1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư dày (UTDD), chủ yếu ung thư biểu mơ dày, bệnh ung thư phổ biến nhất, với số lượng mắc giới lên tới 952.000 ca năm Năm 2012, UTDD nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ ba giới; 70% số ca báo cáo nước phát triển, nửa số Đông Á [1] Việt Nam thuộc khu vực nguy UTDD trung bình cao, với tỷ lệ mắc chuẩn hóa theo tuổi 21,8 nam 10,0 nữ 100.000 dân [2] Mặc dù có nhiều tiến chẩn đoán, điều trị tiên lượng UTDD xấu, đặc biệt ung thư dày tiến triển, với tỷ lệ sốngthêm năm khoảng 28% [3] Các liệu pháp hóa trị cần thiết đa số bệnh nhân ung thư dày tiến triển, chúng cải thiện tiên lượng số bệnh nhân có chọn lọc với thời gian sống thêm tối đa không 12 tháng độc tính cao [4] Bên cạnh đó, nay, chưa có dấu ấn sinh học giúp lựa chọn bệnh nhân vào liệu pháp hóa trị Chính vậy, việc xác định yếu tố nguy để dự phòng phát sớm UTDD hướng nghiên cứu y học đại Bên cạnh yếu tố nguy liên quan đến mơi trường lối sống yếu tố di truyền đóng vai trò quan trọng hình thành phát triển ung thư Trong năm gần đây, với phát triển mạnh mẽ ngành Y sinh học phân tử, nhiều phương pháp đời giúp việc chẩn đoán phát sớm số loại ung thư nói chung UTDD nói riêng Nguyên tắc chung phương pháp sử dụng kỹ thuật phân tích DNA xác định gen gây ung thư Các gen phát mơ ung thư, hạch lympho tủy xương chí máu ngoại vi Dựa vào việc phân tích tính đa hình thái số gen chủ chốt xác định nguy gây UTDD thông qua phân bố kiểu gen cá thể Gen mucin (MUC1) thành viên họ mucin, mã hóa chất nhầy glycoprotein bám màng tế bào, có nhiều quan phổi, tuyến vú, thực quản, tá tràng, mắt,… Tại dày, protein nhầy tạo rào cản vật lý có vai trò bảo vệ tế bào biểu mơ khỏi tác nhân gây viêm, dẫn tới ung thư từ môi trường bên Trước đây, MUC1 coi gen sinh ung thư với vai trò chống lại trình chết theo chương trình tế bào ung thư [5] Một vài nghiên cứu chứng minh có tương quan biểu gen MUC1 với tiên lượng xấu bệnh nhân ung thư [6] [7] [8] Gần đây, giới có nhiều nghiên cứu cho thấy có liên quan tính đa hình thái đơn (SNP) vị trí rs2070803 rs4072037 gen MUC1 tới nguy mắc UTDD như: Saeki N (2011) [9]; Li F (2012) [10]; Hiromi Sakamoto (2014) [5]; Li-Xin Qiu (2016) [11];… Tuy nhiên Việt Nam, chưa có nghiên cứu cơng bố đánh giá tỷ lệ mắc SNP đánh giá nhạy cảm vị trí gen MUC1 tới UTDD Do đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Đánh giá tính đa hình rs2070803 rs4072037 gen MUC1 bệnh nhân ung thư dày” nhằm phục vụ cho nghiên cứu sâu với mục tiêu: Xác định tính đa hình rs2070803 rs4072037 gen MUC1 bệnh nhân ung thư dày Xác định mối liên quan đa hình rs2070803 rs4072037 với số yếu tố nguy ung thư dày CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược ung thư dày 1.1.1 Dịch tễ học yếu tố nguy ung thư dày 1.1.1.1 Dịch tễ học Ung thư dày (UTDD) loại ung thư thường gặp, với khoảng 989.000 trường hợp mắc năm toàn giới [12] Tổ chức Y tế Thế giới ước tính năm 2012, UTDD chiếm 723.000 trường hợp tử vong toàn giới [13] UTDD phân bố không đồng giới, biến đổi địa lý ảnh hưởng lớn đến đến tỷ lệ mắc bệnh toàn giới, có tới khoảng hai phần ba số bệnh nhân UTDD nước phát triển Tỷ lệ mắc cao thấy Nhật Bản, Nam Mỹ, Đông Âu, tỷ lệ mắc thấp Bắc Mỹ, Ấn Độ, Nigieria Úc [14] Hình 1.1: Tỷ lệ mắc UTDD chuẩn hóa theo tuổi giới (trên 100.000 người) [11] Việt Nam thuộc khu vực có tỷ lệ mắc UTDD trung bình cao, với tỷ lệ mắc UTDD chuẩn hóa theo tuổi nam 21,8 nữ 10,0 100.000 dân [2] Theo