học đa phần thuộc nhóm dP rm sesquiterpenoid, phenolic acid polyacetylene mối liên hệ với tác dụng lâm sàng chưa rõ ràng Cả chất tinh khiết lẫn cao dịch chiết thể tác dụng dược lý mạnh cải thiện hệ tiêu hóa thơng qua bào IEC-6, kháng số dòng tế bào ung thư gồm HepG2, LOVO, CEM, MKN-45, kích thích miễn dịch, kháng viêm, chống oxy hóa, cải thiện khả nhớ chuột Với lợi ích an lâm sàng hiệu điều trị chứng minh, Bạch truật bắt đầu di thực ine Việt Nam từ năm 1970 trồng phổ biên Lào Cai, Sơn La, Hà Giang, Hà Nội Lâm Đồng Hiện tại, nghiên cứu công bố hàm lượng dược ed ic chất có Bạch truật di thực hạn chế Do đó, chúng tơi thực đề tài “Nghiên cứu định lượng Atractylenolide III thân rễ bạch truật M (Atractylodes macrophala Koidz) sắc ký lỏng hiệu cao bắt cặp - of detector DAD” với hai mục tiêu đây: Xây dựng phương pháp định lượng Atractylenolide III thân rễ - ho ol Bạch truật phương pháp HPLC-DAD Ứng dụng phương pháp để định lượng hàm lượng Atractylenolide III Sc mẫu Bạch truật Việt Nam Trung Quốc @ Lựa chọn chất nghiên cứu Atractylenolide III hoạt chất thể tác dụng bảo vệ đường tiêu hóa, chống lỗng xương, cải thiện trí nhớ, kháng ht viêm mơ hình dược lý giải thích sau Hàm lượng Atractylenolide rig III thấp so với atractylenolide I II gây khó khăn trình định lượng py điều phản ảnh thực tế tác dụng cao dịch chiết Bạch truật lại tốt đơn chất riêng biệt Kiểm soát chất nhỏ có lợi ích trường hợp Co CHƯƠNG - TỔNG QUAN VN U 1.1 Giới thiệu chung bạch truật 1.1.1 Tên khoa học ac y, Bạch truật có tên khoa học Atractylodes macrocephala Koidz thuộc họ Cúc (Compossitae) [1] dP rm 1.1.2 Mô tả thực vật, phận dùng Đặc điểm: Cây thảo, sống lâu năm, có thân rễ to, mọc đất Thân thẳng, cao 0.3-0.8m, đơn độc phân nhánh phận trên, phần thân hóa gỗ Lá mọc cách, dài Lá phần thân có cuống dài, phần có cuống ngắn, gốc rộng, bọc lấy thân Phiến xẻ sâu thành thùy, thùy lớn, hình trứng tròn, an hai đầu nhọn, hai thùy bên nhỏ hơn, hình trứng mũi mác, phần gốc khơng đối xứng ine Các gần thân có phiến ngun, hình thn hình trứng mũi mác, mép có cưa Đầu lớn, phần có bắc hình xẻ sâu, hình lơng chim Bao ed ic hình chng, có bắc mỏng xếp thành hàng Lá bắc nhỏ hình trứng tam giác, to dần phía Hoa nhiều, tràng hình ống, phần màu trắng, phần M màu đỏ tím, xẻ làm thùy hình mũi mác, xoắn ngồi Năm nhị hàn liền (có of nhị bị thối hóa), nhị hình sợi dẹp Bầu thon mặt ngồi có lơng nhung, màu nâu nhạt, đoạn có lơng hình lơng chim Vòi hình màu tím nhạt đầu nhị xẻ thành ho ol thùy nơng hình đầu, mặt ngồi có lơng ngắn Quả bế, thuôn, dẹp, màu xám [2] ngà [2,10] Sc Bộ phận dùng làm thuốc: Dùng thân rễ cứng chắc, có dầu thơm nhẹ, ruột màu trắng @ 1.1.3 Phân bố, thu hái chế biến Phân bố: Bạch truật trồng chủ yếu Trung Quốc Đến năm 1970, Bạch truật ht bắt đầu di thực trồng Lào Cai, Sơn La, Hà Giang, Hà Nội rig Lâm Đồng [2,10] py Thu hái sơ chế: Cây trồng bạch truật thu hái từ cuối tháng 10 đến đầu tháng 11 Co (thường từ 8-22/11) Lúc thu hoạch, chọn ngày nắng ráo, đất khô, nhổ nhẹ nhàng Sau nhổ, lấy dao cất bỏ thân đem củ chế biến [1,10] 3.1 Xây dựng phương pháp định lượng Atractylenolide III VN U CHƯƠNG - KẾT QUẢ 3.1.1 Xác định bước sóng phát chất chuẩn Atractylenolide III ac y, Tiến hành khảo