BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI -  - NGUYỄN THỊ LY XÂY DỰNG MƠ HÌNH MÁY TÍNH MƠ PHỎNG MẠNG LƯỚI TRAO ĐỔI CHẤT SINH TỔNG HỢP VITAMIN B12 CỦA VI KHUẨN PSEUDOMONAS DENITRIFICANS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI -  - NGUYỄN THỊ LY Mã sinh viên: 1401390 XÂY DỰNG MƠ HÌNH MÁY TÍNH MƠ PHỎNG MẠNG LƯỚI TRAO ĐỔI CHẤT SINH TỔNG HỢP VITAMIN B12 CỦA VI KHUẨN PSEUDOMONAS DENITRIFICANS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS ĐỖ NGỌC QUANG Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh Sinh học HÀ NỘI - 2019 HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp trước tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Đỗ Ngọc Quang người thầy tận tình bảo, giúp đỡ tạo điều kiện tốt để em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Sự đam mê, nhiệt huyết lòng yêu nghề thầy truyền động lực để em phấn đấu cống hiến Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô môn Vi sinh Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ để em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin trân trọng cảm ơn thầy cô cán Trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ, quan tâm em suốt năm học tập trường Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè người bên cạnh, động viên em cố gắng để hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Do trình độ hạn chế nên báo cáo khóa luận tốt nghiệp em tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận ý kiến đóng góp thầy, để em hồn thành tốt báo cáo tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2019 Sinh viên Nguyễn Thị Ly MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm sinh học trình sinh tổng hợp vitamin B12 Pseudomonas denitrificans 1.1.1 Đặc điểm sinh học Pseudomonas denitrificans 1.1.2 Quá trình sinh tổng hợp vitamin B12 Pseudomonas denitrificans 1.1.2.1 Giới thiệu vitamin B12 1.1.2.2 Con đường sinh tổng hợp vitamin B12 Pseudomonas denitrificans 1.2 Mơ hình hóa q trình trao đổi chất 1.2.1 Nguyên lý trình trao đổi chất 1.2.1.1 Quá trình trao đổi chất 1.2.1.2 Con đường trao đổi chất 1.2.1.3 Năng lượng cần thiết cho đường trao đổi chất hoạt động 1.2.2 Biểu diễn trình trao đổi chất dạng mơ hình tốn học 1.2.3 Sử dụng COBRA để xây dựng mô hình trao đổi chất 1.2.3.1 Constraint-based modeling (CMB) 1.2.3.2 COBRA 1.2.4 Phân tích cân thơng lượng mơ hình trao đổi chất 11 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Nguyên vật liệu 13 2.2 Nội dung nghiên cứu 13 2.2.1 Xây dựng mơ hình 13 2.2.2 Đánh giá độ tin cậy mơ hình 134 2.3 Phương pháp nghiên cứu……………………………………………………….14 2.3.1 Xây dựng sở liệu…………………………………………………… 14 2.3.1.1 Cơ sở liệu KEGG_PD 14 2.3.1.2 Cơ sở liệu KEGG_RXN KEGG_MET 15 2.3.2 Xây dựng mơ hình 15 2.3.2.1 Tạo chất trao đổi 16 2.3.2.2 Tạo phản ứng 17 2.3.2.3 Tạo mơ hình 18 2.3.3 Phân tích thơng lượng mơ hình 19 2.3.4 Mô hoạt động mơ hình điều kiện mơi trường khác 20 Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1 Xây dựng mơ hình 22 3.1.1 Thu thập liệu từ KEGG 22 3.1.2 Xây dựng mơ hình trao đổi chất sơ Pseudomonas denitrificans ATCC 13867 23 3.1.3 Hoàn thiện mơ hình 24 3.1.3.1 Bổ sung phản ứng thiếu 24 3.1.3.2 Tạo phản ứng nối chất chuyển hóa 26 3.1.3.3 Điều chỉnh chiều phản ứng 27 3.1.3.4 Tạo phản ứng trao đổi với môi trường 29 3.1.3.5 Tạo chuỗi phản ứng hô hấp sinh ATP 30 3.1.3.6 Tạo phản ứng sinh khối 31 3.2 Đánh giá độ tin cậy mô hình 32 3.2.1 Khả tạo sinh khối điều kiện có khơng có oxy 32 3.2.2 Khả tạo sinh khối từ nguồn carbon khác 35 3.2.3 Khả sinh tổng hợp vitamin B12 từ nguồn carbon khác 36 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng glutamat cobinamid đến sinh tổng hợp vitamin B12 37 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39 4.1 Kết luận 39 4.2 Đề xuất 39 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt AdoCbl Adenosylcobalamin Adenosylcobalamin ADN Deoxyribonucleic acid Acid