1 ĐẶT VẤN ĐỀ Tổn thương xương, khớp tổn thương thường gặp nhiều nguyên nhân gây nên, diễn biến phức tạp, điều trị không đơn giản Các phẫu thuật ghép xương tự thân, ghép xương đồng loại, ghép vật liệu thay xương, chí có nhiều cơng trình nghiên cứu ghép xương dị lồi nhằm điều trị bệnh thiếu hụt xương Các phương pháp mang lại nhiều tiến y học, song phương pháp có nhược điểm khó khắc phục Một số nghiên cứu Mỹ cho thấy có đến 5% bệnh lý xương chữa liền phương pháp điều trị thông thường họ hướng đến liệu pháp tế bào gốc Muốn có nguồn tế bào theo mong muốn biệt hóa từ tế bào gốc, phải tách chiết, phân lập, nuôi cấy làm tăng số lượng tế bào, biệt hóa để có dòng tế bào trực tiếp gần với mục đích điều trị Đây hướng nghiên cứu nhiều tác giả tiến hành giới Việt Nam Bảo quản tế bào với mục đích lưu giữ nguyên vẹn đặc tính sinh học theo thời gian nhằm để chủ động sử dụng mục đích khác nghiên cứu, điều trị Hiện sở nghiên cứu, hàng ngày cung cấp mô xương cho chục bệnh nhân để ghép tự thân đồng loại Nhằm mục đích kết hợp áp dụng cơng nghệ tế bào gốc với công nghệ ghép mô xương mà mục tiêu trước mắt xây dựng quy trình phân lập, ni cấy, biệt hóa bảo quản tế bào gốc trung mô nên tiến hành đề tài: "Nghiên cứu thực nghiệm áp dụng quy trình ni cấy bảo quản tạo cốt bào biệt hóa từ tế bào gốc trung mô tủy xương" Mục tiêu đề tài: Tách chiết, phân lập, định danh nuôi cấy tăng sinh thành công tế bào gốc trung mơ từ tủy xương thỏ Biệt hóa tế bào gốc trung mô tủy xương thành tạo cốt bào bảo quản lạnh sau biệt hóa Những đóng góp luận án: Luận án đóng góp lĩnh vực nghiên cứu thực nghiệm tế bào gốc Việt Nam Đặc biệt biệt hóa thành cơng tế bào gốc trung mơ tủy xương thành tạo cốt bào với kỹ thuật định danh đạị Đây kết Việt Nam Kết có ý nghĩa thực tiễn lớn điều trị bệnh lý xương, khớp liệu pháp tế bào gốc Thông qua việc làm luận án, tác giả nhóm nghiên cứu tế bào gốc Bộ môn Mô Phôi Đại học Y Hà Nội nắm bắt tiến hành thành thạo bước qui trình, kỹ thuật tách chiết, phân lập, ni cấy tăng sinh, biệt hóa, định danh đến bảo quản lạnh tế bào sau biệt hóa, tiến tới xây dựng ngân hàng tế bào biệt hóa theo yêu cầu điều trị nghiên cứu Bố cục luận án Luận án gồm 119 trang đó: Đặt vấn đề trang, tổng quan tài liệu 38 trang, đối tượng phương pháp nghiên cứu 16 trang, kết nghiên cứu 26 trang, bàn luận 35 trang, kết luận trang, kiến nghị trang CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tế bào gốc trung mô 1.1.1 Đặc điểm chung tế bào gốc trung mô Friedenstein AJ (1976) mô tả tế bào tủy xương tế bào bám bề mặt đĩa ni có khả tạo cụm (colony forming unitfibroblast: CFU-F) MSC có khả biệt hóa thành nhiều dòng tế bào có tế bào xương MSC có hình thoi hình sao, mức độ vi thể khó phân biệt với nguyên bào sợi Đặc điểm siêu cấu trúc chúng nhân tế bào chứa khối nhiễm sắc thô, bào tương nghèo nàn, chứa ti thể lưới nội bào Đầu tiên MSC phát từ quần thể tế bào tủy xương Ở đó, MSC chiếm 0.001% đến 0.01% tổng số tế bào có nhân, 1/10 tế bào gốc tạo máu Ngày nay, người ta phân lập tế bào từ nhiều mô thể trưởng thành như: máu tuần hoàn, máu dây rốn, trung mô dây rốn, tủy xương, mô mỡ, gan, lách, dịch ối tủy xương coi nguồn cung cấp chủ yếu MSC 1.1.2 Marker tế bào gốc trung mô Bảng 1.1 Các marker tế bào gốc trung mơ người Marker MSC dương tính Marker dương tính >95%: CD 105, CD73, CD90 Marker MSC âm tính Marker âm tính ≤2%: CD45, CD34, CD14 CD11b, Cd79α CD19, HLA-DR Tuy nhiên, marker MSC người thỏ khơng hồn tồn giống Một số marker hay nghiên cứu thỏ bảng 1.1.3 Phân lập định danh tế bào