BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI -  NGUYỄN NHƯ THƯỢNG XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 2-MCPD ESTER VÀ 3-MCPD ESTER TRONG SỮA BỘT CƠNG THỨC BẰNG GC-MS/MS KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NHƯ THƯỢNG MSV: 1401600 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 2-MCPD ESTER VÀ 3-MCPD ESTER TRONG SỮA BỘT CÔNG THỨC BẰNG GC-MS/MS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Vũ Ngọc Tú ThS Nguyễn Thị Thùy Linh Nơi thực hiện: Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia HÀ NỘI – 2019 LỜI CẢM ƠN Đề tài thực Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, 65 Phạm Thận Duật, Mai Dịch, Cầu Giấy, Hà Nội Với lòng biết ơn sâu sắc, tơi xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Thị Thùy Linh ThS Vũ Ngọc Tú giao đề tài, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô mơn Hóa phân tích trường Đại học Dược Hà Nội truyền đạt, cung cấp cho kiến thức cần thiết, bổ ích thiết thực Đồng thời tơi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, TS Trần Cao Sơn cán khoa Độc học dị nguyên, Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện giúp đỡ q trình thực đề tài Cuối tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè, đặc biệt bạn Hồng Mai Anh, Phạm Trung Anh, Vũ Thị Thu Hiền, Lê Công Trực bên quan tâm, động viên tơi suốt thời gian qua Trong q trình thực đề tài, trình độ lý luận kinh nghiệm thực tiễn hạn chế nên đề tài khơng thể tránh khỏi thiếu sót Rất mong nhận góp ý thầy bạn sinh viên Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Nguyễn Như Thượng MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu dẫn xuất MCPD 1.1.1 Công thức cấu tạo tính chất hóa lý 1.1.2 Nguồn gốc 1.1.3 Độc tính 1.1.4 Quy định hành MCPD 1.2 Phương pháp xác định dẫn chất MCPD 1.2.1 Phương pháp xử lý mẫu 1.2.1.1 Chiết lỏng – lỏng 1.2.1.2 Làm mẫu 1.2.1.3 Thủy phân 1.2.1.4 Dẫn xuất 10 1.2.2 Phương pháp phân tích 10 1.3 Tổng quan sắc ký khí khối phổ 12 1.3.1 Sắc ký khí 12 1.3.2 Detector khối phổ 13 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 15 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 15 2.1.3 Hóa chất 15 2.1.4 Pha dung dịch chuẩn 16 2.2 Phương pháp nghiên cứu 16 2.2.1 Phương pháp xử lý mẫu 16 2.2.2 Phương pháp phân tích 17 2.2.3 Phương pháp thẩm định 17 2.2.3.1 Độ phù hợp hệ thống 17 2.2.3.2 Tính chọn lọc 17 2.2.3.3 Giới hạn pháp (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 18 2.2.3.4 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 18 2.2.3.5 Độ lặp lại độ thu hồi 19 2.2.4 Phương pháp xử lý kết 19 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1 Khảo sát, lựa chọn điều kiện GC-MS/MS 20 3.1.1 Điều kiện sắc ký khí 20 3.1.2 Điều kiện khối phổ 20 3.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 21 3.2.1 Khảo sát quy trình chiết lỏng – lỏng 22 3.2.2 Khảo sát quy trình làm 24 3.2.3 Khảo sát quy trình dẫn xuất 24 3.3 Thẩm định phương pháp 27 3.3.1 Độ phù hợp hệ thống 27 3.3.2 Tính chọn lọc 28 3.3.3 Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 30 3.3.4 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 32 3.3.5 Độ lặp lại độ thu hồi 34 3.4 Ứng dụng phân tích mẫu thực tế 35 3.5 Bàn luận 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 Kết luận 39 Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt AOAC AOCS BfR CE EFSA ECD EI FID GC-MS 10 GC-MS/MS 11 12 IP IS 13 LC-MS 14 LC-MS/MS 15 LD50 16 17 18 19 20 21 22 LOD LOQ MCPD NCI NPD PBA PCI 23 SCF 24 25 SPE TCD 26 TDI 27 THF Nội dung đầy đủ Association of Official Analytical Communities (Hiệp hội cộng đồng phân tích thức) American Oil Chemists' Society (Hiệp hội nhà hóa dầu Mỹ ) The German Federal Institute for Risk Assessment (Viện đánh giá rủi ro liên bang Đức) Collision energy (Năng lượng va chạm) European Food Safety Authority (Ủy ban an toàn thực phẩm Châu Âu) Electron capture detector (Detector cộng kết điện tử) Electron impact (Va chạm electron) Flame ionization detector (Detector ion hóa lửa) Gas chromatography mass spectrometry (Sắc ký khí khối phổ) Gas chromatography tandem mass spectrometry (Sắc ký khí khối phổ hai lần) Identification point (Điểm nhận dạng) Internal standard (Chất chuẩn nội) Liquid chromatography mass spectrometry (Sắc ký lỏng khối phổ) Liquid chromatography tandem mass spectrometry (Sắc ký lỏng khối phổ hai lần) Median lethal dose (Liều chết trung bình) Limit of Detection (Giới hạn phát hiện) Limit of Quatification (Giới hạn định lượng) Monochloropropanediol