BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - LÊ ĐỨC VIỆT XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 5-HYDROXYMETHYLFURFURAL VÀ CAFEIN TRONG NƯỚC GIẢI KHÁT BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - LÊ ĐỨC VIỆT MSV: 1401681 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 5-HYDROXYMETHYLFURFURAL VÀ CAFEIN TRONG NƯỚC GIẢI KHÁT BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Thị Thùy Linh Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa phân tích Độc chất HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Khóa luận thực Bộ mơn Hóa phân tích Độc chất – Trường Đại học Dược Hà Nội Với lòng biết ơn kính trọng sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới ThS Nguyễn Thị Thùy Linh – Giảng viên Bộ mơn Hóa phân tích Độc chất – Trường Đại học Dược Hà Nội, dành nhiều thời gian, cơng sức, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em q trình nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn đến ThS Vũ Ngân Bình thầy cơ, anh/chị kỹ thuật viên Bộ mơn Hóa phân tích Độc chất – Trường Đại học Dược Hà Nội tận tình bảo tạo điều kiện tốt để em hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, phòng ban, thầy tồn thể cán cơng nhân viên Trường Đại học Dược Hà Nội trực tiếp giảng dạy giúp đỡ em suốt trình học tập hoạt động trường Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình bạn bè, người ln bên, động viên khích lệ em suốt trình học tập thực đề tài Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2019 Sinh viên Lê Đức Việt MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan đối tượng phân tích 1.1.1 Cấu trúc hóa học, tính chất vật lý - hóa học 5-HMF Cafein 1.1.2 Con đường tổng hợp, chuyển hóa độc tính 5-HMF 1.1.3 Độc tính Cafein 1.1.4 Giới hạn hàm lượng 5- HMF, Cafein số nước giải khát 1.2 Tổng quan phương pháp phân tích 5-HMF cafein 1.2.1 Trong nước .9 1.2.2 Thế giới 10 1.3 Tổng quan sắc ký điện động mixen 13 1.3.1 Giới thiệu phương pháp điện di mao quản 13 1.3.2 Sắc kí điện động mixen (MEKC) .15 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .16 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 16 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.2 Nguyên vật liệu, trang thiết bị 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 18 2.3.2 Khảo sát lựa chọn điều kiện điện di 18 2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 19 2.3.4 Ứng dụng 21 2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu .21 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện điện di 22 3.1.1 Khảo sát lựa chọn bước sóng phát .22 3.1.2 Khảo sát lựa chọn phương pháp điện di 23 3.1.3 Khảo sát lựa chọn nồng độ dung dịch điện ly .24 3.1.4 Khảo sát lựa chọn nồng độ chất diện hoạt 25 3.1.5 Khảo sát lựa chọn hiệu điện đặt vào hai đầu mao quản 25 3.1.6 Khảo sát lựa chọn thời gian tiêm mẫu 26 3.1.7 Tổng kết điều kiện điện di lựa chọn .27 3.1.8 Định tính chất phân tích điện di đồ 28 3.2 Xử lý mẫu .29 3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 29 3.3.1 Độ phù hợp hệ thống .29 3.3.2 Độ chọn lọc 30 3.3.3 Khoảng tuyến tính đường chuẩn 31 3.3.4 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 33 3.3.5 Độ lặp lại 34 3.3.6 Độ 35 3.4 Ứng dụng định lượng số loại nước giải khát thị trường 37 3.5 Bàn luận 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .41 