gốc trung mô  Phân lập tế bào Khối tế bào gốc tủy xương dễ dàng phân lập phương pháp ly tâm tỷ trọng Môi trường ly tâm thường dùng Percol, Ficoll Những tế bào lắng lớp giadien tỷ trọng có tỷ trọng tương ứng với tỷ trọng Khối tế bào gốc thu nằm lớp Ficoll lớp huyết Phân lập tạo khối tế bào gốc có tế bào gốc trung mơ tủy xương Trong khối chứa lượng không nhỏ tế bào thuộc dòng tế bào tạo máu Ni cấy mục tiêu tiếp tục loại bỏ tế bào máu lưu giữ MSC Trong môi trường ni cấy có mật độ huyết thấp khơng phù hợp cho tế bào máu có tác dụng loại bỏ tế bào này, lại tế bào bám đĩa plastic có hình dạng giống nguyên bào sợi gọi MSC 1.2 Tiêu chuẩn khẳng định hMSC (ISCT)  Hình thái: giống nguyên bào sợi bám vào bề mặt chai nuôi cấy  Marker bề mặt: dương tính: ≥ 95% CD105, CD90, CD73 âm tính: ≤ 2% CD34, CD45, CD14 CD11b, CD79α CD19, HLA-DR  Khả biệt hóa: tế bào xương, sụn, mỡ 1.3 Khả biệt hóa tế bào gốc trung mơ: Dưới điều kiện thích hợp, MSC biệt hóa thành nhiều dòng tế bào chun biệt như: tế bào xương, sụn, cơ, mỡ 1.4 Bảo quản lạnh tế bào 1.4.1 Cơ chế bảo quản lạnh: Trong kỹ thuật đông chậm tế bào, nước môi trường lạnh -5 0C đến -100C hình thành tinh thể đá bắt đầu mơi trường ngồi tế bào, nước tế bào chưa bị đơng Khi nước chuyển sang dạng tinh thể tinh khiết, lượng nước thể lỏng giảm Do đó, nồng độ chất tan chất bảo vệ lạnh ngày tăng dẫn đến tăng áp lực thẩm thẩu bên tế bào, kéo nước từ tế bào Mức độ nước tế bào phụ thuộc vào tốc độ làm lạnh Nếu mức độ làm lạnh đủ chậm cho phép dung dịch nội bào cân với môi trường ngoại bào Mặt khác, tốc độ làm lạnh nhanh so với nước thấm ngồi dễ gây hình thành tinh thể đá tế bào, nhiên hình thái tế bào chưa bị biến dạng Do q trình đơng lạnh tốt tế bào khử nước phần chúng trạng thái cân Nếu tốc độ làm lạnh khơng nhanh, đá kết tinh hình thành ngoại bào gây tượng co tế bào Như vậy, bảo quản lạnh tế bào cân nước tế bào tốc độ làm lạnh 1.4.2 Vai trò chất bảo quản lạnh: Chất bảo quản đơng lạnh có vai trò nhằm chống lại tác động bất lợi nhiệt độ thấp hay nhiệt độ đơng lạnh Một chất bảo quản đơng lạnh làm cho nước đông lại giống thủy tinh mà khơng hình thành tinh thể đá Những chất bảo quản ngăn chặn tạo thành muối, tạo thành tinh thể tế bào suốt thời gian đông lạnh 1.4.3 Bảo quản tế bào gốc • Xie XH (2012) Bảo quản khối tế bào gốc đơn nhân tủy xương thỏ: 10% DMSO 90% FBS với mật độ 10 7/1ml Sau tuần tỉ lệ sống 96,49% • Kotobuki N (2005) MSC bảo quản trong: DMSO FBS sau bảo quản (0,3 -37 tháng) tỷ lệ sống xấp xỉ 90% Phân tích marker bề mặt MSC nhóm bảo quản khơng bảo quản khơng có khác biệt • Zeisberger SM (2011) bảo quản AT-MSC với mật độ 10 tế bào/ml, hạ nhiệt độ với tốc độ 0C/phút đến -800C, sau 2h mẫu cho vào bình Nitơ Các tế bào bảo quản mơi trường có DMSO khác có hình thành tinh thể đá khác ngồi tế bào • Shimizu T (2013) bảo quản tạo cốt bào biệt hóa từ MSC tủy xương, bảo quản “cell Banker ®”, -800C Sau tuần, 12 tuần tỷ lệ sống 63,3 ±8,6%; 61,1± 6,5% Đánh giá trì tiềm tạo xương như: lượng ALP tuần, 12 tuần tăng so với nhóm chứng Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu, chất liệu nghiên cứu - Thỏ ta mạnh khỏe, trọng lượng 2.0- 2.5 kg, Sử dụng 17 thỏ để thử nghiệm xây dựng quy trình chọc hút tủy xương Sau qui trình chọc hút hồn chỉnh, sử dụng 30 thỏ để chọc hút thức lấy dịch tủy - 30 mẫu dịch tủy xương thỏ sau chọc hút sử dụng để tách chiết tế bào gốc trung mô - 30 mẫu dịch chứa tế bào gốc trung mô sau phân lập từ dịch tủy xương sử dụng để nuôi cấy, tăng sinh Sau tăng sinh, chia nhỏ lấy 105 mẫu tiến