sát với mẫu chuẩn Atractylenolide III với nồng độ 6.5µg/ml điều kiênh cột Supleco C18, tốc độ dòng 1ml/phút, chế độ chạy sắc ký gradient dung môi an dP rm ACN từ 20 đến 80% 60 phút Kết thu hình ine A B ed ic Hình 3: Sắc ký đồ HPLC bước sóng hấp thụ cực đại Atractylenolide III đó: A – sắc ký đồ chất chuẩn bước sóng 1- 254nm 2- bước sóng 220nm; M B – Bước sóng hấp thụ cực đại of Kết nhận xét: Chúng ta thấy mẫu hấp thụ cực đại bước sóng 220nm Dựa vào sắc ký đò, chúng tơi thấy chất chuẩn Atractylenolide III mà chúng tơi sử ho ol dụng hồn tồn theo tiêu chuẩn nhà sản xuất với độ tinh khiết 98% Sc 3.1.2 Xây dựng điều kiện sắc ký mẫu Bạch truật HPLC-DAD Chuẩn bị mẫu thử với phương pháp xử lý mẫu nêu dung môi Ethanol @ 96% Tiến hành sắc ký kháo sát pha động với điều kiện sắc ký khảo sát pha động với cột pha đảo Supleco C18, tốc độ dòng ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20µl, Co py rig ht nhiệt độ phòng 250C chế độ chạy đẳng dòng Kết thu bảng 3: 15 Bảng 3: Kết sắc ký đồ khảo sát hệ dung mơi pha động với chương trình Hệ dung môi Sắc ký đồ Dataf ile Name:Et-AMTQ.2.lcd m AU 220nm ,4nm MeOH 200 ac y, Hệ 1: Thời gian 150 100 50 0.0 2.5 dP rm 0-15 VN U chạy đẳng dòng HPLC-DAD, bước sóng phát 220nm 5.0 7.5 10.0 12.5 m in tR=13,044 Dataf ile Name:EtOH-AM-ACN-20-80.lcd Hệ 2: m AU 254nm ,4nm 5.0 CAN an Thời gian 2.5 20 ine 0.0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 m in tR= 27,481 ed ic 0-30 Datafi l e Name:n-hexan-AM-ACN gradi ent 45-50.lcd Hệ 3: 100 mAU 220nm,4nm of 45 ho ol 0-30 CAN M 75 Thời gian Sc Hệ 4: @ Thời gian 0-30 CAN 43 50 25 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 tR= 19,835 Dataf ile Name:Et-AM-43ACN.5.lcd 25 mAU 220nm,4nm 20 15 10 5.0 ht 0.0 10.0 15.0 rig tR= 23,356 Co py tR (phút): Thời gian lưu hoạt chất cần phân tích Atractylenolide III 16 20.0 25.0 Kết quả: Chúng thấy hệ dung môi ACN Nước tỷ lệ 43:57 cho sắc ký đồ tốt VN U nhất, phân tách rõ ràng, pic khơng có tượng kéo đuôi, thời gian lưu đủ dài để rửa giải không làm pic chồng lên 3.1.3 Xác định điều kiện tối ưu hóa xử lý mẫu ac y, Chúng tiến hành xử lý mẫu bạch truật với dung môi Nước, Ethanol 30%, 50%, 70%, 96%, Methanol n-hexane, phương pháp siêu âm Từ kết chạy sắc mẫu dung môi Ethanol 96% tốt dP rm ký lỏng hiệu cao với mẫu xử lý trên, thấy việc xử lý Tiếp theo, tiến hành xử lý mẫu bạch truật với dung dịch Ethanol 96% chiết phương pháp siêu âm lần Kết thu bảng an Bảng 4: Kết diện tích pic lần chiết mẫu bạch với Ethanol 96% phân Lần M Lần ed ic Lần chiết ine tích HPLC-DAD S pic 216030 24229 Lần ho ol of Kết quả: Sau lần chiết, hàm lượng dược chất dược liệu hết hoàn toàn Lần chiết thứ 2, diện tich pic 1/10 diện tích pic chiết lần Sc Nhận xét: Từ kết trên, lựa chọn phương pháp chiết sau âm mẫu Bạch @ truật lần ht 3.1.4 Điều kiện chạy sắc ký HPLC rig Dựa vào nghiên cứu trên, xác định điều kiện chạy sắc ký Co py sau: - Cột pha đảo Supleco C18 (5µm, 250 x 46mm) - Tốc độ dòng ml/phút - Nhiệt độ phòng 250C 17 Bước sóng 220 nm - Pha động đẳng dòng với hệ dung môi ACN Nước (43:57) 30 VN U - phút Các thơng số peak trình bày bảng dP rm Thông số đánh giá STT ac y, Bảng 5: Các thông số HPLC đánh giá Atractylenolide III Thời gian lưu, tR