nghiên cứu Trần Văn Huy Bệnh viện Trung ương Huế, nhóm bệnh ung thư tiêu hóa, UTDD chiếm tỉ lệ cao (52,4%) [15] 1.1.1.2 Các yếu tố nguy UTDD hậu tương tác phức tạp yếu tố vật chủ với môi trường  Yếu tố môi trường Nhiều nghiên cứu cho thấy nhóm nguy mơi trường quan trọng chế độ ăn uống, hút thuốc nhiễm H pylori - Chế độ ăn uống có nhiều nitrat loại cá, thịt chế biến sẵn, loại thức ăn xơng khói, ướp muối, làm tăng nguy UTDD Nitrosamin có thức ăn số loại thức ăn chứa nitrat tạo chất gây UTDD [16], [3] Ăn rau trái làm tăng nguy UTDD [16] - Hút thuốc làm tăng nguy UTDD lên 1,56 lần [17] Theo Gonzalez, xấp xỉ 18% trường hợp UTDD quy cho hút thuốc Nguy UTDD tăng theo thời gian hút thuốc giảm sau 10 năm cai thuốc [18] - H pylori Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) xếp vào tác nhân gây ung thư nhóm I [3] Có nhiều chứng dịch tễ mối liên quan nhiễm H pylori với UTDD, đặc biệt UTDD không thuộc tâm vị Nhiễm H pylori làm tăng nguy UTDD không thuộc tâm vị xấp xỉ lần Người ta ước tính H pylori nguyên nhân khoảng 63% trường hợp UTDD không thuộc tâm vị toàn giới [19] Tại Việt Nam, Phạm Quang Cử nhận thấy có mối liên quan nhiễm H pylori với viêm dày teo, dị sản ruột, loạn sản niêm mạc dày [20] Tỷ lệ UTDD người nhiễm H pylori cao người không nhiễm H pylori với tỷ số chênh (Odds Ratio: OR) = 3,3-3,6 [20], [21] Do vậy, người ta cho viêm dày teo mạn tính, dị sản ruột tổn thương tiền ác tính UTDD [3] - Tiền sử có phẫu thuật cắt dày: Tỷ lệ mắc UTDD phần dày lại tăng lên sau phẫu thuật cắt dày Sau 20 năm, tỷ lệ mắc UTDD hàng năm bệnh nhân cắt bán phần dày khoảng 3% [22] - Nội tiết tố sinh dục nữ: Trên toàn giới, tỷ lệ mắc UTDD phụ nữ thấp định so với nam giới ung thư tâm vị lẫn UTDD không thuộc tâm vị [23], [24], [22] Nghiên cứu Freedman cho thấy có liên quan chặt chẽ UTDD với tuổi mãn kinh, tuổi sinh đẻ, số năm sau mãn kinh Tỷ lệ nguy UTDD giảm 0,80 tăng tuổi mãn kinh năm Người sinh đẻ nhỏ 30 tuổi có nguy UTDD tăng 1,9 lần so với người sinh đẻ lúc lớn 30 tuổi Sau mãn kinh, tỷ số nguy UTDD tăng 1,26 lần năm [25]  Yếu tố nguy liên quan với vật chủ - Yếu tố di truyền: UTDD thường xảy người có nhóm máu A thường gặp gia đình anh em sinh đôi [16] UTDD thể lan tỏa di truyền loại UTDD di truyền xác định rõ đột biến dòng phơi gen E-cadherin (CDH1) [26] - Polyp dày: U tuyến chiếm khoảng 10% polyp dày, khối u xuất phát từ tổ chức tuyến dày, có nguy tiến triển thành ung thư cao Khoảng 2% polyp tăng sản phát triển thành ung thư Các polyp tuyến đáy vị thường gặp phần đáy dày, khơng diễn biến thành ác tính trừ người có hội chứng đa polyp tuyến gia đình [22] - Loét dày tá tràng: Nghiên cứu tập lớn Hansson theo dõi gần 60.000 bệnh nhân Thụy Điển vào viện loét dày loét tá tràng thời gian trung bình năm cho thấy nguy UTDD tăng 1,8 lần bệnh nhân loét dày lành tính giảm 0,6 lần bệnh nhân loét tá tràng lành tính [27] 1.1.2 Phân loại ung thư dày 1.1.2.1 Theo vị trí Hiện nay, người ta có khuynh hướng chia UTDD thành loại ung thư tâm vị ung thư không thuộc tâm vị lẽ dịch tễ, bệnh nguyên, mô bệnh học, điều trị tiên lượng UTDD từ hai vị trí khác rõ [28], [29], [30], [31] + Tâm vị: ung thư khoảng 1cm đến cm đường nối thực quản dày + Không thuộc tâm vị gồm vị trí sau: o Phình vị, thân vị o Bờ cong lớn, bờ cong nhỏ o Hang, môn vị o Vị trí khác tổn thương ảnh hưởng lên toàn dày chồng lấn khu vực khơng thuộc tâm vị Hình 1.2: Vị trí tổn thương ung thư dày UTDD khơng thuộc tâm vị thường