deoxyribonucleic ADP Adenosin diphosphate Adenosin diphosphat ALA δ-aminolevulinic acid Acid δ-aminolevulinic ARN Ribonucleic acid Acid ribonucleic ATCC American Type Culture Tập hợp chủng vi sinh Collection vật Mỹ ATP Adenosin triphosphate Adenosin triphosphat CBM constraint-based model Mơ hình dựa giới hạn CNCbl cyanocobalamin cyanocobalamin COBRA constraint-based reconstruction Sự xây dựng lại phân tích and analysis dựa giới hạn Constraints-Based Sự xây dựng lại phân tích Reconstruction and Analysis dựa vào giới hạn sử for Python dụng lập trình Python DMBI 5,6-dimethylbenzimidazole 5,6-dimethylbenzimidazol FBA Flux balance analysis Phân tích cân thơng COBRApy lượng KEGG NADH NCBI Kyoto Encyclopedia of Genes Bách khoa toàn thư Kyoto and Genomes gen gen Nicotinamide adenine Nicotinamid adenin dinucleotide dinucleotid National Center for Trung tâm thông tin công Biotechnology Information nghệ sinh học quốc gia DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Các tham số phản ứng chuyển hóa N-acetyl-L-glutamat-5-semialdehyd thành N-acetylornithin (R002283) 26 Bảng 3.2: Tham số giới hạn số phản ứng đường trao đổi chất P denitrificans ATCC 13867 29 Bảng 3.3: Tham số số phản ứng trao đổi với môi trường P denitrificans ATCC 13867 29 Bảng 3.4: Tỷ lệ thành phần sinh khối P putida KT2440 31 Bảng 3.5: Thành phần mơi trường mơ hình PD13867 32 Bảng 3.6: So sánh thông lượng tạo sinh khối (mmol/gDW/h) mơ hình: PD13867 (P denitrificans ATCC 13867), iJN746 (P puttida KT2440) iECW_1372 (E coli W) điều kiện môi trường nuôi cấy tương tự 34 Bảng 3.7: Kết sinh khối tạo mơ hình từ nguồn carbon (glucose, sucrose maltose) điều kiện có oxy 36 Bảng 3.8: So sánh thông lượng sinh tổng hợp vitamin B12 từ nguồn carbon so với hiệu suất thực nghiệm 37 Bảng 3.9: Thông lượng tạo sinh khối môi trường ban đầu môi trường bổ sung L-glutamat cobinamid 38 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Các đường sinh tổng hợp Adenosylcobalamin Pseudomonas denitrificans Hình 1.2: Ma trận cân hóa học Hình 1.3: Các giai đoạn q trình xây dựng mơ hình trao đổi chất phương pháp Constraint-based modeling 11 Hình 1.4: Q trình phân tích cân thơng lượng 12 Hình 3.1: Dữ liệu thông tin đường trao đổi chất Glycolysis (pdr00010) nằm sở liệu KEGG_PD Pseudomonas denitrificans ATCC 13867………………………………………………………………………………… 23 Hình 3.2: Ma trận hai phản ứng trao đổi chất lấy từ chu trình citrat (pdr00020) P denitrificans ATCC 13867 244 Hình 3.3: Phản ứng thiếu đường sinh tổng hợp arginin P denitrificans ATCC 13867 …5 Hình 3.4: (A) Phản ứng thiếu đường sinh tổng hợp leucin (pdr00290) P denitrificans ATCC 13867 277 Hình 3.5: Đổi chiều phản ứng tạo pyruvat từ phosphoenol-pyruvat (R00200) đường đường phân…………………………………………………………………… 28 Hình 3.6: Con đường phosphoryl oxy hóa (pdr00190) Pseudomonas denitrificans ATCC 13867 31 Hình 3.7: Thơng lượng tối ưu phản ứng bio1 điều kiện có khơng có oxy mơ hình PD13867 33 Hình 3.8: Thơng lượng phản ứng kết thúc chuỗi phosphoryl oxy hóa điều kiện có oxy mơ hình PD13867 34 Hình 3.9: Thơng lượng phản ứng kết thúc chuỗi phosphoryl oxy hóa điều kiện khơng có oxy mơ hình PD13867 35 Hình 3.10: Thông lượng sinh khối tạo điều kiện oxy khơng có hơ hấp khử nitrat mơ hình PD13867 35 Hình 3.11: Q trình chuyển hóa tạo vitamin B12 từ ba nguồn carbon: glucose, sucrose, maltose P denitrificans ATCC 13867 37 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong điều kiện phát triển cơng nghệ thơng tin nay, mơ hình mô trở thành công cụ hiệu để nghiên cứu hệ thống sinh học trình trao đổi chất Mơ hình mơ cung cấp tảng để trực quan hóa phân tích liệu gen chức gen, protein chức protein liệu chuyển hóa Từ đó, cho phép nghiên cứu mối tương quan phản ứng mạng lưới trao đổi chất ảnh hưởng yếu tố dinh dưỡng, độc tố, di truyền, … lên phản ứng trao đổi chất sinh vật [7] Vitamin B12 vitamin thiết yếu sử dụng rộng khắp y khoa công