TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ MÔN DƯỢC LÝ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG GIẢM ĐAU, CHỐNG VIÊM TRÊN THỰC NGHIỆM CỦA CÂY SÓNG RẮN THU HOẠCH TẠI THÁI NGUYÊN Hà Nội, - 2016 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN .3 1.1 Tổng quan dược liệu Sóng rắn -Chi Albizia 1.1.1 Vị trí phân loại chi Albizia 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố 1.1.3 Một số nghiên cứu dược liệu sóng rắn 1.2 Tổng quan mơ hình nghiên cứu tác dụng giảm đau invivo 1.2.1 Mô hình nghiên cứu tác dụng giảm đau ngoại biên .8 1.2.2 Mơ hình nghiên cứu tác dụng giảm đau trung ương 10 1.3 Các nghiên cứu chống viêm in vivo 12 1.3.1 Mơ hình gây tăng tính thấm thành mạch 13 1.3.2 Mơ hình gây phù tai chuột oxazolon 13 1.3.3 Mơ hình gây phù tai chuột dầu croton 14 1.3.4 Mơ hình gây phù chân chuột carrageenin 14 1.3.5 Mơ hình gây viêm khớp .15 1.3.6 Mơ hình gây viêm khớp carrageenan 15 1.3.7 Mơ hình gây viêm khớp formaldehyd .15 1.3.8 Mơ hình gây viêm khớp collagen 15 1.3.9 Mơ hình gây viêm khớp chất kích thích miễn dịch 16 1.3.10 Mơ hình gây u hạt 16 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.1 Thuốc hoá chất nghiên cứu .17 2.1.2 Động vật thực nghiệm 18 2.2 Phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1 Nghiên cứu độc tính bán trường diễn thỏ theo đường bơi 18 2.2.2 Phương pháp đánh giá tác dụng giảm đau chống viêm 22 2.3 Xử lý số liệu .25 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26 3.1 Kết nghiên cứu độc tính bán trường diễn 26 3.1.1 Tình trạng chung 32 3.1.2 Sự thay đổi thể trọng thỏ: 32 3.1.2 Đánh giá chức tạo máu 33 3.1.3 Đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan: .40 3.1.4 Đánh giá chức gan .42 3.1.5 Đánh giá chức thận 45 3.1.6 Thay đổi mô bệnh học 46 3.2 Kết nghiên cứu tác dụng giảm đau chống viêm 59 3.2.1 Nghiên cứu tác dụng giảm đau Sóng rắn phương pháp mâm nóng 59 3.2.2 Nghiên cứu tác dụng giảm đau Sóng rắn phương pháp rê kim .60 3.2.3 Đánh giá tác dụng chống viêm 61 Chương 4: BÀN LUẬN 66 4.1 Bàn luận độc tính bán trường diễn dịch chiết Sóng rắn 66 4.1.1 Ảnh hưởng dịch chiết Sóng rắn tươi khơ lên tình trạng chung cân nặng thỏ: .66 4.1.2 Ảnh hưởng dịch chiết Sóng rắn tươi khô lên số huyết học thỏ: .66 4.1.3 Ảnh hưởng dịch chiết Sóng rắn lên chức gan thỏ: 67 4.1.4 Ảnh hưởng dịch chiết Sóng rắn lên chức thận thỏ: 68 4.1.5 Ảnh hưởng dịch chiết Sóng rắn lên mơ bệnh học thỏ: 69 4.2 Bàn luận tác dụng giảm đau, chống viêm 69 4.2.1 Về tác dụng giảm đau 69 4.2.2 Về tác dụng chống viêm .70 KẾT LUẬN 72 KIẾN NGHỊ 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Bảng 3.6 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Bảng 3.9 Bảng 3.10 Bảng 3.11 Bảng 3.12 Bảng 3.13 Bảng 3.14 Bảng 3.15 Bảng 3.16 Bảng 3.17 Bảng 3.18 Bảng 3.19 Ảnh hưởng dịch chiết Sóng rắn đến thể trọng thỏ 32 Ảnh hưởng dịch chiết Sóng rắn đến số lượng hồng cầu máu thỏ 33 Ảnh hưởng dịch chiết Sóng rắn đến hàm lượng huyết sắc tố máu thỏ 34 Ảnh hưởng dịch chiết Sóng rắn đến hematocrit máu thỏ 35 Ảnh hưởng dịch chiết Sóng rắn đến thể tích trung bình hồng cầu máu thỏ 36 Ảnh hưởng dịch chiết Sóng rắn đến số lượng bạch cầu máu thỏ 37 Ảnh hưởng dịch chiết Sóng rắn đến cơng thức bạch