gặp khu vực có tỷ lệ mắc UTDD cao, ngược lại ung thư tâm vị thường gặp khu vực có tỷ lệ mắc UTDD thấp Tại nước phát triển, ung thư tâm vị tăng đáng kể 50 năm qua [32] Tại số nước Châu Á có điều kiện kinh tế phát triển, tỷ lệ ung thư tâm vị tăng Deans ghi nhận Singapore ung thư tâm vị tăng từ 6,3% lên 20,1% vòng 25 năm [33] UTDD khơng thuộc tâm vị có liên quan chặt chẽ với tình trạng nhiễm H pylori mạn tính, ngược lại ung thư tâm vị thường hậu trào ngược dày thực quản mạn tính [32] Tiên lượng ung thư tâm vị thường xấu UTDD không thuộc tâm vị (Biểu đồ 1.1) [33], [29] Deans nhận thấy thời gian sống thêm trung bình ung thư tâm vị sau phẫu thuật triệt để 26 tháng, thấp có ý nghĩa so với 69 tháng UTDD không thuộc tâm vị (p < 0,001) [33] Biểu đồ 1.1 Đường cong sống thêm bệnh nhân ung thư tâm vị ung thư dày không thuộc tâm vị [29] 1.1.2.2 Phân loại Borrmann Dựa hình ảnh đại thể, Borrmann chia UTDD thành týp (Hình 1.2) áp dụng cho trường hợp UTDD tiến triển [34] - Týp I (dạng polyp): tổn thương lồi vào lòng dày, khơng có hoại tử lt lớn - Týp II (dạng nấm): khối u lồi lên, kích thước thay đổi, hình dáng khơng đều, có vùng lt - Týp III (dạng loét): tổn thương loét khơng đều, kích thước thay đổi, với bờ rõ, cứng, chắc, gồ lên thẳng góc khơng xi bờ týp II - Týp IV (dạng thâm nhiễm): khối u thâm nhiễm lan tỏa tổn thương dạng xơ đét (linitis plastica) Tổn thương dạng thâm nhiễm lan tỏa khơng có giới hạn rõ rệt phần tổn thương niêm mạc dày bình thường Ung thư thể xơ đét khối u thâm nhiễm mạnh gồm tế bào ác tính kèm theo phản ứng tạo xơ rõ rệt làm cho dày cứng, giống lọ da (leather bottle) Ở giai đoạn đầu, ung thư thể xơ đét dễ nhầm với viêm dày Hình A: Dạng polyp Hình B: Dạng nấm Hình C: Dạng loét Hình D: Dạng thâm nhiễm Hình 1.3: Phân loại hình ảnh đại thể theo Borrmann Các thầy thuốc nội soi phẫu thuật viên thường dùng bảng phân loại để mơ tả hình ảnh đại thể khối u cách phân loại đơn giản, dễ sử dụng có giá trị tiên lượng định UTDD 1.1.2.3 Theo mô bệnh học Về mặt vi thể, phân loại UTDD đa dạng phức tạp, chủ yếu dựa kiểu hình mơ học chiếm ưu [35] Hiện nay, hai cách phân loại áp dụng nhiều dùng để tiên lượng cho bệnh nhân phân loại Lauren (1965) WHO (2010) Bảng 1.1: Phân loại mô bệnh học ung thư biểu mô dày [36], [37] Lauren 1965 Typ ruột Typ lan tỏa Typ hỗn hợp WHO (2010) Ung thư biểu mô tuyến nhú Ung thư biểu mô tuyến ống Ung thư biểu mô tuyến nhầy Ung thư biểu mô tế bào nhẫn Các ung thư biểu mơ kết dính khác Ung thư biểu mơ hỗn hợp Ung thư biểu mô tuyến vảy Ung thư biểu mô tế bào vảy Ung thư biểu mô tuyến dạng tế bào gan Ung thư biểu mô với chất lympho Ung thư biểu mô thai Sacôm ung thư biểu mô Ung thư biểu mô tuyến ống thể ung thư biểu mô dày thường gặp [22] Các bệnh nhân UTDD thể ống nhỏ, thể nhú thường có tiên lượng tốt bệnh nhân thể nhầy, thể tế bào nhẫn thể khơng biệt hóa [38], [39] 1.1.3 Tiên lượng ung thư dày Có nhiều yếu tố ảnh hưởng lên tiên lượng UTDD Các yếu tố tiên lượng kinh điển toàn trạng, tuổi, giới tính, vị trí, kích thước, phân loại mơ bệnh học khối u [40] Phân độ biệt hóa TCYTTG chia UTDD thành có mức độ biệt hóa [41]: - Biệt hóa tốt: Cấu trúc tuyến hình dáng rõ ràng, thường giống với biểu mô ruột dị sản; - Biệt hóa kém: gồm tuyến hình dáng khơng rõ, không thâm nhiễm gồm tế bào đơn lẽ chuỗi tế bào nhỏ; - Biệt hóa vừa: có hình ảnh trung gian biệt hóa tốt biệt hóa Tiên lượng UTDD biệt hóa thường xấu so với UTDD biệt hóa tốt Lazăr thấy thời gian