TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI Bộ môn Dược lý KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ THỐI HĨA KHỚP GỐI CỦA TD0015 TRÊN THỰC NGHIỆM Thời gian nghiên cứu: 09/2016- 6/2017 1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.1 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1.1 Thuốc nghiên cứu Viên hồn cứng TD0015 (TD0015) (gói 5g chứa viên hồn cứng) - Thành phần gói gồm: Hồng bá 4,35g, Sinh địa 1,36g, Tri mẫu 1,36g, Bạch thược 1,36g, Quy 1,35g, Phục linh 0,9g, Đỗ trọng 0,9g, Cao xương hỗn hợp 0,88g, Đương quy 0,57g, Đảng sâm 0,56g, Phòng phong 0,45g, Tang ký sinh 0,45g, Tần giao 0,45g, Ngưu tất 0,45g, Trần bì 0,36g, Xuyên khung 0,28g, Cam thảo 0,22g, Độc hoạt 0,20g, Quế chi 0,15g, Tế tân 0,11g Tá dược vừa đủ gói - Nơi sản xuất: Công ty Cổ phần Sao Thái Dương, đạt tiêu chuẩn sở - Liều dùng người: uống 10g/ngày (2 gói/ngày) Thuốc pha dung mơi nước cất trước cho động vật thí nghiệm uống 1.1.2 Hóa chất nghiên cứu - Monosodium-iodoacetate (MIA) lọ 25G hãng Sigma Aldrich (Singapore) cung cấp - Nước muối sinh lý - Cồn 70 độ, dung dịch sát khuẩn betadine - KIT định lượng IL1β, TNF α Hãng Invitrogen, Mỹ - Các hoá chất xét nghiệm làm tiêu mô bệnh học 1.1.3 Dụng cụ nghiên cứu - Bơm tiêm 0,3ml, gạc -Thước đo độ dày (Độ xác: 0,02mm): MC 555 hãng Hangzhou tools and measuring tools Co., Ltd (China) -Hệ thống xét nghiệm ELISA -Máy đo phản ứng đau Dynamic Plantar Aesthesiometer 37450 Ugo Basile (Italy) -Máy đo ngưỡng đau Analgesy meter 7200 Ugo Basile (Italy) 1.1.4 ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM Chuột cống trắng chủng Wistar giống, khỏe mạnh, trọng lượng 220 250 gam Học viện Quân y cung cấp Động vật nuôi điều kiện đầy đủ thức ăn nước uống phòng 2 thí nghiệm -10 ngày trước nghiên cứu suốt thời gian nghiên cứu Bộ môn Dược lý - Trường Đại học Y Hà Nội 1.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đánh giá tác dụng TD0015 mơ hình thối hóa khớp thực nghiệm Chuột cống trắng chia ngẫu nhiên thành lô, lô 10 con, Lô (chứng sinh học): tiêm vào khe khớp nước muối sinh lý, uống nước cất 1ml/100g chuột Lô (mơ hình): gây thối hóa khớp tiêm vào khe khớp MIA 3mg/khớp, uống nước chất 1ml/100g chuột Lô (chứng dương): gây thối hóa khớp tiêm vào khe khớp MIA 3mg/khớp, uống diclofenac 3mg/kg Lô (thuốc thử): gây thối hóa khớp tiêm vào khe khớp MIA 3mg/khớp, uống TD0015 liều 1,2g/kg/ngày (liều tương đương lâm sàng tính chuột cống hệ số 6) Lơ (thuốc thử): gây thối hóa khớp tiêm vào khe khớp MIA 3mg/khớp, uống TD0015 liều 3,6g/kg/ngày (liều gấp liều lâm sàng) Chuột lô nuôi ổn định điều kiện phòng thí nghiệm tuần trước đưa vào nghiên cứu Tại thời điểm bắt đầu nghiên cứu, chuột lô đến lô gây mơ hình thối hóa khớp thực nghiệm cách tiêm dung dịch MIA liều 3mg/khớp vào khớp gối phải chuột [1] [2] Riêng chuột lô chứng sinh học tiêm nước muối sinh lý dung môi pha thuốc vào khớp gối phải chuột