nghiệp thực phẩm [5] Do cấu trúc phức tạp, vitamin B12 chủ yếu sản xuất vi sinh vật Pseudomonas denitrificans vi sinh vật sử dụng rộng rãi để sản xuất vitamin B12 quy mô cơng nghiệp [28] Q trình trao đổi chất P denitrificans cải biến theo nhiều hướng khác nhằm gia tăng hiệu suất sinh tổng hợp vitamin B12 [5] Việc sử dụng mơ hình trao đổi chất mơ giúp thu ngắn q trình sàng lọc đối tượng cho nghiên cứu thực nghiệm Tuy nhiên, chưa có mơ hình trao đổi chất P denitrificans cơng bố Để góp phần tạo thêm cơng cụ cho nghiên cứu trao đổi chất P denitrificans định thực đề tài nghiên cứu: “Xây dựng mơ hình máy tính mơ mạng lưới trao đổi chất sinh tổng hợp vitamin B12 vi khuẩn Pseudomonas denitrificans” Mục tiêu đề tài bước đầu xây dựng mơ hình trao đổi chất mơ P denitrificans đạt độ tin cậy để phục vụ cho nghiên cứu Chương TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm sinh học trình sinh tổng hợp vitamin B12 Pseudomonas denitrificans 1.1.1 Đặc điểm sinh học Pseudomonas denitrificans Pseudomonas denitrificans, loại vi khuẩn kị khí tùy tiện gram âm, có khả thực hơ hấp khử nitrat có khả sinh tổng hợp vitamin B12 điều kiện hiếu khí [1],[5] Pseudomonas denitrificans ATCC 13967 chủng hay sử dụng nghiên cứu công nghiệp sinh tổng hợp vitamin B12 Kích thước gen Pseudomonas denitrificans ATCC 13867 5696307 bp với 65,2% hàm lượng G+C Bộ gen P.denitrificans ATCC 13867 có 2567 operon 5059 gen mã hóa protein Trong số 5059 protein, 3013 protein (chiếm 59,56%) dự kiến nằm tế bào chất, 982 protein (19,4%) nằm màng Vị trí lại 1045 protein (21,02%) chưa xác định Bộ gen P denitrificans ATCC 13867 chứa đầy đủ gen mã hóa cho 26 enzym cần thiết để tổng hợp coenzym B12 có oxy Các gen phân bố hai nhóm khác nhiễm sắc thể [1] 1.1.2 Quá trình sinh tổng hợp vitamin B12 Pseudomonas denitrificans 1.1.2.1 Giới thiệu vitamin B12 Vitamin B12 hay gọi cyanocobalamin phân tử sinh học phức tạp Các dạng sinh học vitamin B12 bao gồm adenosylcobalamin, hydroxocobalamin methylcobalamin Vitamin B12 yếu tố tăng trưởng quan trọng vi sinh vật động vật Vitamin B12 phát lần vào năm 1926 gọi “yếu tố chống lại thiếu máu nguy hiểm” [15],[19] Phân tử vitamin B12 gồm ba phần: vòng Corrin trung tâm chứa bốn phối tử với ion coban trung tâm, phối tử (alpha) thấp cho DMBI (5,6dimethylbenzimidazol) phối tử (beta) tạo từ nhóm adenosyl nhóm methyl Các sản phẩm cuối tạo tự nhiên từ sinh tổng hợp vitamin B12 5′-deoxyadenosylcobalamin (coenzym B12), methylcobalamin hydroxocobalamin Dạng vitamin B12 chủ yếu sản xuất công nghiệp trao đổi chất P denitrificans có khả thực hô hấp khử nitrat: khử NO2thành N2, đặc biệt khơng có O2 [25] Hình 3.9: Thông lượng phản ứng kết thúc chuỗi phosphoryl oxy hóa điều kiện khơng có oxy mơ hình PD13867 Khi loại bỏ phản ứng khử , thơng lượng tạo sinh khối điều kiện khơng có O2 giảm xuống 0.573 (mmol/gDW/h) (hình 3.10) Như vậy, hoạt động mơ hình PD13867 điều kiện hiếu khí kỵ khí tương tự biết qua thực nghiệm, P denitrificans có khả hơ hấp nitrat điều kiện kỵ khí [25] Hình 3.10: Thơng lượng sinh khối tạo điều kiện khơng có oxy khơng có hơ hấp khử nitrat mơ hình PD13867 3.2.2 Khả tạo sinh khối từ nguồn carbon khác Chúng tiến hành khảo sát khả tạo sinh khối mơ hình từ nguồn carbon là: glucose, sucrose, maltose, đó, ngoại trừ nguồn carbon, tham số môi trường tối ưu hóa thiết lập giống thí nghiệm trước Kết cho thấy tốc độ gia tăng sinh khối (thông lượng tạo bio1) mơ hình tốt với nguồn carbon sucrose, sau đến maltose tốc độ gia tăng sinh khối sử dụng nguồn carbon 35 glucose (2,24 > 2,21 > 1,92) Kết phù hợp với số liệu thực nghiệm Li cộng cho kết hiệu suất tạo sinh khối tốt với sucrose, sau đến maltose cuối glucose ( 12,66 > 12,27 > 10,43)[13] (bảng 3.7) Bảng 3.7: Kết sinh khối tạo mơ hình từ nguồn carbon (glucose, sucrose maltose) điều kiện có oxy Nguồn carbon Thông lượng tạo Hiệu suất tạo sinh bio1(mmol/gDW/h) khối thực nghiệm (g/l) Glucose 1,92 10,43 ± 0,15 Sucrose 2,24 12,66 ± 0,17 Maltose 2,21 12,27 ± 0,19 3.2.3 Khả sinh tổng hợp vitamin B12 từ nguồn carbon khác Tương tự, tiến hành khảo sát khả sinh tổng hợp vitamin B12 mơ hình PD13867 từ ba nguồn carbon glucose, sucrose, maltose Quá trình chuyển hóa ba nguồn carbon có chung trình sinh tổng hợp vitamin B12 từ pyruvat (hình 3.11) Kết khảo sát cho thấy thơng lượng sinh tổng hợp vitamin B12 mơ hình cao sucrose, sau đến maltose glucose (1,87 >1,73 > 1,49) Kết tương đồng với số liệu thực nghiệm Li cộng công bố cho kết hiệu suất sinh tổng hợp vitamin B12 cao với sucrose, sau đến maltose cuối glucose ( 7,6 >7,45 >4,93) (bảng 3.8) [13] Cũng tương tự Li cộng sự, mô hình PD13867 khơng sinh tổng hợp vitamin B12 điều kiện kỵ khí 36 Hình 3.11: Q trình chuyển hóa tạo vitamin B12 từ ba nguồn carbon: glucose, sucrose, maltose P denitrificans ATCC 13867 Bảng 3.8: So sánh thông lượng sinh tổng hợp vitamin B12 từ nguồn carbon so với hiệu suất thực nghiệm [13] Nguồn carbon Thông lượng sinh tổng hợp Hiệu suất sinh tổng hợp vitamin Vitamin B12 (mmol/gDW/h) B12 thực nghiệm (mg/l) Glucose 1,49 4,93 ± 0,16 Sucrose 1,87 7,60 ± 0,11 Maltose 1,73 7,45 ± 0,12 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng glutamat cobinamid đến sinh tổng hợp vitamin B12 Chúng tiến hành bổ sung glutamat cobinamid cho mơ hình PD13867 để khảo sát ảnh hưởng hai chất đến khả sinh tổng hợp vitamin B12 Theo hai nghiên cứu Li Fang với cộng sự, cung cấp glutamat cobinamid, P denitrificans rút ngăn đáng kể thời gian lượng ATP tiêu thụ cho gia tăng sinh khối sinh tổng hợp vitamin B12 [13][5] Kết cho thấy việc bổ 37 sung glutamat hay cobinamid dẫn đến gia tăng thông lượng tạo sinh khối vitamin B12 (bảng 3.9 ) Bảng 3.9: Thông lượng tạo sinh khối môi trường ban đầu môi trường bổ sung Lglutamat cobinamid Thông lượng tạo bio1 Môi trường (mmol/gDW/h) Thông lượng tạo Vitamin B12 (mmol/gDW/h) Khơng có L-glutamat 2.24 1.87 Có L-glutamat 3.02 2.27 Có cobinamid 2.25 8.26 Có L-glutamat cobinamid 3.02 9.6 cobinamid 38 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận Sau thực đề tài, thu kết sau: - Xây dựng mơ hình máy tính mơ mạng lưới trao đổi chất Pseudomonas denitrificans ATCC 13867 - Mơ q trình tạo sinh khối mơ hình cho thấy sinh khối tạo nhiều với sucrose, sau đến maltose với glucose - Mơ q trình sinh tổng hợp vitamin B12 từ sucrose, maltose, glucose cho thấy vitamin B12 tạo nhiều với sucrose, sau đến maltose tạo sử dụng glucose - Mơ hình cho khả sinh tổng hợp vitamin B12 tốt bổ sung glutamat cobinamid 4.2 Đề xuất Từ kết nghiên cứu xin đưa số đề xuất sau: - Tiếp tục sử dụng công cụ sở liệu để tinh chỉnh làm tăng tính xác mơ hình - Sử dụng mơ hình để khảo sát yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới sinh tổng hợp vitamin B12 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Ainala Satish Kumar, Somasundar Ashok, et al (2013), "Complete Genome Sequence of Pseudomonas denitrificans ATCC 13867", Genome Announcements, 1(3), pp e00257-13 Alberts B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., & Walter, P (2002), Molecular Biology of the Cell 4th edition, Garland Science, New York Caspi Ron, Altman Tomer, et al (2009), "The MetaCyc database of metabolic pathways and enzymes and the BioCyc collection of pathway/genome databases", Nucleic acids research, 38(suppl_1), pp D473-D479 Edwards Jeremy S., Ibarra Rafael U., et al (2001), "In silico predictions of Escherichia coli metabolic capabilities are consistent with experimental data", Nature biotechnology, 19(2), pp 125-130 Fang H., Kang J., et al (2017), "Microbial production of vitamin B12: a review and future perspectives", Microb Cell Fact, 16(1), pp 15 Fell David, R Small J (1986), "Fat synthesis in adipose tissue An examination of stoichiometric constraints", Biochemical Journal, 238(3), pp 781-786 Francke Christof, Siezen