Diện tích pic (ứng với dung dịch chuẩn có nồng độ 26µg/ml) Độ phân giải, R Hệ số kéo đuôi pic Số đĩa lý thuyết ed ic ine an Giá trị 23,356 2452822 26,054 1,244 1662,6 M 3.2 Thẩm định phương pháp phân tích of 3.2.1 Tính đặc hiệu phương pháp ho ol Tiến hành phân tích mẫu: Dung dịch Atractylenolid III chuẩn, dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu thử thêm chuẩn dung dịch mẫu trắng với điều kiện phân tích HPLC trình bày trên, thu kết đánh giá sắc ký đồ tương ứng Co py rig ht @ Sc hình Hình 4: Sắc ký đồ HPLC đánh giá độ đặc hiệu phương pháp đó: 1Mẫu trắng; 2- Mẫu thử; 3-Mẫu thử thêm chuẩn; 4- Mẫu chuẩn 18 Kết nhận xét: Trên sắc ký đồ thu cho thấy, thời gian lưu mẫu VN U Atractylenolid III mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu thử thêm chuẩn tương ứng với mẫu trắng khơng có Pic Atractylenolid III không bị trùng với pic khác Phương pháp xây dựng phù hợp với chất Atractylenolide III cần phân ac y, tích 3.2.2 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) dP rm Chúng tiến hành chạy với điều kiện xây dựng Dựa vào diện tích pic chất nền, chúng tơi tiến hành pha lỗng dung dịch chuẩn đến S/N= an 2-3 pha lỗng thêm lần S/N không nằm khoảng giới hạn Hình 5: Sắc ký đồ HPLC Atractylenolide III với nồng độ 0,065µg/ml 0,65µg/ml ine giá trị giá trị giới hạn phát ed ic LOD, từ suy giới hạn định lượng LOQ M Kết nhận xét: Tại nồng độ 0.065 µg/ml tỷ lệ S/N tương ứng Từ of chúng tơi suy kết LOD với tỷ lệ tín hiệu nhiễu S/N=3 giá trị LOD = 0,039µg/ml Kết thu sau: Giới hạn phát (LOD): 0,039 (µg/ml) - Giới hạn định lượng (LOQ): 0,117 (µg/ml) ho ol - Sc 3.2.3 Độ tuyến tính @ Tiến hành chạy sắc ký dãy dung dịch chuẩn Atractylenolide III có nồng độ từ 104µg/ml đến 1,625µg/ml với điều kiện xây dựng Kết khảo rig ht sát nồng độ diện tích pic dung dịch Atractylenolide tương ướng Co py bảng 19 Bảng 6: Kết độ tuyến tính phương pháp HPLC định lượng Atractylenolide Nồng độ (µg/ml) Diện tích pic (mAU.s) VN U III với dãy nồng độ chuẩn Nồng độ tính lại từ đường 243363 6.5 587771 13 1111158 19.5 1643712 26 2188350 32.5 2797135 dP rm 3.25 2,487 an 120783 ed ic ine 1.625 ac y, chuẩn (µg/ml) 52 7,580 13,287 19,095 25,034 31,673 4468481 49,899 9566241 105,490 M 104 3,824 y= 91701x – 107362 R2 0,9987 py rig ht @ Sc ho ol of Phương trình đường Co Hình 6: Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ nồng độ diện tích pic mẫu chuẩn Atractylenolide III 20 Kết nhận xét: Độ tuyến tính đánh giá qua hệ số tương quan R2 R2 = VN U 0,9987 cho thấy đường chuẩn có độ tuyến tính cao đảm bảo để thực phép phân tích định lượng Atractylenolide III 3.2.4 Tính thích hợp hệ thống ac y, Tính thích hợp hệ thống thực sắc ký tiêm lần với mẫu chuẩn nồng độ 26µg/ml Kết đánh giá thông qua giá trị độ lệch tương đối RSD dP rm (%) diện tích pic thời gian lưu sau lần phân tích lặp lại mẫu chuẩn Atractylenolide III có nồng độ 26 µg/ml Kết trình bày bảng7 Bảng 7: Kết đánh giá tính thích hợp hệ thống phương pháp định lượng an Atractylenolide III với mẫu chuẩn nồng độ 26µg/ml Diện tích pic ( mAU.s) STT 23,169 2572585 23,152 2604363 23,363 M 2611305 ed ic ine Thời gian lưu ( phút ) of Trung bình 23,398 2687905 23,445 2620537 23,305 1,621 0,582 Sc RSD (%) ho