Thể tích dung dịch tiêm vào khớp 50µl/khớp Ngay sau gây mơ hình tiêm MIA 3mg/khớp, lô uống nước, lô uống diclofenac liều 5mg/kg, lô uống TD0015 liều 1,2g/kg/ngày 3,6g/kg/ngày tương ứng Các lô chuột uống thuốc nước lần/ngày tuần liên tục Các số đánh giá *Đường kính khớp gối [3] Đường kính khớp gối phải đo thước chuyên dụng Palmer, tính khoảng cách lớn cạnh khớp gối Đường kính khớp gối đo nghiên cứu viên tất thời điểm để đảm bảo thống Đường kính khớp gối đo vào thời điểm: trước nghiên cứu, sau tiêm MIA uống thuốc ngày, ngày, tuần, tuần, tuần, tuần, tuần tuần Chỉ số đánh 3 giá độ tăng đường kính khớp gối thời điểm nghiên cứu so với trước nghiên cứu, đơn vị milimet (mm) * Tác dụng giảm đau viên hoàn cứng TD0015 máy đo ngưỡng đau [4] Đo thời gian phản ứng với đau chuột lực gây đau chuột (sử dụng máy Dynamic Plantar Aesthesiometer 37450 Ugo Basile, thông qua thời gian lực gây đau làm chuột nhấc chân khỏi kim Von Frey) vị trí gan chân sau, bên phải chuộttrước nghiên cứu, sau tiêm MIA uống thuốc tuần, tuần, tuần, tuần, tuần tuần, so sánh lơ chuột với Từ đánh giá tác dụng giảm đau khả vận động khớp gối phải chuột * Tác dụng giảm đau viên hoàn cứng TD0015 máy đo ngưỡng đau theo phương pháp Randall Selitto [5] Đo lực gây đau vị trí khớp gối chân sau, bên phải (được tiêm MIA) chuột lô, sử dụng máy Analgesy meter 7200 Ugo Basile, theo phương pháp Randall Selitto thời điểm trước nghiên cứu, sau tiêm MIA uống thuốc tuần, tuần, tuần, tuần, tuần tuần so sánh lô chuột với * Các số cytokin quan trọng viêm, thối hóa khớp [1] [6] Các Interleukin 1β TNF α số đặc hiệu, tăng cao thối hóa khớp, giảm số nghĩa làm chậm q trình thối hóa, cải thiện cấu trúc sụn khớp Các số định lượng huyết chuột thời điểm sau tuần tiêm MIA * Đánh giá mô bệnh học khớp gối Đánh giá ngẫu nhiên 20% số chuột lô sau tuần tiêm MIA uống thuốc, chuột gây mê phẫu thuật tách khớp gối phải khỏi thể, bảo quản dung dịch formaldehyd 10%, đánh giá mức độ thối hóa dựa tiêu giải phẫu mô bệnh học Kết giải phẫu bệnh đọc Bộ môn Giải phẫu bệnh – Trường Đại học Y Hà Nội 1.3 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊNCỨU - Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Dược lý – Trường Đại học Y Hà Nội - Thời gian nghiên cứu: từ tháng 9/2016 đến tháng 6/2017 1.4 XỬ LÝ SỐLIỆU: Các số liệu nghiên cứu biểu diễn dạng X ± 4 SD Các số liệu xử lý thống kê theo thuật toán thống kê T-test Studentvà test trước sau (Avant-après) phần mềm Excel 2013 Quy ước: *: p 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 p so mơ hình > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 p so diclofenac > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 Lô TD0015 3,6g/kg 10 19,68 17,09 ± 19,08 ± 22,52 ± 21,92 ± 4,02 5,06 4,20 3,02 23,59 22,29 ± ± 4,66 ± 6,82 6,00 p so chứng > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 p so mơ hình > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 