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ Tiếng Anh Tiếng Việt 5-hydroxymethylfurfural 5-hydroxymethylfurfural viết tắt 5-HMF AOAC Association of Official Analytical Chemists Hiệp hội nhà hóa học phân tích thức Background electrolyte Dung dịch điện ly Concentration Nồng độ Capillary electrophoresis Điện di mao quản CZE Capillary zone electrophoresis Điện di mao quản vùng EOF Electroendoosmotic flow Dòng điện thẩm EtOH Ethanol Ethanol Gas chromatography - mass spectrometry Sắc ký khí – khối phổ HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao LC-MS Liquid chromatography - mass spectrometry Sắc ký lỏng – khối phổ LD50 Lethal dose 50 Liều gây chết 50% cá thể LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng MEKC Micellar electrokinetic chromatograph Sắc ký điện động mixen MeOH Methanol Methanol RS Resolution Độ phân giải Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối Area Diện tích SD Standard deviation Độ lệch chuẩn SDS Sodium dodecyl sulfat Natri dodecyl sulfat Sulphotransferase Sulphotransferase tM Migration time Thời gian di chuyển UV Ultraviolet Bức xạ tử ngoại VIS Visible Ánh sáng khả kiến BGE C CE GC-MS RSD S SULT DANH MỤC CÁC BẢNG STT Bảng 1.1 Nội dung Cấu tạo hóa học, tính chất vật lý – hóa học 5-HMF Trang cafein 1.2 Một số nghiên cứu định lượng 5-HMF cafein 10 HPLC 1.3 Một số nghiên cứu định lượng 5-HMF cafein CE 12 2.1 Danh mục mẫu phân tích 16 3.1 Độ phù hợp hệ thống 5-HMF 29 3.2 Độ phù hợp hệ thống cafein 29 3.3 Quan hệ tuyến tính nồng độ diện tích pic 5- 31 HMF 3.4 Quan hệ tuyến tính nồng độ diện tích pic cafein 32 3.5 Kết xác định LOD, LOQ 5-HMF cafein 33 10 3.6 Kết đánh giá độ lặp lại 5-HMF cafein 35 11 3.7 Kết đánh giá độ 5-HMF 36 12 3.8 Kết đánh giá độ cafein 37 13 3.9 Kết định lượng số loại nước giải khát 38 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Hình Nội dung Trang 1.1 Con đường tổng hợp 5-HMF 1.2 Q trình chuyển hóa 5-HMF 1.3 Sơ đồ cấu tạo hệ thống điện di mao quản 15 3.1 Phổ hấp thụ 5-HMF Cafein 22 3.2 Điện di đồ trước sau thêm SDS 23 3.3 Điện di đồ nồng độ dung dịch điện ly khác 24 3.4 Điện di đồ nồng độ chất diện hoạt khác 25 3.5 Điện di đồ hiệu điệu 10 kV, 15 kV, 20 kV 26 3.6 Điện di đồ thời gian tiêm mẫu khác 27 10 3.7 Điện di đồ 5-HMF cafein điều kiện lựa chọn 28 11 3.8 Điện di đồ chất phân tích điều kiện lựa chọn 28 12 3.9 Định tính chất phân tích điện di đồ 28 13 3.10 Điện di đồ xác định tính chọn lọc phương pháp 30 11 3.11 Đồ thị quan hệ tuyến tính nồng độ diện tích pic 32 5-HMF 12 3.12 Đồ thị quan hệ tuyến tính nồng độ diện tích pic 32 cafein 13 3.13 Điện di đồ xác định LOD, LOQ 5-HMF cafein 34 14 3.14 Điện di đồ định lượng số mẫu thực 39 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm gần đây, nghiên cứu 5-hydroxymethylfurfuran (5-HMF) cafein thực phẩm, nước giải khát… thu hút nhiều quan tâm, ý nhà nghiên cứu 5-HMF sản phẩm chuyển hóa từ đường qua phản ứng Maillard, nồng độ cao gây độc cho tế bào, kích thích mắt, đường hô hấp trên, da, niêm mạc màng nhầy [16], ngồi 5-HMF gây phá hủy ADN đáng kể tế bào sau tiếp xúc [20], [44] Cuộc sống phát triển người gia tăng xu hướng sử dụng nhiều loại đồ ăn nhanh, bánh loại nước uống giải khát… để tiết kiệm thời gian, loại thực phẩm, đồ uống chứa hàm lượng đường lớn dẫn tới hàm lượng 5-HMF lớn Cafein hợp chất thường sử dụng