hành biệt hóa theo hướng tạo cốt bào, lấy 15 mẫu định danh sau biệt hóa, 90 mẫu đưa vào bảo quản lạnh 2.2 Phương pháp nghiên cứu: 2.2.1 Nghiên cứu tiến hành theo nội dung sau: - Phân lập tế bào gốc trung mô từ tủy xương, ni cấy, định danh biệt hóa thành tạo cốt bào - Bảo quản tạo cốt bào, đánh giá khả phục hồi tế bào sau bảo quản 2.2.2 Kỹ thuật nghiên cứu: 2.2.2.1 Tách chiết, phân lập, nuôi cấy định danh MSC từ tủy xương biệt hóa thành tạo cốt bào Chọc hút tủy xương: Lựa chọn vị trí chọc hút tủy xương số lượng dịch tủy xương Phân lập, tách chiết tế bào: Tế bào đơn nhân tách phương pháp gradient tỷ trọng Nuôi cấy tế bào: Nuôi cấy sơ cấp: Huyền phù khối tế bào đơn nhân thu sau ly tâm vào chai flask, đặt tủ nuôi cấy tế bào Thay môi trường -3 ngày lần, tế bào mọc 70-80% đĩa ni cấy chuyển Ni cấy thứ cấp: Tách tế bào trypsin/EDTA, sau ly tâm thu lấy tế bào Cho tế bào vào chai flask để tủ nuôi cấy tế bào Định danh để xác định tế bào nuôi cấy tế bào gốc trung mô: Hóa mơ miễn dịch: Kỹ thuật dòng chảy: Tiêu chuẩn xác định tế bào n cấy MSC Biệt hóa tế bào MSC thành tế bào mỡ: Đánh giá sau biệt hóa phương pháp nhuộm Oil red O Biệt hóa tế bào MSC thành tạo cốt bào: Các tế bào MSC biệt hóa mơi trường có dexamethasone, ascorbic, β- glycerolphosphatase Kỹ thuật theo tác giả Lee TC (2014) áp dụng thành công Đánh giá biệt hóa thành tạo cốt bào • Nhuộm Alizarin red: đánh giá tổng hợp canxi chất • Nhuộm hóa mơ miễn dịch: xác định marker sau biệt hóa có dương tính osteocalci ? • HVĐT qt: Có tinh thể khống hình thành khoảng gian bào hay bề mặt tế bào ? Ghép MSC biệt hóa theo hướng tạo cốt bào thực nghiệm: Kỹ thuật cấy ghép nhằm bổ sung cho kết khả tạo xương thực nghiệm dòng tế bào biệt hóa từ MSC theo hướng tạo cốt bào Quy trình: chuẩn bị 15 thỏ độ tuổi, tiến hành chọc hút, phân lập, ni cấy, biệt hóa MSC thành tạo cốt bào quy trình nghiên cứu Tạo ổ khuyết xương Khoan bên lỗ đầu xương đùi đường kính 0.5 x 0.5 cm Bơm tế bào gốc, bơm vào lô giọt môi trwng chứa 106tế bào/ml Bên phải bơm môi trường không chứa tế bào Sau ghép theo dõi toàn than vị trí ghép thười điểm tuần, tuần 2.2.2.2 Bảo quản tạo cốt bào sau biệt hóa Phương pháp đơng lạnh tế bào Sau biệt hóa MSC thành tế bào gốc mô xương, thời gian biệt hóa 10 ngày, bảo quản tế bào với mật độ tế bào 10 - 107 tế bào/ml Chất bảo quản 10% DMSO với 0% FBS, 15% FBS, 30% FBS Bảo quản tế bào 40C thời gian 30 phút, -200C, -800C để qua đêm cho N2 lỏng (-1960C) Phương pháp rã đông: Rã đông nhanh 37 0C, pha lỗng dịch bảo quản với mơi trường nuôi, ly tâm thu lấy tế bào, huyền phù với môi trường nuôi Xác định tỷ lệ sống/ chết tế bào nhuộm trypan blue nuôi lại chai flask Nuôi cấy tế bào sau bảo quản Sau rã đông tế bào dung dịch huyền phù cho vào mơi trường ni cấy đánh giá hình thái tế bào khả phát triển tế bào 2.3 Xử lý số liệu Số liệu thu nhận xử lý phần mềm xử lý thống kê SPSS Phương pháp xử lý số liệu T-test, anova, kiểm định tương quan Pearson CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết số lượng chất lượng dịch tủy xương Chúng thu tủy xương từ mào chậu 47 thỏ Dịch tủy xương sau chọc hút chống đông Heparin chiết tách lấy khối tế bào đơn nhân, sau ni cấy tế bào Đợt chưa chuẩn hóa quy trình nên số mẫu dịch tủy xương bị đông (30%) số lượng tế bào thu thấp 2.53 ± 3.54 Số lượng dịch tủy xương trung bình đợt 30 mẫu 12±4.3 (ml), sau ly tâm tế bào đơn nhân 6.7 ± 1.12 (ml) hiệu thu MSC (P0) 12.04 ± 2.94 3.2 Kết nuôi cấy, tăng sinh tế bào gốc trung mô tủy xương 3.2.1 Kết nuôi cấy sơ cấp Đợt số mẫu phân lập 