BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC MỘT SỐ CHẤT DỊ NGUYÊN TRONG THỰC PHẨM BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ HAI LẦN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU Mã sinh viên: 1401592 NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC MỘT SỐ CHẤT DỊ NGUYÊN TRONG THỰC PHẨM BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ HAI LẦN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Trần Cao Sơn TS Đặng Thị Ngọc Lan Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa phân tích Độc chất Viện Kiểm nghiệm an tồn vệ sinh thực phẩm Quốc gia HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Khóa luận thực hoàn thành Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, 65 Phạm Thận Duật, Mai Dịch, Cầu Giấy, Hà Nội Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin cảm ơn TS Trần Cao Sơn TS Đặng Thị Ngọc Lan giao đề tài, tận tình hướng dẫn góp ý, giúp đỡ em thực khóa luận Em xin cảm ơn ThS Nguyễn Thị Hà Bình nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ em q trình hồn thành khóa luận Đồng thời, em xin cảm ơn thầy cô mơn Hóa phân tích Độc chất, trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ, cung cấp cho em kiến thức cần thiết, bổ ích quan trọng Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, TS Trần Cao Sơn cán khoa Độc học Dị nguyên, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện giúp em thực đề tài Cuối em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè bên quan tâm, động viên em suốt trình vừa qua Trong trình thực đề tài trình độ lý luận thực tiễn hạn chế, đề tài khơng thể tránh khỏi có sai sót, mong nhận góp ý quý thầy cô bạn sinh viên Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, Ngày 17 tháng năm 2019 Sinh viên Nguyễn Thị Thu i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ vi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu dị ứng dị nguyên 1.1.1 Cơ chế dị ứng 1.1.2 Dị nguyên 1.2 Tổng quan dị ứng thực phẩm 1.2.1 Thực phẩm gây dị ứng 1.2.2 Các quy định hành dị nguyên 1.3 Phương pháp xác định dị nguyên 1.3.1 Phương pháp xét nghiệm miễn dịch 1.3.2 Phương pháp phân tích DNA 1.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ 10 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị 15 2.2.1 Thiết bị 15 2.2.2 Dụng cụ 16 2.2.3 Hóa chất 16 2.2.4 Chuẩn bị dung dịch thuốc thử, dung môi 16 2.3 Nội dung nghiên cứu 17 2.3.1 Xây dựng phương pháp sàng lọc đồng thời số dị nguyên thực phẩm LC-MS/MS 17 2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 18 2.3.3 Ứng dụng phương pháp phân tích để sàng lọc số dị nguyên mẫu thực phẩm 18 2.4 Phương pháp nghiên cứu 18 ii 2.4.1 Phương pháp xử lý mẫu 18 2.4.2 Phương pháp phân tích sắc ký lỏng khối phổ hai lần 20 2.4.3 Phương pháp thẩm định 21 2.4.4 Phương pháp xử lý kết 21 2.4.5 Phương pháp lấy mẫu 21 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1 Xây dựng phương pháp sàng lọc đồng thời số dị nguyên thực phẩm LC-MS/MS 22 3.1.1 Khảo sát điều kiện phân tích sắc ký lỏng khối phổ hai lần 22 3.1.