sống thêm trung bình bệnh nhân UTDD biệt hóa tốt 60 tháng, biệt hóa vừa 22,3 tháng biệt hóa 11,2 tháng tỷ lệ sống thêm năm thể 100%, 25% 7,7% [38] Tuy nhiên, quan trọng độ sâu xâm lấn (giai đoạn T), tình trạng di 10 hạch vùng (giai đoạn N) di xa (giai đoạn M) [42] UTDD sớm tiên lượng tốt [3] Những kết ủng hộ cho đời phương pháp đánh giá giai đoạn UTDD dựa đánh giá giai đoạn TNM AJCC/UICC sử dụng phạm vi toàn giới (Bảng 2.2) [31] Bảng 1.2 Hệ thống đánh giá giai đoạn ung thư dày Ủy ban Hợp Hoa Kỳ Ung thư Liên minh Kiểm soát Ung thư Quốc tế lần thứ [31] Giai đoạn T Tis (T0) T1 T2 T3 T4a T4b N N0 N1 N2 N3 M M0 M1 Bệnh I II III IV Mô tả Khối u Ung thư biểu mơ chỗ, khơng có xâm lấn lớp mô đệm Khối u xâm lấn vào lớp mô đệm, niêm lớp niêm mạc Khối u xâm lấn vào lớp Khối u xâm lấn lớp mạc Khối u xâm lấn vào lớp mạc (phúc mạc tạng) Khối u xâm lấn vào cấu trúc kế cận Hạch bạch huyết vùng Khơng có di hạch bạch huyết vùng Di 1-2 hạch bạch huyết vùng Di 2-6 hạch bạch huyết vùng Di ≥ hạch bạch huyết vùng Di xa Khơng có di xa Di xa Giai đoạn ung thư dày TisN0M0 T1N0M0, T2N0M0, T1N1M0 T3N0M0, T2N1M0, T1N2M0, T4aN0M0, T3N1M0, T2N2M0, T1N3M0 T4aN1M0, T3N2M0, T2N3M0, T4bN0M0, T4bN1M0, T4aN2M0, T3N3M0, T4bN2M0, T4bN3M0, T4aN3M0 Bất kỳ T, N, M1 1.2 Vị trí, cấu trúc gen protein MUC1 1.2.1 Vị trí gen Ở người, gen MUC1 nằm nhánh dài nhiễm sắc thể số 1, vùng 2, băng (ký hiệu: 1q22), kích thước 4407 bp, gồm exon intron 102 Cao XY, Jia ZF and Jin MS (2012) Serum pepsinogen II is a better diagnostic marker in gastric cancer World J Gastroenterol, 18 (48), 7357 – 7361 103 Takahiro Uotani and David Y (2015) Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test Ann Transl Med, (1), 104 Yamaguchi Y, Nagata Y, Hiratsuka R, et al (2016) Gastric Cancer Screening by Combined Assay for Serum Anti-Helicobacter pylori IgG Antibody and Serum Pepsinogen Levels - The ABC Method Digestion, 93 (1), 13-18 105 Fujiao Duan, Chunhua Song, Liping Dai, et al (2014) The Effect of MUC1 rs4072037 Functional Polymorphism on Cancer Susceptibility: Evidence from Published Studies Plos ONE, (4) 106 Xinyang Liu, Zhichao Wang, Xiaowei Zhang, et al (2014) MUC1 gene polymorphism rs4072037 and susceptibility to gastric cancer: a metaanalysis SpringerPlus, 107 Đoàn Hữu Nghị (2012) Ung thư dày, Cập nhật bệnh thường gặp lâm sàng bệnh viện, Nhà xuất Y học 108 Phạm Duy Hiển Nguyễn Anh Tuấn (2001) Tình hình phẫu thuật điều trị ung thư dày bệnh viện 108 từ 1994 – 2000, Bộ Y tế - WHO, 109 Tafe L.J., Janjigian Y.Y and Zaidinski M (2011) Human epidermal growth factor receptor testing in gastroesophageal cancer correlation between immunohistochemistry and fluorescence in situ hybridization Archives of Pathology & Laboratory Medicine, 135, 1460-1465 110 Đỗ Trọng Quyết, Đỗ Đức Vân Trịnh Hồng Sơn (2009) Kết điều trị phẫu thuật ung thư dày Bệnh viện đa khoa tỉnh Thái Bình từ tháng 1/2006 đến 7/2008 Y học thực hành, 669 (8), 32-37 111 An J.Y., Kang T.H., Choi M.G , et al (2008) Borrmann Type IV: An independent prognostic factor for survival in gastric cancer Journal of Gastrointestinal Surgery, 12, 1364-1369 112 Lee K.E., Lee H.J., K Y.H., et al (2003) Prognostic significance of p53, nm23, PCNA and c-erbB-2 in gastric cancer Japanese Journal of Clinical Oncology, 33, 173-179 113 Yokota T, Ishiyama S, Saito T, et al (2002) Is tumor size a prognostic indicator for gastric carcinoma? Anticancer Res, 22 (6B), 3673-3677 114 Wang