17 mẫu tỷ lệ nuôi cấy thành công 23% Đợt tiến hành phân lập 30 mẫu, tỷ lệ nuôi cấy thành công 86,7%, có mẫu chưa đạt sau ni cấy sơ cấp 15 ngày tỷ lệ mọc chưa đạt 70-80% Sự thay đổi hình dạng tế bào ni cấy sơ cấp MSC sau nuôi cấy ngày (x200) MSC sau ni cấy10 ngày (x200) Hình 3.1 Ni cấy sơ cấp MSC 3.2.2 Kết nuôi cấy thứ cấp Sau 7-10 ngày quần thể bắt đầu hợp dòng, quần thể tế bào chiếm 7080% diện tích bề mặt bình ni Thời điểm thích hợp cho cấy chuyển 10 MSC (P3) sau nuôi cấy ngày (x 200) MSC (P3) sau nuôi cấy 7- ngày (x 200) Hình 3.2 Ni cấy thứ cấp MSC 3.2.3 Khả tạo cụm Một đặc tính MSC khả tạo cụm dạng nguyên bào sợi (CFU-F) cấy chuyển mật độ thưa Sau ngày nuôi cấy, quan sát thấy rõ cụm tế bào Hình 3.3 Sau ni cấy ngày (x 200) Ni cấy tạo cụm với mật độ 200 tế bào/cm2 thu 107± 25 cụm tế bào Các tế bào tạo thành cụm rõ rệt (Hình 3.3.) 3.2.4 Xây dựng đường cong tăng trưởng theo hệ thống X-celligence Để theo dõi tốc độ phát triển tế bào nuôi cấy, xây dựng đường cong tăng trưởng hệ thống X-celligence với mẫu tế bào thu hoạch giai đoạn P4 Tiến hành mẫu, mẫu lặp lại lần, cấy đĩa 96 giếng điện cực vàng chuyên dụng 12 CD44 CD90 Hình 3.4 Nhuộm HMMD tế bào gốc trung mơ dương tính với CD44, CD90 tế bào bắt màu đỏ biểu dương tính giai đoạn P3(x500) B CD34 CD14 Hình 3.5 Nhuộm HMMD4 tế bào gốc trung mô âm tính với CD34, CD14 Tế bào khơng bắt màu, giai đoạn P3 3.1.6 Kết biệt hóa tế bào gốc trung mô thành nguyên bào mỡ Chúng nghiên cứu biệt hóa MSC thành tế bào mỡ, số mẫu (n=5) Sau thời gian biệt hóa khoảng 3-5 ngày, tế bào bắt đầu chuyển dần thành dạng đa diện với xuất giọt mỡ nhỏ bào tương ngoại vi tế bào (Hình 3.15) Nhuộm Oil –red O.Các giọt mỡ bắt màu đỏ B 13 Biệt hóa MSC thành tế bào tạo mỡ sau 5-7 ngày ( x500) Nhuộm Oil –red O.Các giọt mỡ bắt màu đỏ ( x 500) Hình 3.6 Hình ảnh tế bào gốc trung mơ biệt hóa thành tế bào mỡ 3.1.7 Kết biệt hóa tế bào gốc trung mơ thành tạo cốt bào Sau nuôi cấy với môi trường cảm ứng biệt hóa ngày, tế bào có thay đổi hình dạng nhẹ Hầu hết tế bào dạng thon dài Sau 7,14 ngày tế bào co ngắn lại, có dạng hình nhánh bào bào ngắn dạng hạt đậu Dạng thuôn dài trải rộng hình dáng MSC hình hạt đậu hình dáng tế bào xương MSC (nhóm chứng) ( x500) MSC biệt hóa thành tạo cốt bào sau 21 (x750) Hình 3.7 Hình ảnh tế bào gốc trung mơ biệt hóa thành tạo cốt bào 14 Bảng 3.2 Kết biệt hóa định danh tạo cốt bào biệt hóa từ MSC tủy xương Thơng Nhuộm Alizarin Hiển vi điện tử số NC Số mẫu red tế bào Tỷ lệ Số Tỷ lệ thành Số MSC biệt hóa thành mẫu công mẫu công MSC 15 5/5 5/5 Hóa mơ miễn dịch Tỷ lệ Số thành mẫu công 5/5 Nhận xét: Số mẫu tế bào trung mơ biệt hóa thành tạo cốt bào 15 mẫu, để định danh tế bào sau biệt hóa kỹ thuật: Alizarin red, hiển vi điện tử quét, nhuộm hóa mơ miễn dịch, phương pháp nghiên cứu ngẫu nhiên mẫu Tỷ lệ thành công sau làm kỹ thuật 5/5 (100%) Các tế bào nhuộm với Alizarin red, sau nhuộm tế bào chất bắt màu đỏ cam Hình 3.8 MSC sau sau biệt hóa 21 ngày nhuộm Alizarin red.(x500) Dưới kính hiển vi điện từ quét thấy tế bào biệt hóa sau 30 ngày xuất các tinh thể khống 15 Hình 3.9 Tế bào gốc trung mơ sau biệt hóa 30 ngày HVĐT quét Các tế bào biệt hố có dạng hình đa giác với nhánh bào tương ngắn Các tinh thể khoáng tập trung thành đám bề mặt lân cận tế bào biệt hố Các tế bào sau biệt hóa nhuộm hóa mơ miễn dịch với marker osteocalcin, kết nhuộm giai đoạn dương tính với osteocalcin Osteocalin protein tổng hợp nhiều tế bào tạo xương xem marker tế bào tạo xương Nhân tế bào Hình 3.10 Hình ảnh tế bào sau biệt hóa 15 ngày mơi