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 26 3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 31 3.2.1 Tính đặc hiệu 31 3.2.2 Giới hạn phát (LOD) 33 3.3 Ứng dụng phương pháp phân tích để sàng lọc số dị nguyên mẫu thực phẩm 36 3.4 Bàn luận 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 Kết luận 40 Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC PL1 iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril AOAC Association of Official Analytical Communities Hiệp hội cộng đồng phân tích thức DNA Deoxyribonucleic acid Acid Deoxyribonucleic DTT Dithiothreitol Dithiothreitol ELISA Enzyme-linked Immune-sorbent Xét nghiệm miễn dịch liên Assay kết enzym HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao IA Iodoacetamide Iodoacetamid LC-MS/MS Liquid chromatography tandem mass spectrometry Sắc ký lỏng khối phổ hai lần LOD Limit of Detection Giới hạn phát MRM Multi reaction monitoring Kiểm soát đa phản ứng OGS Octyl β-D-glucopyranoside Octyl β-D-glucopyranosid PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymer Tài liệu tham khảo TLTK TOF Time of flight Thời gian bay TRIS Tris (hydroxymethyl) aminomethane Tris (hydroxymethyl) aminomethan iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số nghiên cứu xác định dị nguyên ELISA Bảng 1.2 Một số nghiên cứu xác định dị nguyên phương pháp PCR 10 Bảng 1.3 Các protein peptid đặc trưng số dị nguyên 12 Bảng 1.4 Một số nghiên cứu xác định dị nguyên sử dụng hệ LC-MS/MS 14 Bảng 2.1 Các dị nguyên thực phẩm protein đặc trưng tương ứng 15 Bảng 3.1 Kết khảo sát ion mẹ ion protein 22 Bảng 3.2 Các thông số khảo sát MS 23 Bảng 3.3 Chương trình gradient pha động 24 Bảng 3.4 Kết xác định nồng độ protein hòa tan 27 Bảng 3.5 Thời gian lưu mẫu chuẩn mẫu thêm chuẩn peptid 32 Bảng 3.6 Tỷ lệ ion đặc trưng dị nguyên 33 Bảng 3.7 Giới hạn phát dị nguyên 33 Bảng 3.8 Kết phân tích mẫu thực 36 v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cơ chế gây dị ứng Hình 1.2 Phân loại dị nguyên ngoại sinh Hình 2.1 Quy trình xử lý mẫu dự kiến ban đầu 19 Hình 3.1 Sắc đồ dị nguyên 25 Hình 3.2 Sắc đồ tổng dị nguyên 26 Hình 3.3 Quy trình chiết xuất protein dự kiến ban đầu 26 Hình 3.4 Kết khảo sát nồng độ trypsin 28 Hình 3.5 Kết khảo sát thời gian thủy phân 29 Hình 3.6 Quy trình xử lý mẫu 30 Hình 3.7 Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thêm chuẩn casein α S1 31 Hình 3.8 Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thêm chuẩn trứng 31 Hình 3.9 Sắc đồ casein α S1(634,3/249,2) sữa µg/g 34 Hình 3.10 Sắc đồ ovalbumin (673,4/223,2) trứng 20 µg/g 34 Hình 3.11 Sắc đồ Ara h1 (688,8/300,2) lạc µg/g 35 Hình 3.12 Sắc đồ Jug r1 (688,2/477,2) hạt óc chó 10 µg/g 35 Hình 3.13 Sắc đồ glycinin (575,2/219,2) hạt đậu tương 10 µg/g 35 vi ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, dị ứng thực phẩm mối quan tâm lớn toàn giới Theo số nghiên cứu Mỹ Châu Âu, tỷ lệ dị ứng thực phẩm người lớn 2%, trẻ nhỏ 8% có xu hướng ngày gia tăng [10], [23] Ở nước ta, chưa có số liệu thống kê xác, tình trạng dị ứng thực phẩm vấn đề thường gặp, đặc biệt trẻ em Phản ứng dị ứng thường xuất sau ăn thực phẩm gây dị ứng, với lượng nhỏ dị nguyên gây triệu chứng dị ứng hệ quan da (viêm da dị ứng, phù mạch, mề đay, ), hệ tiêu hóa (nơn, đau bụng, tiêu chảy, ), hệ hơ hấp (thở khò khè, khó thở, viêm họng cấp ), sốc phản vệ tử vong Theo FDA, có tám nhóm thực phẩm gây dị ứng gồm sữa, trứng, lạc, đậu tương, hạt cây, cá, động vật giáp xác lúa mì Năm dị nguyên: sữa, trứng, hạt lạc, đậu tương óc chó thuộc tám nhóm dị nguyên thực phẩm gây dị ứng phổ biến nguyên nhân hàng đầu gây sốc phản vệ dị ứng thực phẩm Các dị nguyên có khả nhiễm chéo cao sản xuất, với lượng nhỏ dị nguyên gây phản ứng dị ứng nghiêm trọng cho người sử dụng, chí tử vong Do việc xác định có mặt dị nguyên thực phẩm cần thiết, đặc biệt thực phẩm dành cho