HM, Huang CM, Zheng CH, et al (2012) Tumor size as a prognostic factor in patients with advanced gastric cancer in the lower third of the stomach World J Gastroenterol, 18 (38), 5470-5475 115 Gamboa-Dominguez A., Dominguez-Fonseca C., Quintanilla-Martinez L , et al (2004) Epidermal growth factor receptor expression correlates with poor survival in gastric adenocarcinoma from Mexican patients: a multivariate analysis using a standardized immunohistochemical detection system Modern Pathology, 17, 579-587 116 Matsubara J., Yamada Y., Hirashima Y., et al (2008) Impact of insulin-like growth factor type receptor, epidermal growth factor receptor, and HER2 expressions on outcomes of patients with gastric cancer Clinical Cancer Research, 14 (10), 3022-3029 117 Yan S.Y., Hu Y., Fan J.G., et al (2011) Clinicopathologic significance of HER2/neu protein expression and gene amplification in gastric carcinoma World Journal of Gastroenterologyogy, 17 (11), 1501-1506 NỒNG ĐỘ VÀ ĐỘ TINH SẠCH MẪU DNA ĐÃ TÁCH CHIẾT Mã số mẫu đo K1 K2 K3 K4 K5 K6 K7 K8 K9 K10 K11 K12 K13 K14 K15 K16 K17 K18 K19 K20 K21 K22 K23 K24 K25 K26 K27 K28 K29 K30 K31 K32 K33 K34 Nồng độ (ng/µl) Độ tinh 34,9 19,8 22,5 37,0 40,9 56,8 19,6 24,3 16,8 91,2 67,9 18,0 45,1 23,4 23,1 20,6 26,4 20,7 21,2 39,1 28,2 18,0 37,2 8,9 53,2 48,1 35,6 37,3 35,6 34,6 22,1 61,4 48,5 17,0 1,88 1,90 1,97 1,80 1,88 1,93 1,83 1,82 1,94 1,84 1,82 2,01 1,80 1,92 1,90 1,75 1,91 1,76 1,93 2,17 1,87 1,79 1,71 1,92 1,80 1,85 1,81 2,00 1,86 1,92 1,94 1,87 1,90 1,87 Mã số mẫu đo C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 C13 C14 C15 C16 C17 C18 C19 C20 C21 C22 C23 C24 C25 C26 C27 C28 C29 C30 C31 C32 C33 C34 Nồng độ (ng/µl) Độ tinh 37,1 54,7 81,8 53,6 104,5 58,6 104,1 51,7 27,2 72,8 32,2 41,2 57,0 36,8 26,0 66,7 22,1 37,7 31,7 48,9 39,2 55,0 101,0 23,8 15,3 22,9 22,1 45,2 32,7 62,3 56,8 120,9 191,7 55,6 1,83 1,92 1,90 1,90 1,86 1,93 1,88 1,77 1,94 1,92 1,71 1,85 1,92 1,73 1,98 1,89 1,70 1,87 1,93 1,90 1,73 1,93 1,90 1,93 1,84 1,87 1,90 1,87 1,81 1,91 1,89 1,85 1,87 2,00 K35 K36 K37 K38 K39 K40 K41 K42 K43 K44 K45 K46 K47 K48 K49 K50 K51 K52 K53 K54 K55 K56 K57 K58 K59 K60 K61 K62 K63 K64 K65 K66 K67 K68 K69 K70 K71 64,9 40,0 44,6 79,7 13,9 11,1 15,1 43,0 48,8 32,3 25,9 58,9 22,0 103,1 46,4 12,5 32,2 43,2 7,1 43,5 56,4 6,2 46,1 15,7 8,0 29,4 43,3 8,3 9,4 41,5 14,2 30,3 15,0 12,5 32,7 23,4 141,1 1,88 1,92 1,91 1,86 1,73 1,77 2,08 1,86 1,89 1,75 1,89 1,92 1,84 1,85 1,89 2,05 1,80 1,86 1,98 1,80 1,80 2,26 1,85 1,83 2,09 1,91 1,94 1,67 1,92 1,84 1,70 1,87 1,78 1,92 1,90 1,90 1,88 C35 C36 C37 C38 C39 C40 C41 C42 C43 C44 C45 C46 C47 C48 C49 C50 C51 C52 C53 C54 C55 C56 C57 C58 C59 C60 C61 C62 C63 C64 C65 C66 C67 C68 C69 C70 C71 64,7 55,8 25,9 58,9 21,7 16,5 49,9 418,3 40,1 35,4 41,5 54,3 30,1 27,2 22,6 54,9 17,1 58,8 48,4 240,4 25,3 33,4 76,2 10,2 17,3 47,8 18,2 47,2 37,2 69,3 60,5 20,5 16,2 25,4 41,2 24,5 50,7 1,90 1,88 1,89 1,92 1,79 1,80 1,76 1,83 1,89 1,92 1,91 1,84 1,85 1,81 1,90 1,93 1,89 1,96 1,70 1,84 1,88 1,75 1,85 1,86 1,81 1,85 1,83 1,87 1,91 1,89 1,91 1,93 1,90 1,81 1,85 1,80 1,93 K72 K73 K74 K75 K76 K77 K78 K79 K80 K81 K82 K83 K84 K85 K86 K87 K88 K89 K90 K91 K92 K93 K94 K95 K96 K97 K98 K99 K100 K101 K102 K103 K104 K105 K106 K107 K108 65,3 33,3 33,6 38,2 46,5 166,8 27,2 15,6 22,7 57,3 51,5 31,5 17,3 47,8 46,0 24,0 51,7 36,1 26,3 32,6 53,7 8,8 42,7 17,1 27,5 45,9 45,2 54,2 83,9 16,6 117,1 17,0 24,1 9,6 42,9 6,0 