cầu máu thỏ 38 Ảnh hưởng dịch chiết Sóng rắn đến số lượng tiểu cầu máu thỏ 39 Ảnh hưởng dịch chiết Sóng rắn đến hoạt độ AST (GOT) máu thỏ 40 Ảnh hưởng dịch chiết Sóng rắn đến hoạt độ ALT (GPT) máu thỏ 41 Ảnh hưởng dịch chiết Sóng rắn đến nồng độ bilirubin toàn phần máu thỏ 42 Ảnh hưởng dịch chiết Sóng rắn đến nồng độ albumin máu thỏ 43 Ảnh hưởng dịch chiết Sóng rắn đến nồng độ cholesterol toàn phần máu thỏ 44 Ảnh hưởng dịch chiết Sóng rắn đến nồng độ creatinin máu thỏ 45 Ảnh hưởng Sóng rắn lên thời gian phản ứng với nhiệt độ chuột nhắt trắng 59 Tác dụng giảm đau Sóng rắn chuột nhắt trắng máy rê kim .60 Cân nặng trung bình lơ chuột .61 Tác dụng chống viêm cấp Sóng rắn thể qua độ phù chân chuột mơ hình gây phù chân chuột cống 62 Tác dụng chống viêm cấp Sóng rắn thể qua độ dày chân chuột mơ hình gây phù chân chuột cống 64 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình 1.2: Hình 1.3: Hình 1.4: Hình 1.5: Hình 1.6 Cây sóng rắn (Albizia myriophylla Benth) Sóng rắn dài (Albizia procera) Sóng rắn dây (Acacia pennata) .6 Sóng rắn sừng nhỏ (Albizia corniculata) Sóng rắn Thái Nguyên .7 Một số máy đo ngưỡng đau khác dùng mô hình RandallSiletto Hình 1.7 Phương pháp xác định ngưỡng đau xạ nhiệt .11 Hình 1.8 Máy đo viêm Plethysmometer No 7250 Ugo - Basile (Italy).14 DANH MỤC ẢNH Ảnh 3.1: Ảnh 3.2: Ảnh 3.3: Ảnh 3.4: Ảnh 3.5: Ảnh 3.6: Ảnh 3.7: Ảnh 3.8: Ảnh 3.9: Ảnh 3.10: Ảnh 3.11: Ảnh 3.12: Ảnh 3.13: Ảnh 3.14: Ảnh 3.15: Ảnh 3.16: Ảnh 3.17: Ảnh 3.18: Ảnh 3.19: Hình ảnh da thỏ lơ chứng sinh học 46 Hình ảnh da thỏ lô chứng sinh học 46 Hình ảnh da thỏ lơ bơi Sóng Rắn tươi 47 Hình ảnh da thỏ lơ bơi Sóng Rắn tươi 47 Hình ảnh da thỏ lơ bơi Sóng Rắn khơ 48 Hình ảnh da thỏ lơ bơi Sóng Rắn khơ 48 Hình thái vi thể gan thỏ lơ chứng 50 Hình thái vi thể gan thỏ lô chứng 50 Hình thái vi thể gan thỏ lơ trị sau tuần bơi thuốc thử 51 Hình thái vi thể gan thỏ lô trị sau tuần bôi thuốc thử 51 Hình thái vi thể gan thỏ lô trị sau tuần bôi thuốc thử 52 Hình thái vi thể gan thỏ lơ trị sau tuần bơi thuốc thử 52 Hình thái vi thể thận thỏ lô chứng .53 Hình thái vi thể thận thỏ lơ chứng .54 Hình thái vi thể thận thỏ lô trị sau tuần bôi thuốc thử 54 Hình thái vi thể thận thỏ lơ trị sau tuần bôi thuốc thử 55 Hình thái vi thể thận thỏ lơ trị sau tuần bơi thuốc thử 55 Hình thái vi thể da thỏ lơ chứng da có cấu trúc bình thường 56 Hình thái vi thể da thỏ lơ chứng da có lympho bào trung bì nơng .57 Ảnh 3.20: Hình thái vi thể da thỏ lơ trị sau tuần bôi thuốc thử 57 Ảnh 3.21: Hình thái vi thể da thỏ lơ trị sau tuần bôi thuốc thử 58 Ảnh 3.22: Hình thái vi thể da thỏ lơ trị sau tuần bôi thuốc thử 58 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt đới nóng ẩm gió mùa nên có nguồn tài nguyên thực vật vơ phong phú đa dạng Chính nguồn tài nguyên cung cấp cho người nhiều sản phẩm thiên nhiên có giá trị nhiều lĩnh vực khác sống, đặc biệt dùng làm thuốc chữa bệnh [1], [2] Các loại thuốc thảo mộc dùng tác nhân điều trị trực tiếp, làm chất dò sinh hố để làm sáng tỏ nguyên lí dược học làm chất chuẩn để phát triển loại thuốc Chính việc nghiên cứu hố học hoạt tính sinh học lồi thuốc có ý nghĩa quan trọng cho việc sử dụng cách hợp lý có hiệu quản nguồn tài nguyên thiên