nhiều loại nước giải khát, sử dụng lượng khơng gây ảnh hưởng nhiều đến sức khỏe, dùng liều dẫn tới ngủ, hồi hộp, buồn nôn, ù tai run tay chân, đặc biệt kích thích tim q mức, giảm lượng tinh trùng nam giới, giảm khả thụ thai nữ giảm cân nặng trẻ sơ sinh Với độc tính nguy hại vậy, khơng thể chủ quan với có mặt 5-HMF cafein thực phẩm, đồ uống… dùng hàng ngày Vì vấn đề an tồn vệ sinh thực phẩm vấn nạn đòi hỏi ngành kiểm nghiệm tìm phương pháp kiểm tra hợp lý Tình trạng sử dụng loại nước có ga (coca-cola, pepsi…) hay số loại nước ép hoa quả, nước trái ngày tăng dần trở nên phổ biến Hàm lượng đường có mặt loại nước lớn từ 0,1-0,2 g/ml, dẫn đến lượng 5-HMF loại nước cao, cafein thường bị lạm dụng để làm tăng tỉnh táo, tăng hiệu làm việc Như việc sử dụng liên tục dài ngày loại thức uống dẫn đến tình trạng tích lũy 5-HMF cafein thể gây ảnh hưởng xấu Tại Việt Nam, chưa có nhiều nghiên cứu 5-HMF cafein Hiện 5-HMF, cafein xác định dựa số phương pháp đo quang, sắc ký khí khối phổ (GC-MS) sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Tuy nhiên phương pháp đo quang có độ đặc hiệu không cao, dễ bị ảnh hưởng mẫu; thiết bị GC-MS khơng phổ biến phòng thí nghiệm; phương pháp HPLC cho độ nhạy lặp lại tốt giá thành cao, chi phí cho mẫu lớn, tốn dung mơi, quy trình phức tạp gây nhiễm mơi trường Đến thời điểm tại, nhóm nghiên cứu chưa tìm thấy nghiên cứu phân tích đồng thời 5-HMF cafein nước phương pháp điện di mao quản phương pháp cho hiệu lực tách tốt, quy trình đơn giản, dung dịch điện ly dễ kiếm chi phí thấp Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành nghiên cứu: “Xây dựng phương pháp định lượng 5-hydroxymethylfurfural cafein nước giải khát điện di mao quản” với mục tiêu chính: Xây dựng thẩm định phương pháp xác định 5-hydroxymethylfurfural cafein nước giải khát phương pháp điện di mao quản Ứng dụng phương pháp phân tích số mẫu nước giải khát sử dụng rộng rãi thị trường Bảng 3.6 Kết đánh giá độ lặp lại 5-HMF cafein 5-HMF STT Spic C CTB (mAU.s) (µg/ml) (µg/ml) Cafein RSD (%) Spic C CTB AOAC (%) (mAU.s) (µg/ml) (µg/ml) 25,5 18,0 19,3 18,0 25,6 18,1 19,3 18,0 25,8 18,2 20,3 19,0 25,5 18,0 20,7 19,4 25,4 18,0 19,7 18,4 25,3 17,9 19,2 17,9 151,1 108,7 144,2 141,6 147,7 106,3 147,1 144,5 153,5 110,5 142,7 140,1 151,9 109,3 143,4 140,8 149,8 107,8 143,8 141,2 150,3 108,2 147 144,4 233,3 168,1 396,1 390,9 240,5 173,3 391,4 386,3 242,8 174,9 383,1 378,1 237,3 171,0 389,2 384,1 240,7 173,4 379,6 374,8 235,2 169,5 383,6 378,6 18,0 108,5 171,7 0,57 < 7,3 1,31 < 5,3 1,52 < 5,3 RSD (%) AOAC (%) 18,5 3,30 < 7,3 142,1 1,30 < 5,3 382,1 1,57 < 5,3 Kết cho thấy nồng độ thấp, trung bình, cao khoảng tuyến tính, RSD nằm giới hạn cho phép AOAC Như vậy, phương pháp xây dựng đạt yêu cầu độ lặp lại 3.3.6 Độ Độ phương pháp đánh giá qua độ thu hồi Theo quy định hội đồng châu Âu tiêu an toàn, thêm chuẩn vào mẫu trắng (hoặc mẫu thử) ba mức nồng độ 0,5 lần, lần lần giới hạn cho phép 35 Giới hạn cho phép 5-HMF nước giải khát 10 µg/ml, cafein nước giải khát 200 µg/ml, tiến hành thêm chuẩn vào mẫu tự tạo (đối với 5-HMF) ba mức nồng độ µg/ml, 10 µg/ml 20 µg/ml thêm chuẩn vào mẫu thực (đối với cafein) ba mức nồng độ 100 µg/ml, 200 µg/ml 400 µg/ml Kết độ thể bảng 3.7 3.8 Bảng 3.7 Kết đánh giá độ 5-HMF STT Nồng độ Diện tích Nồng độ 5-HMF Độ thu hồi TB Yêu cầu chuẩn thêm pic tìm