54,8 2,00 1,88 1,89 1,81 1,83 1,87 1,94 1,80 1,99 1,89 1,94 1,89 1,81 1,85 1,88 1,92 1,88 1,89 1,86 1,89 1,93 2,09 1,78 2,00 1,84 1,89 1,84 1,86 1,84 1,77 1,88 1,95 1,88 2,06 1,94 1,76 1,85 C72 C73 C74 C75 C76 C77 C78 C79 C80 C81 C82 C83 C84 C85 C86 C87 C88 C89 C90 C91 C92 C93 C94 C95 C96 C97 C98 C99 C100 C101 C102 C103 C104 C105 C106 C107 C108 89,4 40,1 51,1 39,5 70,5 57,1 126,5 27,5 15,7 27,2 47,2 30,5 40,9 43,1 30,6 26,0 30,2 42,7 25,3 37,7 9,4 10,5 27,8 47,2 29,2 51,8 23,9 23,4 30,3 24,0 29,0 29,4 43,3 49,90 32,5 10,2 32,3 1,92 1,89 1,87 1,81 1,85 1,91 1,91 1,84 1,83 1,84 1,87 1,88 1,90 1,95 1,92 1,96 1,73 1,78 1,90 1,87 1,88 1,80 1,93 1,87 1,86 1,86 1,82 1,83 1,87 1,83 1,89 1,91 1,94 1,84 1,92 1,93 1,75 K109 K110 K111 K112 K113 K114 K115 K116 K117 K118 K119 K120 K121 K122 K123 K124 K125 K126 K127 K128 K129 K130 11,6 19,4 23,0 18,2 47,2 29,2 11,1 36,3 28,3 27,3 45,5 25,5 71,7 48,3 36,3 29,1 25,8 62,2 33,0 39,5 27,2 38,4 2,09 1,88 1,82 1,83 1,87 1,86 2,17 1,85 1,85 1,82 1,85 1,86 1,89 1,88 1,88 1,81 2,09 1,90 1,76 1,81 1,88 1,87 C109 C110 C111 C112 C113 C114 C115 C116 C117 C118 C119 C120 C121 C122 C123 C124 C125 C126 C127 C128 C129 C130 25,9 43,3 62,8 28,8 75,4 29,6 46,4 62,2 155,2 37,5 20,2 323,5 32,6 40,3 29,5 11,2 47,9 71,7 28,4 75,8 32,6 32,7 1,89 1,95 1,80 1,91 1,89 1,81 1,89 1,90 1,88 1,86 1,78 1,84 1,95 1,87 1,89 2,03 1,85 1,92 1,92 1,90 1,89 1,80 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG I HC Y H NI NGUYN VN TN ĐáNH GIá TíNH ĐA HìNH rs2070803 Và rs4072037 GEN MUC1 TRÊN BệNH NHÂN UNG THƯ Dạ DàY Chuyờn ngnh : Húa sinh y học Mã số : 60720106 LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS ĐẶNG THỊ NGỌC DUNG HÀ NỘI – 2018 LỜI CẢM ƠN Nhân dịp hồn thành luận văn tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: Ban giám hiệu, Phòng đào tạo sau đại học Bộ mơn Hố sinh - Trường Đại học Y Hà Nội Ban giám đốc Bệnh viện K Tân Triều, bệnh viện Đại học Y Hà Nội, bệnh viện Việt Đức, bệnh viện 108 tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập nghiên cứu Đặc biệt xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Đặng Thị Ngọc Dung - người thầy tận tình dạy bảo trực tiếp hướng dẫn cho trình học tập thực nghiên cứu đề tài Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS TS Tạ Thành Văn – Hiệu phó, trưởng Bộ mơn Hoá sinh, giảng viên trường Đại học Y Hà Nội động viên, tạo điều kiện cho suốt trình học tập thực nghiên cứu đề tài Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể bác sỹ, y tá, đồng nghiệp khoa Hoá sinh bệnh viện K Tân Triều, bệnh viện Đại học Y Hà Nội, bệnh viện Việt Đức, bệnh viện 108, Trung tâm kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm Y học giúp đỡ tơi q trình học tập thực nghiên cứu đề tài Cuối cùng, xin ghi nhớ công ơn sinh thành, nuôi dưỡng tình u thương Cha mẹ tơi, ủng hộ gia đình, bạn bè, đồng nghiệp, người bên cạnh động viên, ủng hộ, giúp đỡ tạo điều kiện cho giúp đỡ tơi hồn thiện luận văn Hà Nội, ngày 10 tháng 09 năm 2018 Học viên Nguyễn Văn Tân LỜI CAM ĐOAN Kính gửi : - Phòng quản lý đào tạo Sau Đại học - Trường Đại học Y Hà Nội - Bộ mơn Hóa sinh - Trường Đại học Y Hà Nội - Hội đồng bảo vệ Luận văn Thạc sỹ Y học năm 2018 Tôi Nguyễn Văn Tân, học viên bác sĩ nội trú khóa 40 trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa Sinh, xin cam đoan: 1.