Roland J., et al (2005), "Reconstructing the metabolic network of a bacterium from its genome", Trends in Microbiology, 13(11), pp 550558 Henry Christopher S., Zinner Jenifer F., et al (2009), "iBsu1103: a new genomescale metabolic model of Bacillus subtilisbased on SEED annotations", Genome Biology, 10(6), pp R69 Kanehisa Minoru, Goto Susumu (2000), "KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes", Nucleic acids research, 28(1), pp 27-30 10 King Zachary A., Lu Justin, et al (2015), "BiGG Models: A platform for integrating, standardizing and sharing genome-scale models", Nucleic acids research, 44(D1), pp D515-D522 11 Kremling A (2013), Systems biology: mathematical modeling and model analysis, CRC Press 12 Levering J., Fiedler, T., Sieg, A., van Grinsven, K W., Hering, S., Veith, N., & Kreikemeyer, B (2016), "Genome-scale reconstruction of the Streptococcus pyogenes M49 metabolic network reveals growth requirements and indicates potential drug targets", Journal of biotechnology, 232, pp 25-37 13 Li Kun-tai, Peng Wei-fu, et al (2013), "Establishment of beet molasses as the fermentation substrate for industrial vitamin B12 production by Pseudomonas denitrificans", Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 88(9), pp 17301735 14 Majewski R A., & Domach, M M (1990), "Simple constrained‐optimization view of acetate overflow in E coli", Biotechnology and bioengineering, 35(7), pp 732-738 15 Martens J H., Barg H., et al (2002), "Microbial production of vitamin B12", Appl Microbiol Biotechnol, 58(3), pp 275-85 16 Orth J D., Thiele I., et al (2010), "What is flux balance analysis?", Nat Biotechnol, 28(3), pp 245-8 17 Palsson Bernhard Ø (2015), Systems Biology_ Constraint-Based Reconstruction and Analysis- Cambridge University, pp 18 Raman Karthik, Chandra Nagasuma (2009), "Flux balance analysis of biological systems: applications and challenges", Briefings in bioinformatics, 10(4), pp 435-449 19 Randaccio L., Geremia S., et al (2010), "Vitamin B12: unique metalorganic compounds and the most complex vitamins", Molecules, 15(5), pp 3228-59 20 Samal A (2012), Introduction to Flux Balance Analysis (FBA) and related methods for studying metabolic genotype-phenotype relationships, in International Conference on Mathematical and Theoretical Biology, Pune, India 21 Schomburg Ida, Chang Antje, et al (2004), "BRENDA, the enzyme database: updates and major new developments", Nucleic acids research, 32(suppl_1), pp D431-D433 22 Stabler Sally P (2013), "Vitamin B12 Deficiency", New England Journal of Medicine, 368(2), pp 149-160 23 Takahashi-Iđiguez Tóshiko, García-Hernandez Enrique, et al (2012), "Role of vitamin B 12 on methylmalonyl-CoA mutase activity", Journal of Zhejiang University Science B, 13(6), pp 423-437 24 Thiele Ines, Palsson Bernhard Ø (2010), "A protocol for generating a high-quality genome-scale metabolic reconstruction", Nature Protocols, 5(1), pp 93 25 Ts Parvanova-Mancheva V Beschkov (2009), "Microbial denitrification by immobilized bacteria Pseudomonas denitrificans stimulated by constant electric field", Biochemical Engineering Journal, 44(2-3), pp 208-213 26 van Duuren Jozef B J H., Puchałka Jacek, et al (2013), "Reconciling in vivo and in silico key biological parameters of Pseudomonas putida KT2440 during growth on glucose under carbon-limited condition", BMC Biotechnology, 13(1), pp 93 27 Vinay-Lara E., Hamilton J J., et al (2014), "Genome-scale reconstruction of metabolic networks of Lactobacillus casei ATCC 334 and 12A", PLoS One, 9(11), pp e110785 28 Xia W., Chen W., et al (2015), "Industrial vitamin B12 production by Pseudomonas denitrificans using maltose syrup and corn steep liquor as the costeffective fermentation substrates", Bioprocess Biosyst Eng, 38(6), pp 1065-73 PHỤ LỤC Phụ lục đường trao đổi chất Pseudomonas denitrificans lưu địa chỉ: https://www.genome.jp/dbget-bin/get_linkdb?