trường cảm ứng tạo xương (nhuộm HMMD biểu dương tính với marker osteocalcin (x200) 16 3.1.8.Kết ghép MSC biệt hóa theo hướng tạo cốt bào thực nghiệm Sau ghép tế bào vào ổ khuyết xương thỏ, đánh giá phát triển xương thời điểm tuần, cho thấy hình ảnh vi thể có dấu hiệu tạo xương nhiều so với nhóm đối chứng Sau ghép tuần hình thành xương nhóm tương đối hồn tồn Tuy nhiên, hình ảnh HVĐT qt vùng xương có bơm tế bào xuất tế bào tạo xương rõ, có hủy cốt bào NB A NB B Hình 3.11 Hình ảnh vi thể vùng xương ghép tế bào (A) không ghép tế bào (B) sau tuần HE NB: xương hình thành Vùng xương hình thành Hủy cốt bào A B Hình 3.12 Hình ảnh siêu vi thể vùng xương ghép tế bào (A) không ghép tế bào (B) sau tuần (Hiển vi điện tử quét SEM) 17 3.2 Kết bảo quản tạo cốt bào sau biệt hóa 3.2.1 Tỷ lệ tế bào sống sau bảo quản mối liên quan với môi trường MT1, MT2, MT3 Chúng tiến hành bảo quản 90 mẫu tế bào sau biệt hóa định hướng dạng tạo cốt bào, chọn thỏ độ tuổi, trọng lượng, điều kiện ni Mơi trường bảo quản có thay đổi % FBS môi trường MT1,MT2 MT3 Về thao tác tiến hành quy trình với thao tác cho đợt thí nghiệm Sử dụng thiết bị, dụng cụ hóa chất đồng q trình thí nghiệm Mật độ tế bào, điều kiện nuôi đồng Biểu đồ 3.2 Biểu đồ biểu thị tỷ lệ tế bào sống sau bảo quản môi trường khác Từ biểu đồ ta thấy tỷ lệ tế bào sống sau bảo quản mơi trường có tỷ lệ thấp nhất: 61,28 ± 3,89, môi trường 2: 82,19 ± 5,45, môi trường có tỷ lệ tế bào sống cao 87,07 ± 4,18 Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) 18 3.2.2 Mối liên quan tỷ lệ tế bào sống với môi trường bảo quản khác Tỷ lệ tế bào sống sau bảo quản mơi trường MT1, MT2 có mối tương quan tuyến tính thuận, mức độ trung bình với hệ số tương quan tỷ lệ tế bào sống sau bảo quản môi trường r = 0,437 Tỷ lệ tế bào sống sau bảo quản mơi trường MT1, MT3 có mối tương quan tuyến tính thuận, mức độ thấp với hệ số tương quan tỷ lệ tế bào sống sau bảo quản môi trường r = 0,262 Tỷ lệ tế bào sống sau bảo quản môi trường MT2, MT3 có mối tương quan tuyến tính thuận, mức độ trung bình với hệ số tương quan tỷ lệ tế bào sống sau bảo quản môi trường r=0,316 Điều chứng tỏ FBS có tác dụng làm tăng tỷ lệ tế bào sống sau bảo quản mức độ trung bình 3.2.2 Nuôi cấy tế bào sau bảo quản Quan sát 90 mẫu tế bào bảo quản với loại mơi trường khơng có tỷ lệ huyết khác so với trước bảo quản, không thấy khác biệt hình dạng tế bào Trước bảo quản Sau bảo quản Hình 3.13 Khơng có khác biệt hình dạng tế bào trước sau bảo quản lạnh (x150) Sau rã đông tiến hành nuôi cấy tiếp thấy tế bào phát triển trước bảo quản 19 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1 Chọc hút, phân lập, ni cấy, biệt hóa, định danh tế bào gốc trung mo tủy xương 4.1.1 Số lượng chất lượng tủy xương sau chọc hút Đợt nghiên cứu thứ chúng tơi tiến hành chọc thăm dò 17 mẫu Do chưa chuẩn quy trình nên lượng tủy chọc thấp bị đông mẫu (Bảng 1) Đợt chọc tủy thứ thực 30 mẫu, hồn thiện qui trình nên khơng có mẫu dịch tủy bị đông lượng dịch tủy tổng lượng tế bào đơn nhân thu cao đợt Nghiên cứu Jau- Wen Huang (2006) cho thấy lượng tủy xương chọc hút thỏ khoảng 10ml phù hợp đủ lượng tế bào trung mô cho nuôi cấy Việc hút nhiều dịch tủy xương làm lẫn nhiều tế bào máu ngoại vi ảnh hưởng đến việc hồi phục sức khỏe thỏ sau chọc hút Kết nghiên cứu sau ly tâm lượng tế bào đơn nhân thu mẫu tủy xương 6,6±3,8x10 tế bào Kết cho thấy mục tiêu trình chọc hút phân tách tủy xương đạt phù hợp với kết Xie XH (2012) nghiên cứu mơ hình gần tương tự thu 10ml dịch tủy xương thỏ với 6,2±0,85 x 106 