BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VANHNASIN NAMMASAY GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 191.16 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VANHNASIN NAMMASAY Mã sinh viên: 1401411 GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 191.16 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PSG.TS Cao Văn Thu ThS Tạ Thu Lan Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh – Sinh học HÀ NỘI – 2019 LỜI CẢM ƠN Với biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo PGS.TS Cao Văn Thu, cô giáo ThS Tạ Thu Lan – người trực tiếp hướng dẫn bảo giúp đỡ tận tình để giúp tơi hồn thành khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo, cán kỹ thuật viên giảng dạy công tác mơn Vi sinh – Sinh học, Viện hóa học – Viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ q trình thực khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội dạy, giúp đỡ tơi q trình học tập trường Đồng thời gửi lời cảm ơn tới gia dình, bạn bè quan tâm, ủng hộ giúp đỡ tơi suốt thời gian thực khóa luận Do thời gian có hạn, điều kiện nghiên cứu trình độ thân hạn chế nên khơng thể tránh khỏi sai sót khóa luận Vì vậy, tơi mong nhận đóng góp ý kiến, bảo thầy để khóa luận hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2019 Sinh viên Vanhnasin Nammasay MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TÔNG QUAN 1.1 Đại cương kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh 1.1.2 Phân loại kháng sinh 1.1.3 Cơ chế tác dụng kháng sinh: 1.2 Đại cương xạ khuẩn 1.2.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn 1.2.2 Đặc điểm hình thái sinh lý xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces 1.2.3 Phân loại Streptomyces 1.3 Bảo quản cải tạo giống 1.3.1 Bảo quản giống xạ khuẩn 1.3.2 Phương pháp cải tạo giống 1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.4.1 Lên men bề mặt 1.4.2 Lên men chìm 1.4.3 Một số yếu tố ảnh hưởng trình lên men 1.5 Chiết tách tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 1.5.1 Vai trò cuả chiết tách tinh chế kháng sinh 1.5.2 Phương pháp chiết tách tinh chế kháng sinh 1.6 Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc kháng sinh 1.6.1 Phổ khối lượng (MS) 1.6.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 1.6.3 Phổ hồng ngoại (IR) 1.6.4 Phổ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis) 1.7 Nghiên cứu xạ khuẩn lồi Streptomyces vietnamensis sp.Nov, Streptomyces có sắc tố khếch tán màu xanh tím phân lập từ đất Việt Nam 10 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 Nguyên liệu, thiết bị 11 2.1.1 Chủng giống vi sinh vật 11 2.1.2 Các môi trường nuôi cấy 11 2.1.3 Dụng cụ, dung mơi hóa chất 13 2.2 Nội dung nghiên cứu 14 2.3 Phương pháp thực nghiệm 14 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy giữ giống ống thạch nghiêng 14 2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh phương pháp khuếch tán 14 2.3.3 Phương pháp cải tạo chọn giống 15 2.3.4 Phương pháp lên men chìm tổng hợp kháng sinh 17 2.3.5 Phương pháp tách kháng sinh sắc ký 17 2.3.6 Phương pháp kết tinh kháng sinh 18 2.3.7 Sơ xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu 18 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 19 3.1 Kết cải tạo giống 19 3.1.1 Kết sàng lọc ngẫu nhiên 19 3.1.2 Kết đột biến 20 3.2 Kết lên men chìm sinh tổng hợp kháng sinh 22 3.2.1 Chọn mơi trường lên men chìm tốt 22 3.2.2 Chọn dạng chủng, biến chủng lên men tốt 23 3.3 Kết tinh chế kháng sinh 24 3.3.1 Kết tách kháng sinh sắc ký lớp mỏng 24 3.3.2 Kết chạy sắc ký cột lần 25 3.3.3 Kết chạy sắc ký cột lần 26 3.3.4 Kết chạy sắc ký cột lần 27 3.3.5 Kết trình tinh chế kháng sinh 28 3.4 Kết sơ xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu 29 3.4.1 Phổ khối lượng (MS) 29 3.4.