nhiên Thái Nguyên tỉnh miền núi thuộc vùng trung du - miền núi Bắc Do nằm sát chí tuyến Bắc vành đai Bắc bán cầu, nên khí hậu tỉnh Thái Nguyên mang đậm tính chất khí hậu nhiệt đới gió mùa Bởi thế, địa phương có tiềm cho nhiều thuốc sinh trưởng phát triển Theo nghiên cứu nguồn tài nguyên thuốc năm 2010, huyện Võ Nhai, tỉnh Thái Nguyên có 136 lồi thực vật có khả làm thuốc chữa bệnh thuộc 122 chi, 63 họ ngành Trong đó, thuốc quý cần bảo vệ loài, chiếm 1,48% Một nghiên cứu khác năm 2011, huyện Đồng Hỷ, tỉnh Thái Nguyên có 187 lồi thực vật bậc cao có mạch nấm lớn có cơng dụng làm thuốc, thuộc 156 chi, 81 họ Trong có 12 lồi thuốc q hiếm, bị đe dọa tuyệt chủng Việt Nam, thuộc 10 chi, họ ngành thực vật bậc cao có mạch Chi Albizia có số lồi tương đối lớn phân bố rộng khắp vùng nhiệt đới từ châu Phi, châu Á, châu Úc Nam Mỹ Ở Việt Nam có 17 lồi với khoảng - lồi dùng làm thuốc có sóng rắn Cây sóng rắn (tên gọi dân gian) mọc hoang nhiều Thái Nguyên rìa rừng, đất trống, bờ cát dòng sơng, đất nghèo, từ vùng thấp đến độ cao 900m Sóng rắn nhân dân dùng để chữa bệnh viêm da mụn dộp, herpes, zona số bệnh khác [1], [2] Cho đến chưa có nghiên cứu nghiên cứu thuốc Để có sở khoa học an tồn hiệu dược liệu này, nâng cao giá trị sử dụng tìm hiểu đầy đủ thuốc An toàn hiệu hai yêu cầu bắt buộc nghiên cứu dược liệu thuốc y học cổ truyền [43] Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu độc tính tác dụng giảm đau, chống viêm thực nghiệm sóng rắn thu hái Thái Nguyên” với mục tiêu sau: Nghiên cứu kích ứng da độc tính bán trường diễn dịch chiết Sóng rắn động vật thực nghiệm Đánh giá tác dụng giảm đau chống viêm cấp sóng rắn động vật thực nghiệm Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan dược liệu Sóng rắn -Chi Albizia Qua quan sát đặc điểm hình thái, sóng rắn sơ nhận định lấy từ một vài loài thuộc chi Albizia, họ đậu - Fabaceae 1.1.1 Vị trí phân loại chi Albizia Theo tài liệu phân loại thực vật [1],[2], chi Albizia có vị trí phân loại sau: Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa hồng (Rosidae) Bộ Đậu (Fabales) Họ Đậu (Fabaceae) Chi Albizia 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố Cây gỗ, nhỡ mọc đứng hay leo dây leo Nhánh có gai nhỏ cong, có gốc sẹo Lá kèm hình dùi hay tai, thường rụng sớm Lá hai lần lơng chim có trục sơ cấp thứ cấp có tuyến Cụm hoa bơng, đầu hay ngù, cuống cụm hoa nách hay xếp thènh chùy nách Hoa gồm loại (ở trung tâm rìa) cụm hoa đầu ngù Đài hợp, xếp van, có Nhị nhiều, nhị dính thành ống gốc, bao phấn khơng có tuyến Bầu khơng cuống hay có cuống, có có tuyến mật Quả có van mỏng hay dai, mở hay khơng Hạt có cán, dẹp hay lồi hai mặt, màu vàng, nâu hay đen, khơng có hạt Chi Albizia có số lồi tương đối lớn phân bố rộng khắp vùng nhiệt đới từ châu Phi, châu Á, châu Úc Nam Mỹ Ở Việt Nam có 17 lồi, thường sử dụng nhiều là: A attopeuensis (pierre) I Nielsen - Bản xe Lao, Dây cai, Cha ke A chinensis (Osbeck) Merr - Sóng rắn Trung Quốc A corniculata - Sóng rắn sừng nhỏ, muồng gai A falcataria (L.) Fosb - Muồng giấy, Hợp hoan A julibrissin Durazz - Hợp hoan A kalkora (Roxb.) Prain - Hợp hoan núi A lebbeck (L.) Benth - Bồ kết tây, Lim xanh A lebbekoides (DC.) Benth - Bản xe trắng, câm trắng, muồng