-t+pathway+gn:T02524 : Mã Con đường trao đổi chất -pdr00010 Glycolysis / Gluconeogenesis - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00020 Citrate cycle (TCA cycle) - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00030 Pentose phosphate pathway - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00040 Pentose and glucuronate interconversions - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00051 Fructose and mannose metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00052 Galactose metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00053 Ascorbate and aldarate metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00061 Fatty acid biosynthesis - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00071 Fatty acid degradation - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00072 Synthesis and degradation of ketone bodies - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00130 Ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis – Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00190 Oxidative phosphorylation - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00220 Arginine biosynthesis - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00230 Purine metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00240 Pyrimidine metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00250 Alanine, aspartate and glutamate metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00260 Glycine, serine and threonine metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00261 Monobactam biosynthesis - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00270 Cysteine and methionine metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00280 Valine, leucine and isoleucine degradation - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00281 Geraniol degradation - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00290 Valine, leucine and isoleucine biosynthesis - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00300 Lysine biosynthesis - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00310 Lysine degradation - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00330 Arginine and proline metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00332 Carbapenem biosynthesis - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00340 Histidine metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00350 Tyrosine metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00360 Phenylalanine metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00361 Chlorocyclohexane and chlorobenzene degradation - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00362 Benzoate degradation - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00364 Fluorobenzoate degradation - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00380 Tryptophan metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00400 pdr00401 pdr00410 pdr00430 pdr00440 pdr00450 pdr00460 pdr00471 ATCC pdr00472 pdr00473 pdr00480 pdr00500 pdr00520 pdr00521 pdr00523 pdr00525 pdr00540 pdr00550 pdr00561 pdr00562 pdr00564 pdr00590 pdr00592 pdr00620 pdr00621 pdr00622 pdr00623 pdr00625 pdr00626 pdr00627 pdr00630 pdr00640 pdr00643 pdr00650 pdr00660 pdr00670 Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis – Pseudomonas sp ATCC 13867 Novobiocin biosynthesis - Pseudomonas sp ATCC 13867 beta-Alanine metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 Taurine and hypotaurine metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 Phosphonate and phosphinate metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 Selenocompound metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 Cyanoamino acid metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 D-Glutamine and D-glutamate metabolism - Pseudomonas sp 13867 D-Arginine and D-ornithine metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 D-Alanine metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 Glutathione metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 Starch and sucrose metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 Amino sugar and nucleotide sugar metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 Streptomycin biosynthesis - Pseudomonas sp ATCC 13867 Polyketide sugar unit biosynthesis - Pseudomonas sp ATCC 13867 Acarbose and validamycin biosynthesis - Pseudomonas sp ATCC 13867 Lipopolysaccharide biosynthesis - Pseudomonas sp ATCC 13867 Peptidoglycan biosynthesis - Pseudomonas sp ATCC 13867 Glycerolipid metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 Inositol phosphate metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 Glycerophospholipid metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 Arachidonic acid metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 alpha-Linolenic acid metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 Pyruvate metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 Dioxin degradation - Pseudomonas sp ATCC 13867 Xylene degradation - Pseudomonas sp ATCC 13867 Toluene degradation - Pseudomonas sp ATCC 13867 Chloroalkane and chloroalkene degradation - Pseudomonas sp ATCC 13867 Naphthalene degradation - Pseudomonas sp ATCC 13867 Aminobenzoate degradation - Pseudomonas sp ATCC 13867 Glyoxylate and dicarboxylate metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 Propanoate metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 Styrene degradation - Pseudomonas sp ATCC 13867 Butanoate metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 C5-Branched dibasic acid metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 One carbon pool by folate - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr00680 pdr00730 pdr00740 pdr00750 pdr00760 pdr00770 pdr00780 pdr00785 pdr00790 pdr00860 pdr00900 pdr00903 pdr00910 pdr00920 pdr00930 pdr00970 pdr01040 pdr01054 pdr01100 pdr01110 pdr01120 pdr01130 pdr01200 pdr01210 pdr01212 pdr01220 13867 pdr01230 pdr01501 pdr01502 pdr01503 pdr02010 pdr02020 pdr02024 pdr02025 pdr02030 pdr02040 pdr02060 pdr03010 pdr03018 pdr03020 Methane metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 Thiamine metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 Riboflavin metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 Vitamin B6 metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 Nicotinate and nicotinamide metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 Pantothenate and CoA biosynthesis - Pseudomonas sp ATCC 13867 Biotin metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 Lipoic acid metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 Folate biosynthesis - Pseudomonas sp ATCC 13867 Porphyrin and chlorophyll metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 Terpenoid backbone biosynthesis - Pseudomonas sp ATCC 13867 Limonene and pinene degradation - Pseudomonas sp ATCC 13867 Nitrogen metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 Sulfur metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 Caprolactam degradation - Pseudomonas sp ATCC 13867 Aminoacyl-tRNA biosynthesis - Pseudomonas sp ATCC 13867 Biosynthesis of unsaturated fatty acids - Pseudomonas sp ATCC 13867 Nonribosomal peptide structures - Pseudomonas sp ATCC 13867 Metabolic pathways - Pseudomonas sp ATCC 13867 Biosynthesis of secondary metabolites - Pseudomonas sp ATCC 13867 Microbial metabolism in diverse environments - Pseudomonas sp ATCC 13867 Biosynthesis of antibiotics - Pseudomonas sp ATCC 13867 Carbon metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 2-Oxocarboxylic acid metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 Fatty acid metabolism - Pseudomonas sp ATCC 13867 Degradation of aromatic compounds - Pseudomonas