p so diclofenac > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 p so liều thấp > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 Nhận xét: - Ở lô chứng sinh học, lực gây đau làm chuột nhấc chân khỏi kim Von Frey khơng có khác biệt tất thời điểm so với trước nghiên cứu (p > 0,05) - Ở lơ mơ hình: + Thời điểm sau tiêm MIA tuần, lực gây đau giảm so với trước nghiên cứu chưa khác biệt có ý nghĩa thống kê (p>0,05), giảm rõ rệt so với lô chứng sinh học (p0,05) + Ở thời điểm sau tuần tuần tiêm MIA, lực gây đau tăng lên rõ rệt khớp gối chuột bị tổn thương thối hóa, làm chậm hoạt động nhấc chân khỏi kim Von Frey, làm lực tác động tăng lên Lực gây đau thời điểm tăng cao có ý nghĩa thống kê so với trước nghiên cứu (p < 0,01 p < 0,001) so với lô chứng sinh học (p0,05), lực gây đau tăng so với lơ mơ hình khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê (p>0,05) + Từ thời điểm sau tuần đến sau tuần tiêm MIA, lực gây đau tăng lên, khơng có khác biệt so với trước nghiên cứu, so với lô chứng sinh học so với lơ mơ hình (p>0,05) + Ở thời điểm sau tiêm MIA tuần tuần, lực gây đau không khác biệt so với trước nghiên cứu so với chứng sinh học (p>0,05), lực gây đau giảm rõ rệt so với lơ mơ hình, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p0,05), giảm rõ rệt so với lô chứng sinh học (p0,05) + Từ thời điểm sau tuần đến sau tuần tiêm MIA, lực gây đau tăng lên, khơng có khác biệt so với trước nghiên cứu so với lô chứng sinh học (p>0,05) + Ở thời điểm sau tiêm MIA tuần, lực gây đau tăng so với trước nghiên cứu (p0,05) Ở thời điểm, lực gây đau không khác biệt so 9 với chứng sinh học (p>0,05), giảm rõ so với lơ mơ hình, đặc biệt thời điểm sau tuần (p < 0,05) cho thấy hạn chế hoạt động khớp gối chuột khắc phục + Tác dụng tương đương diclofenac 3mg/kg - Ở lô uống TD0015 liều 3,6g/kg: + Thời điểm sau tiêm MIA tuần, lực gây đau giảm nhẹ so với trước nghiên cứu so với chứng sinh học, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05), lực gây đau tăng nhẹ so với lơ mơ hình, khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê (p>0,05) + Từ thời điểm sau tuần đến sau tuần tiêm MIA, lực gây đau tăng lên, khơng có khác biệt so với trước nghiên cứu so với lô chứng sinh học (p > 0,05) + Ở thời điểm sau tiêm MIA tuần tuần, lực gây đau không khác biệt so với trước nghiên cứu so với chứng sinh học (p>0,05), lực gây đau giảm rõ so với lơ mơ hình, đặc biệt thời điểm sau tuần (p0,05), giảm rõ rệt so với lô chứng sinh học (p0,05) + Ở thời điểm sau tuần tuần tiêm MIA, thời gian phản ứng với đau tăng lên rõ rệt khớp gối chuột bị tổn thương thối hóa, làm chậm hoạt động nhấc chân khỏi kim Von Frey Lực gây đau thời điểm tăng cao có ý nghĩa thống kê so với trước nghiên cứu (p0,05) + Từ thời điểm sau tuần đến sau tuần tiêm MIA, thời gian phản ứng với đau tăng lên, khơng có khác biệt so với trước nghiên cứu, so với lô chứng sinh học so với