trẻ em đối tượng độ tuổi có tỉ lệ dị ứng thực phẩm lớn Ở Mỹ châu Âu, có quy định chặt chẽ ghi nhãn thực phẩm gây dị ứng [23], [30] Tại Việt Nam, chưa có quy định cụ thể giới hạn dị nguyên chưa có phương pháp thức để xác định dị ngun thực phẩm Do đó, đề tài “Nghiên cứu sàng lọc số chất dị nguyên thực phẩm sắc ký lỏng khối phổ hai lần” thực với hai mục tiêu sau: Xây dựng thẩm định phương pháp sàng lọc số dị nguyên thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần Ứng dụng phương pháp phân tích sàng lọc có mặt dị ngun số sản phẩm thực phẩm bao gồm sữa, bánh kẹo, thực phẩm bổ sung dạng bánh cho trẻ em CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu dị ứng dị nguyên 1.1.1 Cơ chế dị ứng Bệnh dị ứng phát sinh kết phản ứng miễn dịch bất thường chống lại protein môi trường (kháng nguyên) Mặc dù người thường xuyên tiếp xúc với kháng nguyên, phần nhỏ định cá nhân xảy phản ứng miễn dịch bất lợi kháng nguyên [38] Lần tiếp xúc với dị nguyên, hệ thống miễn dịch thể tạo kháng thể IgE đặc hiệu chống lại kháng nguyên Khi phơi nhiễm với loại kháng nguyên lần nữa, kích thích hệ thống miễn dịch thể sản sinh lượng lớn IgE chất trung gian hóa học, đặc biệt histamin, gây phản ứng dị ứng đặc trưng [17], [22] Hình 1.1 mơ tả tóm tắt chế gây dị ứng Hình 1.1 Cơ chế gây dị ứng 1.1.2 Dị nguyên 1.1.2.1 Định nghĩa Dị ngun chất có tính kháng ngun, vào thể, chúng kích thích thể sinh kháng thể IgE, IgG, IgM bệnh nhân có yếu tố di truyền, địa dị ứng [1] Khảo sát nồng độ trypsin thủy phân protein Hình 3.1 Khảo sát nồng độ trypsin thủy phân mẫu casein Hình 3.2 Khảo sát nồng độ trypsin thủy phân mẫu trứng PL Hình 3.3 Khảo sát nồng độ trypsin thủy phân mẫu đậu tương PL 4 Khảo sát thời gian thủy phân Hình 4.1 Khảo sát thời gian thủy phân mẫu casein Hình 4.2 Khảo sát thời gian thủy phân mẫu trứng PL Hình 4.3 Khảo sát thời gian thủy phân mẫu đậu tương PL Thẩm định độ đặc hiệu Hình 5.1 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu trắng thêm chuẩn casein (casein α S2) Hình 5.2 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu trắng thêm chuẩn đậu tương Hình 5.3 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu trắng thêm chuẩn lạc (Ara h1) PL Hình 5.4 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu trắng thêm chuẩn lạc (Ara h3/4) Hình 5.5 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu trắng thêm chuẩn óc chó PL Sắc đồ phân tích mẫu thực Hình 6.1 Sắc đồ phân tích mẫu bánh ăn dặm B1 PL Hình 6.2 Sắc đồ phân tích mẫu bánh ăn dặm B2 PL 10 Hình 6.3 Sắc đồ phân tích mẫu bánh ăn dặm B9 PL 11 Hình 6.4 Sắc đồ phân tích mẫu sữa S1 PL 12 Hình 6.5 Sắc đồ phân tích mẫu sữa S4 PL 13 Hình 6.6 Sắc đồ phân tích mẫu sữa S10 PL 14 Hình 6.7 Sắc đồ phân tích mẫu bánh kẹo K1 PL 15 Hình 6.8 Sắc đồ phân tích mẫu bánh kẹo K2 Hình 6.9 Sắc đồ phân tích mẫu bánh kẹo K6 PL 16 Hình 6.10 Sắc đồ phân tích mẫu bánh kẹo K10 PL 17 ... óc chó, đậu tương 2.2 Nguyên vật liệu, thi t bị 2.2.1 Thi t bị - Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ gồm thi t bị sắc ký lỏng HPLC LC20ADXR Shimadzu kết nối với thi t bị khối phổ ABSciex Triple Quad... 15 2.2 Nguyên vật liệu, thi t bị 15 2.2.1 Thi t bị 15 2.2.2 Dụng cụ 16 2.2.3 Hóa chất 16 2.2.4 Chuẩn bị dung dịch thu c thử, dung môi 16... tích (có độ xác 0,1 mg), Mettler Toledo - Cân kỹ thu t (có độ xác 0,01 g), Mettler Toledo - Thi t bị lắc xoáy, IKA - Máy ly tâm Mikro 200R, Hettich - Thi t bị đồng mẫu, Phillips 15 2.2.2 Dụng cụ