Đây luận văn thân trực tiếp thực hướng dẫn PGS TS Đặng Thị Ngọc Dung Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam 3.Các số liệu thơng tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan Tơi xin chịu hồn tồn trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày 10 tháng 09 năm 2018 Học viên Nguyễn Văn Tân DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A : Adenine AJCC : American Joint Committee of Cancer (Ủy ban Hợp Hoa Kỳ Ung thư) Bp : Base pair C : Cytosine CEA : Carcinoembryonic antigen Da : Dalton DNA : Deoxyribonucleotid Acid dNTP : Deoxyribonucleotid-5-triphosphate G : Guanine GPB : Giải phẫu bệnh HP : Helicobacter Pylori MUC1 : Mucin NCBI : National center for biotechnology information (Trung tâm quốc gia thông tin kỹ thuật sinh học) OD : Optical density (độ hấp thụ quang) OR : Odds ratio (tỷ suất chênh) PCR : Polymerase chain reaction (phản ứng khuếch đại chuỗi gen) SNP : Single nucleotide polymorphism (hiện tượng đa hình thái đơn nucleotid) SSCP : Single strand comformation polymorphyism T : Thymine UICC : Union for International Cancer Control (Liên minh Kiểm soát Ung thư Quốc tế ) UTDD : Ung thư dày VNTR : Variable Number Tandem Repeat WHO : World health organization (tổ chức y tế giới) MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Sơ lược ung thư dày 1.1.1 Dịch tễ học yếu tố nguy ung thư dày 1.1.2 Phân loại ung thư dày .5 1.1.3 Tiên lượng ung thư dày 1.2 Vị trí, cấu trúc gen protein MUC1 11 1.2.1 Vị trí gen .11 1.2.2 Cấu trúc gen biến thể 11 1.2.3 Protein mucin 12 1.3 Đa hình thái đơn nucleotid gen MUC .16 1.3.1 Đa hình thái đơn nucleotide 16 1.3.2 Đa hình thái đơn nucleotid gen MUC 17 1.4 Tình hình nghiên cứu SNP rs2070803 rs4072037 .18 1.5 Kỹ thuật PCR-RFLP 20 1.5.1 Phản ứng PCR .20 1.5.2 Enzym giới hạn 22 1.5.3 Kỹ thuật PCR-RFLP 23 1.6 Kỹ thuật giải trình tự gen 23 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Đối tượng nghiên cứu 25 2.1.1 Đối tượng 25 2.1.2 Cỡ mẫu thuận tiện .25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu .25 2.2.2 Kỹ thuật thu thập thông tin 25 2.2.3 Nội dung biến số nghiên cứu 25 2.2.4 Dụng cụ, trang thiết bị hóa chất nghiên cứu 26 2.2.5 Quy trình kỹ thuật .27 2.2.6 Quy trình cắt sản phẩm PCR enzym giới hạn .28 2.2.7 Quy trình điện di 30 2.2.8 Quy trình giải trình tự đoạn gen 31 2.2.9 Xử lý phân tích số liệu 32 2.3 Vấn đề đạo đức nghiên cứu .32 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33 3.1 Đặc điểm nhóm nghiên cứu 33 3.1.1 Đặc điểm nhóm bệnh 33 3.1.2 Đặc điểm tuổi nhóm 34 3.1.3 Đặc điểm giới nhóm 35 3.1.4 Đặc điểm sử dụng rượu nhóm 35 3.1.5 Đặc điểm sử dụng thuốc nhóm .35 3.1.6 Đặc điểm nhiễm HP nhóm .36 3.2 Đánh giá tính đa hình SNP rs2070803 rs4072037 gen MUC1 bệnh nhân ung thư dày 36 3.2.1 Kết tách chiết DNA 36 3.2.2 Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 1.5% 38 3.2.3 Kết kiểu gen vị trí rs2070803 rs4072037 39 3.3 Xác định tính nhạy cảm rs2070803 rs4072037 gen MUC1 bệnh nhân ung thư dày 47 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 51 4.1 Đặc điểm nhóm nghiên cứu 51 4.2 Đặc điểm đa hình rs2070803 rs4072037 gen MUC1 .53 4.3 Mối liên quan đa hình rs2070803 rs4072037 với số yếu tố nguy UTDD 62 4.4 Mối liên quan đa hình rs2070803 rs4072037 với số đặc điểm khác nhóm bệnh UTDD .64 KẾT LUẬN 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Phân loại mô bệnh học ung thư biểu mô dày Bảng 1.2 Hệ thống đánh giá giai đoạn ung thư dày 10 Bảng 1.3: Một số SNP MUC1 .17 Bảng 1.4: Mối liên quan ung thư dày SNP MUC1 20 Bảng 3.1: Đặc điểm tuổi, giới nhóm bệnh 