Negative chemical ionization (Ion hóa hóa học âm) Nitrogen phosphorus detector ( Detector nitơ phosphor) Phenylboronic acid Positive chemical ionization (Ion hóa hóa học dương) Scientific Committee for Food (Ủy ban Khoa học Thực phẩm Châu Âu) Solid phase extraction (Chiết pha rắn) Thermal conductivity detector (Detector dẫn nhiệt) Tolerable daily intake (mức dung nạp hàng ngày chấp nhận được) Tetrahydrofuran DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1 Một số phương pháp xác định MCPD ester 11 Bảng 2.1 Giới hạn sai lệch cho phép tối đa tỷ lệ ion 18 Bảng 3.1 Điều kiện khối phổ 21 Bảng 3.2 Kết đánh giá độ phù hợp hệ thống 3-MCPD 27 Bảng 3.3 Kết đánh giá độ phù hợp hệ thống 2-MCPD 27 Bảng 3.4 Số điểm IP 3-MCPD, 2-MCPD 30 Bảng 3.5 Bảng tỷ lệ ion 3-MCPD, 2-MCPD 30 Bảng 3.6 Kết đường chuẩn 3-MCPD 32 Bảng 3.7 Kết đường chuẩn 2-MCPD 33 10 11 12 Bảng 3.8 Độ lặp lại thu hồi 3-MCPD 2-MCPD mức thêm chuẩn 25 µg/kg, 62,5 µg/kg 125 µg/kg Bảng 3.9 Kết phân tích mẫu sữa bột thực tế Bảng 3.10 Đánh giá hàm lượng 3-MCPD ester sữa bột công thức 34 35 37 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ STT Tên hình Trang Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo 3-MCPD 2 Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo 2-MCPD Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo 2-MCPD ester 3-MCPD ester Hình 1.4 Sự tạo thành MCPD từ triacylglycerols Hình 1.5 Sơ đồ chuyển hóa 3-MCPD thể Hình 1.6 Các dẫn xuất hình thành từ phản ứng 3-MCPD với acetone, PBA HFBI Hình 1.7 Sơ đồ hệ thống GC-MS Hình 3.1 Dẫn xuất MCPD với PBA 20 Hình 3.2 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu dự kiến 22 10 Hình 3.3 Biểu đồ khảo sát quy trình chiết lỏng – lỏng 23 11 Hình 3.4 Biểu đồ khảo sát quy trình làm 24 12 Hình 3.5 Biểu đồ khảo sát quy trình dẫn xuất 25 13 Hình 3.6 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu tối ưu 26 17 Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu thêm chuẩn 3-MCPD Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu thêm chuẩn 2-MCPD Hình 3.9 Sắc ký đồ 3-MCPD 2-MCPD giá trị LOD, LOQ Hình 3.10 Đường chuẩn 3-MCPD 18 Hình 3.11 Đường chuẩn 2-MCPD 14 15 16 10 12 28 29 31 32 33 ĐẶT VẤN ĐỀ Monochloropropanediol (MCPD) ester với acid béo hình thành trình chế biến sản xuất loại thực phẩm nước tương, xì dầu, dầu hào, dầu ăn, mỡ, bánh lan, sữa… điều kiện nhiệt độ cao có mặt ion chlor MCPD ester sau vào thể bị enzym lipase tuyến tụy thủy phân dạng tự Hiện có thơng tin độc tính 2-MCPD, nhiên 2-MCPD có cấu trúc tương tự với 3-MCPD MCPD chứng minh gây ung thư động vật thí nghiệm, 3-MCPD phân loại chất có khả gây ung thư người Ủy ban an toàn thực phẩm châu Âu (EFSA) đồng ý với ước tính 100% hấp thu 3-MCPD người từ dạng ester Ủy ban Khoa học Thực phẩm (SCF) đề xuất mức dung nạp hàng ngày chấp nhận (TDI) µg/kg trọng lượng thể 3-MCPD Do đó, việc kiểm sốt hàm lượng MCPD ester sản phẩm sữa bột công thức cần thiết Đặc biệt, đối tượng nhạy cảm trẻ nhỏ, việc kiểm sốt hàm lượng MCPD ester giúp phòng ngừa nguy mắc ung thư, bảo vệ sức khỏe trẻ Hiện nay, giới có số nghiên cứu phương pháp xác định MCPD ester MCPD loại thực phẩm Tuy nhiên, Việt Nam lĩnh vực quan tâm gần có phương pháp tiêu chuẩn áp dụng cho phân tích mẫu nước tương, xì dầu dầu hào Do đó, đề tài “ Xây dựng phương pháp định lượng 2-MCPD ester 3-MCPD ester sữa bột công thức GC-MS/MS” thực với mục tiêu: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng 2-MCPD ester 3-MCPD ester sữa bột công thức GC-MS/MS Ứng dụng phương pháp để sơ đánh giá hàm lượng 2-MCPD ester 3-MCPD ester số sản phẩm sữa bột công thức CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu dẫn xuất MCPD 1.1.1 Công thức cấu tạo tính chất hóa lý Trong thực phẩm, dẫn chất MCPD tồn chủ yếu dạng tự dạng liên kết ester với acid béo ❖ 3-MCPD Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo 3-MCPD Danh pháp IUPAC: 3-chloropropane-1,2-diol Tồn dạng hỗn hợp racemic đồng phân (R) (S) Tính chất hóa lý Khối lượng phân tử: 110,537; chất lỏng, không màu có màu vàng; nhiệt độ nóng chảy: 40oC; nhiệt độ sôi: 213oC (760 mmHg); tỉ trọng: 1,32; tan tốt nước, ethanol, methanol, chloroform ethyl acetat ❖ 2-MCPD Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo 2-MCPD Danh pháp IUPAC: 2-chloropropane-1,3-diol Tính chất hóa lý PHỤ LỤC Phổ MS/MS Sắc đồ TIC MRM Sắc đồ khảo sát làm Sắc đồ đường chuẩn 3-MCPD Sắc đồ đường chuẩn 2-MCPD Sắc đồ độ lặp lại độ thu hồi Sắc đồ mẫu dương tính Sắc đồ mẫu âm tính Sắc đồ số mẫu thực