trúc A lucidior (Steud.) I Nielsen - Bản xe, đĩa roi, ché A myriophylla Benth - Sóng rắn, cam thảo cây, xe nhiều A odoratissima (L.f.) Benth - Hợp hoan thơm A procera (Roxb.) Benth - Muồng xanh, sóng rắn dài, cọ thon 1.1.3 Một số nghiên cứu dược liệu sóng rắn 1.1.3.1 Albizia myriophylla Benth - Tên khác: Sóng rắn, cam thảo cây, xe nhiều - Mô tả cây: Cây bụi mọc cao - 4m, tự hay leo, thân có vỏ màu nâu, cành non có lơng màu Lá kép có cuống chung dài 9cm, với - 16 cặp chét, chét có từ 20 - 40 cặp lá chét thứ cấp dài - 8mm, rộng 1mm, có lơng dìa Cụm hoa hình tán, mang hoa hình bán cầu dài 1mm, vành 4mm, có lơng vàng, 15 tiểu nhụy Quả giáp dài 12cm, rộng 2cm chứa hạt dài 6mm, màu nâu - Phân bố: Mọc phổ biến phía Nam có số người dựa vào vị vỏ thân vỏ rễ khai thác với mục đích dùng thay cam thảo - Bộ phận dùng: Vỏ thân, vỏ rễ, thu hái quanh năm dùng tươi hay phơi sấy khô - Thành phần hóa học: Trong rễ sóng rắn có 0,035% ancaloid, màu trắng ngà, vị đắng, 6% saponin thô màu vàng nâu nhạt, vị gắt cay hút ẩm ngồi khơng khí Ngồi có phản ứng flavonoid steroid 65 Kết bảng 3.23 cho thấy: - Voltaren có tác dụng giảm độ dày chân chuột thời điểm nghiên cứu, rõ vào thời điểm sau gây viêm 1h, 2h, 4h, 6h, 24h, 30h (p0,05) 4.1.5 Ảnh hưởng dịch chiết Sóng rắn lên mơ bệnh học thỏ: Giải phẫu đại thể vi thể gan thận số bắt buộc đánh giá độc tính bán trường diễn theo hướng dẫn Tổ chức Y tế giới [43] Hơn xét nghiệm vi thể tiêu chuẩn vàng để đánh giá tổn thương quan chịu trách nhiệm chuyển hóa thải trừ thuốc Trên tất thỏ nghiên cứu, không quan sát thấy có thay đổi bệnh lý mặt đại thể quan Hình ảnh vi thể gan khơng có khác biệt giữ lơ chứng lơ nghiên cứu Hình ảnh vi thể thận bình thường tất lô 4.2 Bàn luận tác dụng giảm đau, chống viêm 4.2.1 Về tác dụng giảm đau 4.2.1.1 Trên mơ hình giảm đau chế trung ương Phương pháp mâm nóng (hot plate) dùng để đánh giá tác dụng giảm đau thuốc dùng tác nhân kích thích nhiệt độ để gây đau Đo thời gian phản ứng với nhiệt chuột để so sánh đánh giá gián tiếp ngưỡng đau, thuốc có tác dụng giảm đau kéo dài thời gian phản ứng với nhiệt độ ngược lại Do thuốc nghiên cứu dạng bôi chỗ nên thuốc chứng dương sử dụng gồm có lidocain gây tê chỗ Voltaren (diclofenac) dạng bôi, thuốc giảm đau chống viêm khơng steroid Kết cho thấy có lidocain có tác dụng kéo dài thời gian phản ứng với nhiệt độ chuột, Voltaren Sóng rắn chiết từ tươi, khô tác dụng mơ hình Đây phương pháp đánh giá tác dụng giảm đau thuốc có chế tác dụng trung ương nhóm opioid nên thuốc bôi chỗ giảm đau theo chế ngoại biên hiệu tác dụng mơ hình [4], [17] 70 4.2.1.2 Trên mơ hình giảm đau chế ngoại biên Trong phương pháp rê kim, đo thời gian phản ứng chuột với tác nhân đau học cách dùng kim nhọn kích thích lòng bàn chân chuột, đồng thời ghi lại lực tác dụng kim lên chân chuột, qua đánh giá tác dụng giảm đau thuốc Thuốc giảm đau có tác dụng làm kéo dài thời gian phản ứng chuột trước tác nhân học gây tăng lực tác động kim mà chuột chịu đựng so với nhóm chứng Mơ hình chủ yếu để đánh giá tác dụng thuốc có chế tác dụng ngoại biên (ngưỡng đau), kết cho thấy Voltaren Sóng rắn chiết từ tươi, khô thể rõ tác dụng giảm đau, đặc biệt Sóng rắn khơ cho hiệu giảm đau mạnh Voltaren (p