33 Bảng 3.2: Một số đặc điểm khác nhóm bệnh 33 Bảng 3.3: Đặc điểm tuổi nhóm nghiên cứu .34 Bảng 3.4 Đặc điểm giới nhóm nghiên cứu .35 Bảng 3.5 Đặc điểm sử dụng rượu nhóm nghiên cứu 35 Bảng 3.6 Đặc điểm sử dụng thuốc nhóm nghiên cứu 35 Bảng 3.7 Đặc điểm giới nhóm nghiên cứu .36 Bảng 3.8 Một số kết đo nồng độ độ tinh DNA 37 Bảng 3.9: Tỷ lệ kiểu gen alen SNP rs2070803 gen MUC1 43 Bảng 3.10: Tỷ lệ kiểu gen alen SNP rs4072037 gen MUC1 .43 Bảng 3.11 Nguy mắc bệnh cặp kiểu gen alen rs2070803 44 Bảng 3.12 Nguy mắc bệnh cặp kiểu gen alen rs4072037 .45 Bảng 3.13 Nguy mắc bệnh người mang alen lành vị trí rs2070803 rs4072037 46 Bảng 3.14: Phân tích mối liên quan tính đa hình rs2070803 số yếu tố nguy UTDD 47 Bảng 3.15: Phân tích mối liên quan tính đa hình rs4072037 số yếu tố nguy UTDD 48 Bảng 3.16: Khảo sát tỷ lệ kiểu gen SNP rs2070803 với số đặc điểm nhóm bệnh 49 Bảng 3.17: Khảo sát tỷ lệ kiểu gen SNP rs4072037 với số đặc điểm nhóm bệnh 50 Bảng 4.1: Kết số nghiên cứu tương tự châu Á 58 Bảng 4.2: Tỷ lệ kiểu gen alen SNP rs4072037 theo nghiên cứu giới .59 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Tỷ lệ mắc UTDD chuẩn hóa theo tuổi giới .3 Hình 1.2: Vị trí tổn thương ung thư dày Hình 1.3: Phân loại hình ảnh đại thể theo Borrmann .8 Hình 1.4: Vị trí gen MUC1 11 Hình 1.5: Cấu trúc gen MUC1 biến thể 11 Hình 1.6: Cấu trúc protein MUC1, chia tách protease vùng nhận liên kết đuôi tế bào chất MUC1 13 Hình 1.7 Hình ảnh minh họa tượng SNP 17 Hình 1.8 Các giai đoạn phản ứng PCR 22 Hình 1.9 Các kiểu cắt enzym giới hạn 23 Hình 1.10: Nguyên lý kỹ thuật giải trình tự gen 24 Hình 2.1: Hình ảnh mơ điện di kiểu gen SNP rs2070803 sau cắt sản phẩm PCR enzym giới hạn 29 Hình 2.2: Hình ảnh mơ điện di kiểu gen SNP rs4072037 sau cắt sản phẩm PCR enzym giới hạn 30 Hình 3.1 Hình ảnh đo nồng độ độ tinh mẫu DNA phần mềm NanoDrop 2000 36 Hình 3.2: Điện di DNA tổng số gel agarose 0,8% 38 Hình 3.3: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen MUC1 chứa vị trí rs2070803 agarose 1,5% 38 Hình 3.4: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen MUC1 chứa vị trí rs4072037 agarose 1,5% 39 Hình 3.5: Hình ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn gen chứa vị trí rs2070803 enzym TaqαI số mẫu bệnh nhân UTDD 40 Hình 3.6: Hình ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn gen chứa vị trí rs4072037 enzym AlwNI số mẫu bệnh nhân UTDD 40 Hình 3.7: Kết giải trình tự sản phẩm PCR đoạn gen chứa SNP rs2070803 bệnh nhân mang kiểu gen AA, AG, GG 41 Hình 3.8: Kết giải trình tự sản phẩm PCR đoạn gen chứa SNP rs4072037 bệnh nhân mang kiểu gen AA, AG, GG 42 Hình 4.1: Nguy mắc UTDD người mang kiểu gen GG so với AA 60 Hình 4.2: Nguy mắc UTDD người mang alen G so với alen A 61 3,6,8,11,13,17,22,24,36,41,42 1-2,4,5,7,9-10,12,14-16,18-21,23,25-35,37-40,43- ... cơng bố đánh giá tỷ lệ mắc SNP đánh giá nhạy cảm vị trí gen MUC1 tới UTDD Do đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: Đánh giá tính đa hình rs2070803 rs4072037 gen MUC1 bệnh nhân ung thư dày ... định tính đa hình rs2070803 rs4072037 gen MUC1 bệnh nhân ung thư dày Xác định mối liên quan đa hình rs2070803 rs4072037 với số yếu tố nguy ung thư dày 3 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược ung. .. vảy Ung thư biểu mô tuyến dạng tế bào gan Ung thư biểu mô với chất lympho Ung thư biểu mô thai Sacôm ung thư biểu mô Ung thư biểu mô tuyến ống thể ung thư biểu mô dày thư ng gặp [22] Các bệnh nhân