sp ATCC Biosynthesis of amino acids - Pseudomonas sp ATCC 13867 beta-Lactam resistance - Pseudomonas sp ATCC 13867 Vancomycin resistance - Pseudomonas sp ATCC 13867 Cationic antimicrobial peptide (CAMP) resistance - Pseudomonas sp ATCC 13867 ABC transporters - Pseudomonas sp ATCC 13867 Two-component system - Pseudomonas sp ATCC 13867 Quorum sensing - Pseudomonas sp ATCC 13867 Biofilm formation - Pseudomonas aeruginosa - Pseudomonas sp ATCC 13867 Bacterial chemotaxis - Pseudomonas sp ATCC 13867 Flagellar assembly - Pseudomonas sp ATCC 13867 Phosphotransferase system (PTS) - Pseudomonas sp ATCC 13867 Ribosome - Pseudomonas sp ATCC 13867 RNA degradation - Pseudomonas sp ATCC 13867 RNA polymerase - Pseudomonas sp ATCC 13867 pdr03030 pdr03060 pdr03070 pdr03410 pdr03420 pdr03430 pdr03440 pdr04122 DNA replication - Pseudomonas sp ATCC 13867 Protein export - Pseudomonas sp ATCC 13867 Bacterial secretion system - Pseudomonas sp ATCC 13867 Base excision repair - Pseudomonas sp ATCC 13867 Nucleotide excision repair - Pseudomonas sp ATCC 13867 Mismatch repair - Pseudomonas sp ATCC 13867 Homologous recombination - Pseudomonas sp ATCC 13867 Sulfur relay system - Pseudomonas sp ATCC 13867 PHỤ LỤC Danh sách hợp chất phản ứng tạo sinh khối Pseudomonas denitrificans ATCC 13867 (phản ứng bio1, hệ số ‘-’ thể chất tham gia phản ứng, hệ số ‘+’ thể tạo thành sau phản ứng) Mã C00344_c0 C00065_c0 C00002_c0 Tên chất Phosphatidylglycerol L-Serin ATP C00004_c0 C00183_c0 C00001_c0 NADH C00010_c0 C00459_c0 C00063_c0 CoA C00029_c0 C00025_c0 UDP-glucose C00024_c0 C00097_c0 C00075_c0 Acetyl-CoA C00134_c0 Butane-1,4-diamin C00016_c0 C00047_c0 C00003_c0 C00009_c0 C00123_c0 C00008_c0 C00049_c0 FAD C00064_c0 C00440_c0 Biomass_c0 L-Glutamin L-Valin H2O dTTP CTP L-Glutamat L-Cystein UTP L-Lysin NAD+ Orthophosphat L-Leucin ADP L-Aspartat 5-Methyltetrahydrofolate Hệ số -0,0025 -0,205 -45,7318 -5,00E05 -0,402 -45,5608 -6,00E06 -0,0247 -0,126 Mã C00407_c0 C00073_c0 C00131_c0 Tên chất -0,003 -0,25 -5,00E05 -0,087 -0,136 C00350_c0 C00286_c0 C00006_c0 C00013_c0 C00062_c0 NADP+ -0,035 -1,00E05 -0,326 -0,00215 45,5628 -0,428 45,5608 -0,229 C00080_c0 H+ C00152_c0 C00135_c0 C00748_c0 C00082_c0 C00188_c0 C00458_c0 C00148_c0 L-Asparagin L-Isoleucin L-Methionin dATP C00041_c0 C00078_c0 C00044_c0 L-Alanin C00005_c0 C00020_c0 C00079_c0 NADPH -0,25 C00091_c0 -0,05 C00037_c0 L-Tryptophan GTP AMP L-Phenylalanin Phosphatidylethanola dGTP PPi L-Arginin L-Histidin Siroheme L-Tyrosin L-Threonin dCTP L-Prolin Succinyl-CoA Glycin Hệ số -0,276 -0,146 -0,0247 -0,488 -0,054 -0,203 -0,0004 -0,001 -0,176 -0,0035 -0,0254 -0,00013 0,7302 -0,281 45,5603 -0,229 -0,09 -0,001 -0,131 -0,241 -0,0254 -0,21 -3,00E06 -0,582 PHỤ LỤC Một phần ma trận tốn học biểu diễn cân hóa học phản ứng mơ hình PD13867 C17962_c0 C00149_c0 C11539_c0 C02376_c0 C05751_c0 C05757_c0 C03114_c0 C00235_c0 C01081_c0 C00327_c0 C00031_c0 C01468_c0 C00344_c0 C00857_c0 C02745_c0 C00051_c0 C00179_c0 C11542_c0 C21724_c0 C01659_c0 C00681_c0 C00262_c0 C16255_c0 C04462_c0 C04895_c0 C16155_c0 C02967_c0 C21027_c0 C00250_c0 C02291_c0 C00054_c0 C00053_c0 C06612_c0 R09840_c0 R04956_c0 R04993_c0R07599_c0R00442_c0 R08210_c0 R00519_c0 R00894_c0 R03012_c0 R05071_c0 R04132_c0 R00783_c0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ... [15] Hiện nay, vitamin B12 sử dụng rộng rãi điều trị thi u máu ác tính, viêm dây thần kinh ngoại biên [22] cofactor cần thi t cho enzym methionine synthase (R)-methylmalonyl-CoA mutase động vật... denitrificans ATCC 13867 244 Hình 3.3: Phản ứng thi u đường sinh tổng hợp arginin P denitrificans ATCC 13867 …5 Hình 3.4: (A) Phản ứng thi u đường sinh tổng hợp leucin (pdr00290) P... 26 enzym cần thi t để tổng hợp coenzym B12 có oxy Các gen phân bố hai nhóm khác nhiễm sắc thể [1] 1.1.2 Quá trình sinh tổng hợp vitamin B12 Pseudomonas denitrificans 1.1.2.1 Giới thi u vitamin