tế bào đơn nhân sau phân tách 4.1.2 Nuôi cấy, tăng sinh, tạo cụm tế bào gốc trung mô tủy xương 4.1.2.1 Nuôi cấy sơ cấp tế bào gốc trung mô Cơ sở lựa chọn MSC có phân tử bám dính bề mặt tế bào, điều kiện ni cấy ngồi thể, tế bào có khả bám đơn lớp vào bề mặt nhựa ni cấy.Trong đó, HSC tủy xương khơng có khả bám dính này, bị loại bỏ dần thay môi trường Trong nghiên cứu này, xác định lượng MSC thu từ tủy xương Đợt 1, sau nuôi cấy tổng số tế bào đơn nhân thu thấp (2.53 x104 tế bào/ tổng số tế bào đơn nhân) môi trường nuôi cấy chưa phù hợp cho MSC giai đoạn đầu 30% mẫu tế bào không mọc số mẫu tế bào mọc Giai đoạn nghiên cứu sau chuẩn hóa quy trình chọc hút ni cấy tế bào 20 nên sau ly tâm có số lượng tế bào trung bình 6,6 x 10 6/1ml, sau ni cấy 10 ngày thu lượng tế bào mọc trung bình 1,2 x10 Sau ni cấy 10 ngày nhiều lần thay môi trường số lượng tế bào máu ít, đa số tế bào dạng nguyên bào sợi giống tế bào trung mô (Hình 3.3) Như vậy, xác định lượng tế bào bám đáy chai giai đoạn sơ cấp 1,8 x104 tế bào/ 106 tế bào đơn nhân Kết phù hợp với tác giả Xie XH (2012) tế bào bám dính thu giai đoạn sơ cấp 1,92x104/106 tế bào đơn nhân Sự phát triển tế bào đơn nhân giai đoạn sơ cấp thấy tế bào dạng hình cầu giảm dần, số lượng tế bào giống nguyên bào sợi tăng dần Ngày 7-12 tế bào có hình dạng giống ngun bào sợi dày chiếm 70-80% diện tích bề mặt chai ni Phân lập dựa vào hình thái tế bào, đặc điểm MSC thỏ quan sát kính hiển vi thấy hình thái cấu trúc tương tự MSC người MSC có nhân lớn hình trứng, chất nhiễm sắc mịn, hạt nhân rõ Các bào quan phong phú, có dạng giống nguyên bào sợi giống tế bào sợi Theo tác giả Tan SL (2013) đường kính trung bình tế bào thỏ có chiều dài 202,66 ± 8,40 µm, chiều rộng 13,09 ± 0,91 µm Ở người chiều dài tế bào 152,04±43,35 µm, chiều rộng 9,82 ± 0,66µm Trong nghiên cứu này, với 47 mẫu tế bào đơn nhân phân lập từ tủy xương thỏ nuôi cấy, mẫu tế bào mọc phát triển tốt đạt tỷ lệ 100% Trong nghiên cứu chúng tôi, sau cấy chuyển lần thứ 10 (P10) đặc điểm hình thái khả tăng sinh tế bào không thay đổi 4.1.2.2 Nuôi cấy thứ cấp tế bào gốc trung mô Do tế bào phân chia theo cấp số nhân nên sau, bề mặt bình ni cấy phủ nhanh Ni cấy sơ cấp thành công tế bào mọc khoảng 70-80% diện tích đáy ni cấy Thơng qua cấy chuyển, lượng tế bào ban đầu pha loãng tỷ lệ 1: Tốc độ phát triển tế bào tương đối lần cấy chuyển cao nuôi cấy sơ cấp So với nuôi cấy sơ cấp, thời gian tế bào bám đáy tốc độ phát triển nhanh 5-7 ngày 21 cấy chuyển Sau tế bào mọc 70-80% đĩa nuôi cấy tiến hành cấy chuyển, thường dùng enzym để tách tế bào Trypsin chúng phổ biến việc tách tế bào Xử lý tế bào trypsin dẫn đến cuộn tròn tế bào Khi tế bào co lại, liên kết trở lên lỏng lẻo dễ dàng tế bào tách tác động học Trypsin cắt cầu nối hoàn toàn Sau thu dung dịch tế bào huyền phù môi trường nuôi, tiếp tục nuôi cấy giai đoạn 4.1.2.3 Khả tạo cụm Dựa vào kích thước, hình dạng cụm (độ lớn, độ dày đặc bên trong, hình dạng viền) độ lớn tế bào cụm, người ta biết tiềm tế bào gốc hình thành nên cụm Ngồi biết số lượng tế bào gốc trung mô khối tế bào gốc thu Nghiên cứu nuôi cấy tạo cụm với mật độ MSC tủy xương 200 tế bào/cm2, số cụm thu 107 ± 25 cụm Theo tác giả Liu C (2014) nghiên cứu phân lập nuôi cấy nguồn MSC từ đĩa gian đốt sống thỏ, nuôi cấy tạo cụm môi trường 20% FBS, sau 3-4 ngày bắt đầu hình thành tạo cụm, cụm có kích thước khác 1-3mm Hình thái tế bào giống nguyên bào sợi, cụm tế bào hình thành phụ thuộc vào mật độ tế bào Nghiên cứu thấy mật độ tế bào 200 tế bào/cm2 có hiệu tạo cụm cao Sau 