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 29 3.4.3 Phổ tử ngoại – khả kiến 29 3.4.4 Phổ hồng ngoại 30 3.9 Bàn luận 31 3.9.1 Chọn lọc cải tạo giống 31 3.9.2 Chiết tách, cất quay, tinh chế kháng sinh tinh khiết 31 3.9.3: Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIÊU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 16S rADN 16S ribosomal Acid 2’-deoxyribonucleic COSY Corelation Spectroscopy – Phổ NMR tương quan Đường kính trung bình DMHC Dung mơi hữu DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer dNTP deoxynucliotide triphosphate ddNTP dideoxynucliotide triphosphate ĐBHH Đột biến hóa học Gr (-) Gram âm Gr (+) Gram dương HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coleration – Phổ tương quan đa liên kết dị nhân HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence – Phổ kết hợp lượng tử đơn dị nhân HTKS Hoạt tính kháng sinh IR Infra Red – Phổ hồng ngoại ISP International Streptomyces Project (Chương trình Streptomyces quốc tế) KS Kháng sinh MS Mass spectrometry – Phổ khối MT Môi trường MTdt Môi trường dịch thể NMR Nuclear Magnetic Resonance – Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NXB Nhà xuất PCR Polymerase Chain Reaction – Phản ứng khuếch đại gen S Sai số chuẩn có hiệu chỉnh SKLM Sắc ký lớp mỏng SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên SSC Saline-sodium citrate – Dung dịch đệm muối citrat UV-Vis Ultraviolet–visible: Phổ tử ngoại – khả kiến VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Các vi sinh vật kiểm định Bảng 2.2: Thành phần môi trường nuôi cấy xạ khuẩn Bảng 2.3: Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định Bảng 3.1: Kết thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên Bảng 3.2: Kết thử HTKS đột biến lần Bảng 3.3: Kết thử HTKS đột biến lần Bảng 3.4: Kết thử HTKS chọn môi trường lên men Bảng 3.5: Kết thử HTKS chọn dạng, biến chủng lên men Bảng 3.6: Kết tách kháng sinh dịch chiết SKLM Bảng 3.7: Kết thử hoạt tính phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần Bảng 3.8: Kết thử hoạt tính phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần Bảng 3.9: Kết sắc ký lớp mỏng phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần Bảng 3.10: Kết thử hoạt tính phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần Bảng 3.11: Kết sắc ký lớp mỏng phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần Bảng 3.12: Kết phổ IR KS1 Bảng 3.13: Kết phổ IR KS2 Bảng PB.1: Các dung môi sử dụng Bảng PB.2: Các hóa chất sử dụng Bảng PB.3: Kết thử hoạt tính kháng sinh sàng lọc ngẫu nhiên DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình PH.1: Thử hoạt tính kháng sinh phương pháp khối thạch Hình PH.2: Thử hoạt tính kháng sinh phương pháp giếng thạch Hình PH.3: Thử hoạt tính kháng sinh phương pháp khoanh giấy Hình PH.4: Lên men chìm Hình PH.5: Hình ảnh chạy sắc ký cột Hình PH.6: Phổ khối lượng kháng sinh KS1 Hình PH.7: Phổ khối lượng kháng sinh KS2 Hình PH.8: Phổ 13C-NMR KS1 Hình PH.9: Phổ 1H-NMR KS2 Hình PH.10: Phổ DPET KS2 Hình PH.11: Phổ UV – VIS KS1 Hình PH.12 Phổ UV – VIS KS2 Hình PH.13: Phổ IR KS1 Hình PH.14: Phổ IR KS2 16 Wenjuan Zhang, Saijian Ma, et al (2017), "Antibacterial Activity and Composition of the Fermentation Broth