ol 2626525 @ Kết nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) diện tích pic thời gian lưu nhỏ 2%, kết cho thấy tính thích hợp phương pháp xây dựng rig ht đạt 3.2.5 Độ lặp lại py Độ lặp lại đánh giá theo phương pháp trình bày Độ lặp lại Co đánh giá thông qua sô độ chệch tương đối (RSD) hàm lượng dược chất dược liệu 2% Kết thu trình bày bảng 21 III với mẫu bạch truật chiết với Ethanol 96% Lần Lần Khối lượng dược liệu (g) 0,2019 0,1975 0,1532 Hàm lượng Atractynolide III (%) 0,0822 0,0800 0,0789 Lần 0,1989 0,1512 0,0805 0,0808 dP rm TB hàm lượng (%) Lần ac y, Lần VN U Bảng 8: Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp định lượng Atractylenolide 0,0836 1,2691 RSD (%) Kết nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) 2% cho thấy phương pháp an xây dựng có độ lặp lại cao ine 3.2.6 Độ ed ic Độ đánh giá theo phương pháp trình bày Độ đánh giá qua độ thu đồ dược chất cần phân tích Atractylenolide III 98-102% theo quy định ICH độ lệch chuẩn tương đối (RSD) lần lặp lại mẫu đánh giá độ M thu hồi  2% Kết trình bày bảng of Bảng 9: Kết đánh giá độ thu hồi phương pháp định lượng mẫu thử ho ol thêm chuẩn Atractylenolide III Nồng độ Nồng độ thêm Nồng độ dược dược chất thêm chuẩn mẫu chuẩn chất thu hồi (µg/ml) (µg/ml) 19,5 rig ht @ (µg/ml) Sc Nồng độ Co py 24,2 23,9 Độ thu hồi RSD (µg/ml) (%) (%) 44,080 19,8801 101,95 44,097 19,8970 102,04 44,021 19,8209 101,65 47,711 23,5112 98,37 0,20 1,79 47,974 23,7744 22 99,48 101,86 54,204 29,9667 101,96 54,084 29,8840 101,68 54,067 29,8671 101,62 VN U 24,3452 0,19 ac y, 29,39 49,027 dP rm Kết nhận xét: Độ thu hồi trung bình phương pháp định lượng Atractylenolide III dược liệu bạch truật sắc ký lỏng hiệu cao HPLC đạt khoảng 98-102%, chứng tỏ phương pháp xây dựng có độ cao 3.3 Ứng dụng phương pháp xác định hàm lượng dược chất củ bạch an truật Phân tích hàm lượng Atractylenolide III mẫu dược liệu Việt Nam Trung ine Quốc phương pháp xây dựng Kết trình bày bảng 10 so ed ic sánh sắc ký đồ hai mẫu bạch truật Việt Nam truật Trung Quốc hình Bảng 10: Kết xác định hàm lượng Atractylenolide III mẫu bạch truật Việt Mẫu ho ol Mẫu Việt Nam of M Nam Trung Quốc Hàm lượng Atractylenolide III(%) M1 0,0628 M2 0,0822 Co py rig ht @ Sc Mẫu Trung Quốc Tên Mẫu 23 VN U ac y, dP rm B A Hình 7: Sắc ký đồ phân tích Atractylenolide III mẫu Bạch truật HPLC- ho ol of M ed ic ine an DAD A- Bạch truật Việt Nam, B- Bạch truật Trung Quốc Hình 8: Phổ hấp thụ UV thành phần khác mẫu bạch truật Việt Nam Sc Nhận xét: Dựa vào kết cho thấy bạch truật trồng Việt Nam Trung Quốc có hàm lượng Atractynolide III 0,06 0,08%, tương ứng So sánh @ phổ đồ, bạch truật Việt Nam xuất số pic khác (UV hình 8), điều cho thấy, bạch truật Việt Nam cần số nghiên cứu khác thành phần ht hóa học Điều lý giải áp dụng điều kiện chạy dược điển Hồng Kông lại Co py rig thất bại mẫu dược liệu Việt Nam 24 CHƯƠNG - BÀN LUẬN VN U Trong nghiên cứu này, phương pháp định lượng Atractylenolide III thân rễ bạch truật xây dựng thẩm định Trong đó, điều kiện pha động HPLC-DAD MeOH :H2O có tỷ lệ 43 :57 Độ xác phương pháp đạt sau ac y, thẩm định theo hướng dẫn ICH Kết áp dụng phương pháp vừa xây dựng cho thấy Atractynolide III mẫu dP rm trồng Việt Nam thấp