10-12 ngày nuôi cấy cụm tế bào lan rộng cấy chuyển Xét nghiệm ni cấy tạo cụm dạng ngun bào sợi xác định xác số lượng tế bào gốc trung mô thu Kỹ thuật tác giả Hernigou PH dùng để đếm số lượng tế bào gốc trước tiêm vào ổ khớp giả, hoại tử chỏm xương đùi 4.1.2.4 Đánh giá tăng sinh tế bào Đường cong tăng trưởng thiết lập để phân tích đặc điểm phát triển kiểu tế bào hay dòng tế bào Sự gia tăng số lượng tế bào thường sử dụng phương pháp đánh giá ảnh hưởng hormon, chất dinh dưỡng 22 yếu tố khác lên kiểu tế bào chuyên biệt Sự tăng trưởng, hay tăng số lượng tế bào đánh giá tốt cho đáp ứng sinh học, xác định ảnh hưởng nhiều nhân tố khác nhau, bao gồm chất gây nguyên phân, thay đổi mức độ dinh dưỡng, vận chuyển nguyên nhân khác Theo tác giả Liu C (2014) nghiên cứu nuôi cấy phân lập MSC từ đĩa gian đốt sống, nuôi cấy tế bào mơi trường có DMEM, 20%FBS, 100u/ml penicillin, 100µg/ml streptomycin, đánh giá tăng sinh tế bào kỹ thuật MTT Kết cho thấy thời gian nhân đôi quần thể 17,8 4.1.2.5 Định danh marker MSC P4 định danh marker bề mặt kỹ thuật flow cytometry hóa mơ miễn dịch Kết cho thấy tế bào dương tính với CD44, CD90 biểu âm tính CD14, CD34 Quần thể tế bào sử dụng xác định marker P2 P3 cho thấy CD90 biểu 96,9% MSC từ tủy xương thỏ, biểu 100% MSC từ tủy xương người Kết nghiên cứu chúng tơi CD90 biểu dương tính 95,37% Kết nghiên cứu cho thấy CD44 biểu dương tính 97,42% Kết phù hợp với kết nghiên cứu Lee TC (2014) thỏ: 97,32% Các marker CD14, CD34 biết marker tế bào gốc tạo máu CD14 kháng nguyên bề mặt cho tế bào monocyte Tế bào dương tính CD34 tế bào gốc tạo máu Theo nghiên cứu Lee TC (2014) 25 marker biểu tế bào gốc trung mơ, tỷ lệ dương tính CD14 0,17%, CD34 0,36 Trong CD44 97,32%, CD90 95,37% So sánh biểu marker MSC người thỏ 25 marker có marker biểu khác biệt, khơng có thỏ 4.1.2.6 Biệt hóa tế bào gốc trung mơ thành ngun bào mỡ Sau nuôi cấy 10-15 ngày môi trường biệt hóa đánh giá hình thành tế bào mỡ Dưới kính hiển vi quang học đối pha, hạt 23 mỡ bào tương tăng sáng nhấp nháy ốc vi cấp kính hiển vi Thêm vào đó, kỹ thuật nhuộm tế bào chuyên biệt giúp phát hạt mỡ kính hiển vi quang học hạt mỡ bắt màu đỏ thuốc nhuộm Oil- Red O Trong điều kiện nuôi cấy thơng thường tế bào âm tính với thuốc nhuộm Điều chứng tỏ tế bào mỡ hình thành từ tế bào ni cấy mơi trường biệt hóa chun biệt 4.1.2.7 Biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tạo cốt bào Sau nuôi cấy môi trường tạo xương khoảng 7-14 ngày có thay đổi hình thái tế bào thấy có tinh thể khống Biệt hóa sau 30 ngày có hình ảnh khống hóa rõ kính HVĐT (Hình ) Kết nghiên cứu phù hợp với số tác Quiroz FG (2008) Nhuộm alizarinred tế bào chất bắt mầu đỏ cam chứng tỏ có lắng đọng canxi chất (Hình 3.24) Dưới kính hiển vi điện tử qt thấy có hình thành tinh thể khống màu trắng (Hình ) Nhuộm hóa mơ miễn dịch tế bào biểu dương tính marker osteocalcin marker tạo cốt bào 4.1.2.8 Nghiên cứu thực nghiệm nhằm đánh giá khả tạo xương tạo cốt bào biệt hóa từ tế bào gốc trung mô tủy xương Chúng so sánh kết tạo xương hai nhóm thấy nhóm thực nghiệm có kết tái tạo liền xương nhanh so với nhóm chứng thời điểm tuần qua hình ảnh vi thể Ở thời điểm tuần xương liền hoàn toàn vùng khuyết Tuy nhiên hình ảnh HVĐT quét kết liền xương nhóm thực nghiệm tốt so với nhóm chứng 4.2 Bảo quản tế bào sau ni cấy biệt hóa 4.2.1 Tỷ lệ tế bào sống sau bảo quản Tế bào bảo quản quy trình đông lạnh chậm trải qua giai đoạn hạ nhiệt Đầu tiên tế bào đặt 0C 30 phút để nước bên tế bào thay chất bảo quản, sau tế bào trữ -200C, -800C qua