of Streptomyces Parvus 33 ", Jundishapur J Microbiol 17 Zhu H H., Guo J., et al (2007), "Streptomyces vietnamensis sp nov., a streptomycete with violet blue diffusible pigment isolated from soil in Vietnam", Int J Syst Evol Microbiol, 57(Pt 8), pp 1770-4 35 PHỤ LỤC Hình PH.1: Thử hoạt tính kháng sinh phương pháp khối thạch Hình PH.2: Thử hoạt tính kháng sinh phương pháp giếng thạch PL.1 Hình PH.3: Thử hoạt tính kháng sinh phương pháp khoanh giấy Hình PH.4: Lên men chìm PL.2 Hình PH.5: Hình ảnh chạy sắc ký cột PL.3 Hình PH.6: Phổ khối lượng kháng sinh KS1 PL.4 Hình PH.7: Phổ khối lượng kháng sinh KS2 PL.5 Hình PH.8: Phổ 13C-NMR KS1 PL.6 Hình PH.9: Phổ 1H-NMR KS1 PL.7 Hình PH.10: Phổ DPET KS1 PL.8 Hình PH.11: Phổ UV – VIS KS1 PL.9 Hình PH.12 Phổ UV – VIS KS2 PL.10 %T 100 99 98 97 3452.27cm-1 3500 2965.22cm-1 3000 2500 cm-1 1739.86cm-1 2000 1402.92 1367.88 1485.42cm-1 1582.44cm-1 1647.58cm-1 1500 872.99 636.50 737.23 1097.71cm-1 1193.15cm-1 1266.88cm-1 1000 523.49cm-1 500 400 PL.11 96 95 94 93 92 91 90 89 88 87 4000 Hình PH.13: Phổ IR KS1 %T 100 100 98 96 3500 3058.39 3272.99 3441.42cm-1 3000 2883.21 2965.15cm-1 2500 1744.99cm -1 2000 1665.36cm-1 cm-1 1363.50 697.81 872.99 943.07 982.48 1193.42cm-1 1095.92cm-1 1000 1299.18cm-1 1484.77cm-1 1582.60cm-1 1500 638.18cm-1 518.25 500 400 461.31 PL.12 94 92 90 88 86 84 82 80 4000 Hình PH.14: Phổ IR KS2 Bảng PB.1: Các dung môi sử dụng Dung môi Xuất xứ Khối lượng riêng Nhiệt độ sôi (oC) (g/ml) Methanol Trung Quốc 0,791-0,793 64,5 Đức 0,894 70,4 Việt Nam 0,789-0,791 78,3 Chloroform Trung Quốc 1,47-1,48 60-62 n-butanol Trung Quốc 0,81 116-118 Aceton Trung Quốc 0,79 56 Triethylamin Trung Quốc 0,726-0,728 89,5 Amoniac 25% Đức 0,88 37,7 Diethylformamide Đức 0,946-0,95 153 n-Butylacetate Trung Quốc 0,88-0,885 117-118 n-Propanol Trung Quốc 0,803 97,1 Dicloromethan Trung Quốc 1,33 39,6 Đức 0,6548 69 Ethylacetate Ethanol n-Hexan PL.13 Bảng PB.2: Các hóa chất sử dụng Hóa chất Tinh bột Xuất xứ Việt Nam Đóng gói Lọ 500g Hóa chất Cao nấm Xuất xứ Đóng gói Đức Lọ 500g men Lactose Trung Quốc Lọ 500g Thạch Việt Nam Gói 50g Glucose Trung Quốc Lọ 500g Trypton Trung Quốc Lọ 500g Saccarose Việt Nam Lọ 500g Dịch chiết Tây Ban Nha Lọ 100g Malt Bột đậu tương Việt Nam Lọ 500g (NH4)2SO4 Đức Lọ lít Bột ngơ Việt Nam Lọ 500g L-Asparagin Đức Lọ 100g Pepton Trung Quốc Lọ 500g Glycerin Trung Quốc Lọ 500ml Cao thịt Đức Lọ 500g L-Tyrosin Nhật Bản Lọ 10g KNO3 Trung Quốc Lọ 500g MnCl2.4H2O Trung Quốc Lọ 500g KCl Trung Quốc Lọ 500g CuSO4.5H2O Trung Quốc Lọ 500g NaNO3 Trung Quốc Lọ 500g ZnSO4.7H2O Trung Quốc Lọ 500g NH4NO3 Trung Quốc Lọ 500g Na2S2O3 Trung Quốc Lọ 500ml CaCO3 Trung Quốc Lọ 500g D-xylose Anh Lọ 25g FeSO4.7H2O Trung Quốc Lọ 500g D-fructose Đức Lọ 250g K2HPO4 Trung Quốc Lọ 500g Bột mỳ Việt Nam Lọ 1kg MgSO4.7H2O Trung Quốc Lọ 500g HCl 0,1N Trung quốc Lọ 500ml NaCl Trung Quốc Lọ 500g NaOH 0,1N Trung Quốc Lọ 500ml PL.14 ... nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 191.16 với mục tiêu sau: ♦ chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh ♦ Lên men, chiết tách, tinh chế để thu kháng. .. 1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.4.1 Lên men bề mặt 1.4.2 Lên men chìm 1.4.3 Một số yếu tố ảnh hưởng trình lên men 1.5 Chiết tách tinh chế kháng sinh. .. Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VANHNASIN NAMMASAY Mã sinh viên: 1401411 GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 191.16 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PSG.TS