Trung Quốc Do mẫu thu thập bị giới hạn số lượng, cần nghiên cứu với cỡ mẫu lớn để khẳng định chắn khác biệt Tuy nhiên, giá trị thu cao nhiều lần yêu cầu dược điển Hồng Kông yêu cầu 0,019% Chứng tỏ, bạch truật thu hái Việt Nam có đủ điều kiện thâm nhập thị an trường dược liệu Hồng Kơng, nơi cửa ngõ giao thương bên ngồi vào Trung Quốc nhiều nơi khác giới ine Bên cạnh đó, hai phổ đồ thu thể rõ khác biệt peak phụ Điều ed ic cho thấy tiềm sinh học thành phần hóa học trồng Việt Nam chưa khám phá hết Mặt khác, điều gây khó khăn khơng thể áp dụng dược điển Hồng Kơng phân tích mẫu Bạch truật Việt Nam Phương M pháp phân tích vừa xây dựng áp dụng tốt cho đối tượng Dược liệu nguồn gốc of từ Trung quốc ho ol Từ đó, đề nghị tiếp tục nghiên cứu sâu thành phần hóa học tác dụng dược lý bạch truật Việt Nam Và nghiên cứu sau tập trung tăng số lượng mẫu để đưa giới hạn hàm lượng Atractynolide III tiêu chuẩn Co py rig ht @ Sc sở bạch truật trồng Việt Nam 25 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Hệ dung môi: ACN: nước (43: 57) - Cột sắc ký pha đảo: Supleco C-18(5µm, 250 x 4,6mm) - Thể tích tiêm mẫu: 20 µl - Bước sóng cực đại: 220 nm - Thời gian sắc ký: 30 phút dP rm ac y, - VN U Điều kiện phân tích HPLC Atractynolide III mẫu bạch truật sau: Bạch truật thu hái Việt Nam có hàm lương Atractynolide III 0,06% Trung Quốc 0,08% Phổ đồ Bạch Truật Việt Nam có quan sát thấy khác biệt Co py rig ht @ Sc ho ol of M ed ic ine an với Trung Quốc peak phụ 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO VN U Tiếng Việt [1] Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam Bạch truật IV, Nhà xuất Y học, pp ac y, 693 - 694 [2] Bộ Khoa học cơng nghệ (2007), Thực vật chí Việt Nam họ Cúc tập 7, Nhà dP rm xuất Khoa học kỹ thuật, pp 523 – 524 [3] Trường Thụ Sinh (2012) , Trung Dươc Lâm Sàng, Nhà xuất Y học, pp 314 – 316 [4] Viện Dược Liệu (1993), Tài nguyên thuốc Việt Nam Bạch truật, Nhà xuất an Khoa học Kỹ thuật liệu, pp 360 – 382 [5] Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm (2010), Thẩm định phương pháp ine phân tích hố học vi sinh vật, NXB Khoa học Kỹ thuật, pp.10-59 ed ic Tiếng Anh [6] Bilal Yilmaz, Emrah Alkan (2015), “Spectrofluorometric and M Spectrofluorometric and UV Spectrofluorometric Methods for the of Determination of Flurbiprofen in Pharmaceutical Preparations”, Journal of Pharmaceutical Analysis, 4(4) ho ol [7] Bo Zhu (2018), “The traditional uses, phytochemistry, and pharmacology of Sc Atractylodes macrocephala Koidz”, Journal of ethnopharmacology [8] Brian A Bidlingmeyer (1992), Practical HPLC Methodology and Applications, @ Wiley Series in Engineering and Technology Management, pp 67 – 103 ht [9] Danilo Corradini (2016), Handbook of HPLC second edition, Chromatographic rig science series, pp 207 – 232 Co py [10] Chinese Pharmacopoeia Commission (2015), Pharmacopoeia of the peoples republic of China – English Edition(2015), Chemical Industry Press, pp 524 – 526 [11] Elsevier Science (2017), “Application of Atractylodes Macrocephala Koidz engineering, 174, pp 410 -415 [12] George Lunn, Norman R Schmuff (2000) - HPLC Methods for ac y, Pharmaceutical Analysis, Wiley-Blackwell, pp 232 – 250 VN U Extract in Methicillin - Resistant Staphylococcus Aureus”, Procedia [13] Hao Kai (2012), “Study on chemical fingerprinting of crude and dP rm processed Atractylodes macrocephala from different locations in Zhejiang province by reversed-phase high-performance liquid chromatography coupled with hierarchical cluster analysis”, Pharmacognosy magazine, 8(32) [14] Hildebert Wagner, Chromatographic Fingerprint Analysis of Herbal an Medicines: Thin-layer and High Performance Liquid Chromatography of ine Chinese Drugs, Springer Science & Business Media, pp 113 - 123 [15] Hson-Mou Chang(1986), Pharmacology and Applications of Chinese Materia ed ic Medica, World Scientific, pp 349 - 353 [16] Kokane Vikrant (2014), “Formulation and evaluation of topical flurbiprofen M gel using different gelling agents”, World Journal of Pharmacy and of Pharmaceutical Sciences, 3(9), pp 654 - 663 ho ol [17] Jiaju Zhou (2003), Traditional Chinese Medicines: Molecular Structures, Natural Sources and Applications, Wiley, pp 235 - 242 Sc [18] Joel K Swadesh (2000), HPLC: Practical and Industrial Applications, Second Edition CRC Press, pp 25 - 35 @ [19] Lena Ohannesian (2001), Handbook of Pharmaceutical Analysis, CRC Press, ht pp – 12 rig [20] Monika Waksmundzka-Ha nos, Joseph Sherma (2010), High Performance py Liquid Chromatography in Phytochemical Analysis, CRC Express, pp – 12 Co [21] Murray, Kermit K., et al (2013), "Definitions of terms relating to mass spectrometry (IUPAC Recommendations 2013)", Pure and Applied Chemistry, 85(7), pp 1515-1609 [22] The Europaean Pharmacopieal Commission (2010), Pharmacopoeia Europaea VN U 7th Edition vol 2, Maisonneuve, pp, 1047 – 1050 [23] The government of Hong Kong Special Administrative region (2002), Hong Kong Chinese Materia Medica Standards, Chinese medicine division, pp 265 ac y, – 273 [24] Toshihiko T Hanai (2007), HPLC: A Practical Guide, Royal Society of dP rm Chemistry, pp 11 – 29 [25] United States Pharmacopoeial Convention (2010), United States Pharmacopoeia 35th Edition, United States Pharmacopeial Convention, pp 970 – 973 an [26] Xu, Shizao (2018), “UPLC-MS/MS of Atractylenolide I, Atractylenolide II, ine Atractylenolide III, and Atractyloside A in Rat Plasma after Oral Administration of Raw and Wheat Bran-Processed Atractylodis Rhizoma”, ed ic Morecules, 23(12), pp 3234 [27] Weici Tang, Gerhard Eisenbrand (2013), Chinese Drugs of Plant M Origin: Chemistry, Pharmacology, and Use in Traditional and Modern Co py rig ht @ Sc ho ol of Medicine, Springer Science & Business Media, pp.199 – 201 ... QUỐC GIA HÀ NỘI dP rm NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ATRACTYLENOLIDE III TRONG THÂN RỄ BẠCH TRUẬT (Atractylodes macrophala Koidz) BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO BẮT CẶP DETECTOR DAD Khóa: QH2014.Y Người... có Bạch truật di thực hạn chế Do đó, chúng tơi thực đề tài Nghiên cứu định lượng Atractylenolide III thân rễ bạch truật M (Atractylodes macrophala Koidz) sắc ký lỏng hiệu cao bắt cặp - of detector. .. Các nghiên cứu định lượng Atractylenolide III bạch truật ine Trong nghiên cứu nhóm tác giả Hao Cai đồng nghiệp vào năm 2012 định lượng hai hoạt chất Bạch truật Atractynolid I Atractynolid III