đêm trước cho vào nitơ lỏng Khi bảo quản phương pháp đông lạnh chậm, nhiệt độ hạ 24 từ từ qua giai đoạn, nước bên tế bào thay chất bảo quản tế bào có thời gian thích nghi với mơi trường Kết thống kê cho thấy có khác biệt mật độ tế bào sống sau bảo quản môi trường khác Các tế bào chết tinh thể đá nội bào hình thành trình hạ nhiệt nồng độ khơng đủ cao hình thành trình làm ấm tốc độ rã đông không đủ nhanh Kết cho thấy, bảo quản mơi trường MT3 có khả thẩm thấu nước tốt, nên tế bào có tỷ lệ sống cao (87,07%) Tế bào bảo quản môi trường MT1, chưa thích hợp nên tỷ lệ tế bào sống thấp (61,28%) Kết nghiên cứu phù hợp với tác giả Verdanova M (2014) bảo quản tạo cốt bào môi trường khác nhau, theo phương pháp hạ nhiệt độ theo chương trình với tốc độ 10C/phút đến -800C , cho vào nitơ lỏng Trong môi trường bảo quản tạo cốt bào chuẩn DMSO 10% 25% FBS có tỷ lệ tế bào sống 87% Còn tác giả bảo quản MSC mơi trường bảo quản 10% DMSO tỷ lệ tế bào sống xấp xỉ 80% 4.2.2 Đặc điểm hình thái tế bào sau bảo quản Hình dạng tế bào Quan sát 90 mẫu tế bào bảo quản với loại môi trường khơng có tỷ lệ huyết khác so với trước bảo quản, không thấy khác biệt hình dạng tế bào Khả phát triển sau bảo quản Sau rã đông tiến hành nuôi cấy tiếp thấy tế bào phát triển trước bảo quản Kết nghiên cứu phù hợp với tác giả Verdanova M (2014) bảo quản tạo cốt bào môi trường khác nhau, theo phương pháp hạ nhiệt độ theo chương trình với tốc độ 10C/phút đến -800C, cho vào nitơ lỏng Hình thái tế bào trước sau bảo quản không thay đổi 25 26 KẾT LUẬN - Đã tách chiết, phân lập, định danh nuôi cấy tăng sinh thành công tế bào gốc trung mô từ tủy xương thỏ, từ đưa qui trình tóm tắt bước quan trọng như: phương pháp vô cảm, vị trí, kỹ thuật chọc hút, phương pháp tách chiết tế bào sau chọc hút để nuôi cấy tăng sinh (có định danh để khẳng định tế bào gốc trung mơ) - Đã biệt hóa thành cơng tế bào gốc trung mô tủy xương thành tạo cốt bào môi trường biệt hóa cảm ứng tạo xương Sau biệt hóa, định danh kỹ thuật hóa mơ miễn dịch với marker osteocalcin, nhuộm với Alizarin red, quan sát tinh thể khống kính hiển vi điện tử qt Các kết khẳng định tế bào sau biệt hóa dạng tạo cốt bào Sau biệt hóa tế bào bảo quản với phương pháp đông chậm, hạ nhiệt độ theo chương trình mơi trường có 10% DMSO 15% FBS, với mật độ tế bào 106-107 tế bào/ml Rã đông nhanh, đánh giá tỷ lệ sống (đạt 80%), nuôi cấy tăng sinh tế bào phát triển tốt, hình dạng tế bào khơng thay đổi KHUYẾN NGHỊ Đây đề tài nằm phạm vi đề tài cấp Bộ mà ý tưởng xuất phát từ thực tiễn sở nghiên cứu đào tạo nhằm giải vấn đề khoa học Vì kết đề tài cần ứng dụng trở lại nhằm đảm bảo tính thực tiễn Cụ thể cần phối hợp với sở điều trị: - Chuẩn hóa qui trình phân lập, ni cấy tăng sinh, biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tế bào tạo xương người - Ứng dụng ghép tế bào gốc trung mơ tự thân biệt hóa thành tế bào tạo xương cho bệnh nhân cấy ghép mô xương bệnh lý xương ... marker tạo cốt bào 4.1.2.8 Nghiên cứu thực nghiệm nhằm đánh giá khả tạo xương tạo cốt bào biệt hóa từ tế bào gốc trung mơ tủy xương Chúng so sánh kết tạo xương hai nhóm thấy nhóm thực nghiệm. .. x500) MSC biệt hóa thành tạo cốt bào sau 21 (x750) Hình 3.7 Hình ảnh tế bào gốc trung mơ biệt hóa thành tạo cốt bào 14 Bảng 3.2 Kết biệt hóa định danh tạo cốt bào biệt hóa từ MSC tủy xương Thơng... Hình 3.6 Hình ảnh tế bào gốc trung mơ biệt hóa thành tế bào mỡ 3.1.7 Kết biệt hóa tế bào gốc trung mơ thành tạo cốt bào Sau nuôi cấy với môi trường cảm ứng biệt hóa ngày, tế bào có thay đổi hình