lơ mơ hình (p>0,05) + Ở thời điểm sau tiêm MIA tuần tuần, thời gian phản ứng với đau không khác biệt so với trước nghiên cứu so với chứng sinh học (p>0,05), thời gian giảm rõ rệt so với lô mô hình, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p0,05), giảm rõ rệt so với lô chứng sinh học (p0,05) 12 12 + Từ thời điểm sau tuần đến sau tuần tiêm MIA, thời gian phản ứng với đau tăng lên, khơng có khác biệt so với trước nghiên cứu so với lô chứng sinh học (p>0,05) + Ở thời điểm sau tiêm MIA tuần, thời gian phản ứng với đau tăng so với trước nghiên cứu (p0,05) Ở thời điểm, thời gian phản ứng với đau không khác biệt so với chứng sinh học (p>0,05), giảm rõ so với lơ mơ hình, đặc biệt thời điểm sau tuần (p0,05), thời gian phản ứng với đau tăng so với lô mơ hình, khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) + Từ thời điểm sau tuần đến sau tuần tiêm MIA, thời gian phản ứng với đau tăng lên, khơng có khác biệt so với trước nghiên cứu so với lô chứng sinh học (p > 0,05) + Ở thời điểm sau tiêm MIA tuần tuần, thời gian phản ứng với đau không khác biệt so với trước nghiên cứu so với chứng sinh học (p>0,05), thời gian giảm rõ so với lơ mơ hình, đặc biệt thời điểm sau tuần (p 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,001 > 0,05 > 0,05 301,00 333,00 p so chứng p so mô hình p so diclofenac Lơ TD0015 275,00 tuần 257,00 84,46 86,26 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,001 279,09 321,82 p so chứng p so mơ hình Lơ TD0015 Sau Trước tuần tuần tuần tuần 255,60 333,00 312,00 316,00 ± ± ± ± 92,41 100,01 90,28 98,23 179,50 245,00 276,00 268,00 ± ± ± ± 97,10 44,03** 67,60* 83,30 58,73 95,78 > 0,05 < 0,01 < 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 286,80 322,00 328,00 348,00 331,00 341,00 Lô Diclofenac Lực gây đau khớp gối (g) Sau Sau Sau Sau Sau 10 ± ± 74,90 102,85 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,001 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 ± ± ± ± 134,06 109,93 68,22 52,38 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 0,05 < 0,05 277,27 286,36 286,36 294,55 ± ± 86,61 83,22 > 0,05 > 0,05 < 0,01 > 0,05 > 0,05 > 0,05 299,50 321,00 ± 56,22 233,00 ± 81,11 < 0,05 351,20 ± 107,03 > 0,05 < 0,05 299,09 ± ± ± 86,29 > 0,05 > 0,05 > 0,05 378,00 91,58 > 0,05 > 0,05 > 0,05 321,00 95,76 > 0,05 > 0,05 > 0,05 314,00 ± ± ± ± ± 104,84 > 0,05 < 0,01 > 0,05 > 0,05 118,18 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 110,03 > 0,05 < 0,05 > 0,05 < 0,05 88,63 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 81,27 > 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 14 - Ở lô chứng sinh học, lực gây đau khớp gối chuột khơng có khác biệt tất thời điểm so với trước nghiên cứu (p > 0,05) - Ở lơ mơ hình, tất thời điểm sau tiêm MIA, lực gây đau khớp gối chuột giảm so với trước nghiên cứu, rõ rệt vào thời điểm sau tuần tuần tiêm MIA (p < 0,05 p < 0,01) Lực gây đau khớp gối tất thời điểm sau tiêm MIA giảm so với lô chứng sinh học, thể rõ thời điểm sau tuần, tuần, tuần tuần tiêm MIA (p < 0,05 p < 0,01) - Ở lô uống diclofenac 3mg/kg, lực gây đau khớp gối tất thời điểm sau tiêm MIA không khác biệt so với trước nghiên cứu so với lô chứng sinh học (p > 0,05), tăng rõ so với lơ mơ hình, đặc biệt thời điểm sau tuần, tuần, tuần, tuần tuần (p < 0,05, p < 0,01 p < 0,001) - Ở lô uống TD0015 liều 1,2g/kg, lực gây đau khớp gối tất thời điểm sau tiêm MIA không khác biệt so với trước nghiên cứu so với lô chứng sinh học (p > 0,05), tăng rõ so với lơ mơ hình, đặc biệt thời điểm sau tuần tuần (p < 0,01 p < 0,001) Tác dụng không mạnh diclofenac 3mg/kg khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê (p>0,05) - Ở lô uống TD0015 liều 3,6g/kg, lực gây đau khớp gối tất thời điểm sau tiêm MIA không khác biệt so với trước nghiên cứu so với lô chứng sinh học (p > 0,05), tăng rõ so với lơ mơ hình, đặc biệt thời điểm sau tuần, tuần, tuần tuần (p < 0,05, p < 0,01 p < 0,001) Tác dụng mạnh so với liều 1,2g/kg, rõ thời điểm sau tuần (p < 0,05) Tác dụng tương đương với diclofenac 3mg/kg (p > 0,05) 15 15 3.4 Các số cytokin Bảng 3.5 Nồng độ Interleukin-1β Lơ thí nghiệm Lơ1: Chứng sinh học Lơ 2: Mơ hình (MIA Interleukin-1β p so p so p so chứng mơ hình diclofenac (pg/ml) thấp 142,85 ± 44,39 185,33 ± 45,13 < 0,05 Lô Diclofenac 3mg/kg 152,56 ± 19,44 > 0,05 < 0,05 Lô TD0015 1,2g/kg 155,02 ± 39,57 > 0,05 > 0,05 > 0,05 Lô TD0015 3,6g/kg 145,53 ± 22,34 > 0,05 < 0,05 > 0,05 3mg/khớp) p so liều > 0,05 Nhận xét: - Sau tuần tiêm MIA: + Ở lơ mơ hình, nồng độ interleukin-1β tăng cao rõ rệt so với chứng sinh học (p0,05), có xu hướng tăng so với chứng sinh học khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05) - Ở lô uống TD0015 liều 3,6g/kg, nồng độ interleukin-1β giảm rõ so với lơ mơ hình (p0,05) có xu hướng giảm lơ uống diclofenac 3mg/kg khác biệt chưa rõ (p>0,05) 16 16 Bảng 3.6 Nồng độ TNF-α Lơ thí nghiệm Lơ1: Chứng sinh học Lơ 2: Mơ hình (MIA TNF-α (pg/ml) p so p so p so chứng mơ hình diclofenac < 0,05 6,03 ± 1,93 > 0,05 < 0,05 Lô TD0015 1,2g/kg 8,51 ± 2,21 < 0,01 > 0,05 < 0,05 Lô TD0015 3,6g/kg 6,29 ± 1,46 > 0,05 < 0,05 > 0,05 Lô Diclofenac 3mg/kg thấp 5,83 ± 1,67 8,70 ± 2,83 3mg/khớp) p so liều < 0,05 Nhận xét: - Sau tuần tiêm MIA: + Ở lô mơ hình, nồng độ TNF-α tăng cao rõ rệt so với chứng sinh học (p < 0,05) - Ở lô uống diclofenac 3mg/kg, nồng độ TNF-α giảm so với lô mơ hình (p < 0,05), có xu hướng tăng nhẹ so với chứng sinh học khác biệt ý nghĩa thống kê (p > 0,05) - Ở lơ uống TD0015 liều 1,2g/kg, nồng độ TNF-α có xu hướng giảm so với lơ mơ hình khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê (p > 0,05), tăng so với chứng sinh học, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,01) - Ở lô uống TD0015 liều 3,6g/kg, nồng độ TNF-α giảm rõ so với lơ mơ hình (p 0,05) Tác dụng mạnh liều TD0015 1,2g/kg (p