lại (µg/ml) (%) (%) AOAC theo lý (mAU.s) (%) thuyết (µg/ml) 7,2 4,81 96,3 7,5 5,03 100,6 7,3 4,89 97,7 7,8 5,25 104,9 14,2 9,87 98,7 14,9 10,37 103,7 15,0 10,45 104,4 14,3 9,94 99,4 29,4 20,85 104,2 28,9 20,48 102,4 29,5 20,92 104,5 28,5 20,20 100,9 3 5,00 10,00 20,00 36 99,9 80-110 101,6 80-110 103,0 80-110 Bảng 3.8 Kết đánh giá độ cafein Nồng độ STT Nồng chuẩn độ mẫu thêm theo thử lý thuyết Diện tích Nồng độ thử Độ thu hồi TB Yêu cầu pic + chuẩn tìm (%) (%) AOAC (mAU.s) lại (µg/ml) 101,6 99,44 99,4 100,8 98,65 98,5 99,7 97,56 97,3 (%) (µg/ml) 10,72 10,72 10,72 10,72 99,3 97,17 96,8 16,36 209,0 205,75 103,1 16,36 197,2 194,07 96,8 16,36 207,5 204,26 102,3 16,36 205,8 202,58 101,4 15,07 396,1 390,9 99,0 15,07 391,4 386,3 97,8 15,07 389,2 384,1 97,3 15,07 407,4 402,1 101,9 89,29 183,61 379,48 98,0 90-107 100,9 90-107 99,0 90-107 Kết bảng cho thấy, độ thu hồi 5-HMF cafein nằm khoảng giới hạn cho phép AOAC Như vậy, phương pháp định lượng hai chất đạt yêu cầu độ 3.4 Ứng dụng định lượng số loại nước giải khát thị trường Trong phần này, áp dụng phương pháp xây dựng để phân tích định lượng 5-HMF cafein số mẫu nước giải khát thị trường Các loại nước giải khát sau mua số siêu thị, cửa hàng tạp hóa, chợ địa bàn Hà Nội mã hóa mẫu, ghi lại thơng tin tên mẫu, số lô, ngày sản xuất, hạn sử dụng cơng ty sản xuất/phân phối Sau đó, mẫu pha lỗng theo tỷ lệ thích hợp, lọc qua giấy lọc, qua màng lọc 0,45 µm cuối màng lọc 0,2 µm Dịch lọc phân tích dựa chương trình điện di xây dựng 37 Cơng thức tính nồng độ 5-HMF cafein mẫu ban đầu: Cmẫu = Cđo x K Trong đó: Cđo : Là nồng độ 5-HMF cafein dung dịch sau pha lỗng, tính dựa vào đường chuẩn Cmẫu : Là nồng độ 5-HMF cafein có mẫu ban đầu (µg/ml) K : Hệ số pha lỗng Kết phân tích trình bày theo mã số mẫu sau mã hóa bảng 3.9 Bảng 3.9 Kết định lượng số loại nước giải khát V01 Nồng độ 5-HMF (µg/ml) 175,8 Nồng độ cafein (µg/ml) Dưới LOQ V02 5,8 Dưới LOQ V03 5,0 71,0 V04 Dưới LOQ 177,7 V05 Dưới LOQ Dưới LOQ V06 Dưới LOQ Dưới LOQ V07 Dưới LOQ 167,8 V08 Dưới LOQ Dưới LOQ V09 5,1 Dưới LOQ 10 V10 Dưới LOQ 171,6 11 V11 6,2 Dưới LOQ 12 V12 8,2 Dưới LOQ 13 V13 Dưới LOQ Dưới LOQ 14 V14 5,2 98,7 15 Dưới LOQ Dưới LOQ 16 V15 V16 7,6 Dưới LOQ 17 V17 5,2 Dưới LOQ 18 V18 Dưới LOQ Dưới LOQ STT Mã số mẫu Các mẫu định lượng bao gồm 18 mẫu nước giải khát, thu thập địa bàn thành phố Hà Nội, quận Hoàn Kiếm, Hoàng Mai, Hai Bà Trưng, Đống Đa 38 Kết cho thấy, 17 mẫu nước giải khát (trừ mẫu V01) có nồng độ 5-HMF thấp (5,1 – 7,6 µg/ml), nằm mức giới hạn cho phép IFFJPs Đối với mẫu siro V01, hàm lượng 5-HMF định lượng cao 175,8 µg/ml Khi sử dụng siro cần pha loãng sản phẩm nên nồng độ 5-HMF giảm, nhiên cần hạn chế Các mẫu nước giải khát chứa cafein thường mức cao, cao mẫu V04 (177,7 µg/ml) Hiện nay, nhiều loại nước giải khát thị trường không ghi rõ hàm lượng cafein thể tích đóng chai (300-330 ml) nên thường bị giới trẻ lạm dụng dẫn tới tình trạng sử dụng cafein cao mức cho phép thường xuyên xảy ra, gây ảnh hưởng nhiều đến sức khỏe đề cập mục 1.1.3 V01 V11 V04 V10 Hình 3.14 Điện di đồ định lượng số mẫu thực 3.5 Bàn luận Về phương pháp, Việt Nam, 5-HMF cafein định lượng phương pháp quang phổ, sắc ký khí khối phổ GC-MS sắc ký lỏng hiệu cao HPLC Phương pháp quang phổ dễ bị ảnh hưởng mẫu, hầu hết loại nước giải khát có thành phần phụ hợp chất màu hấp thụ xạ làm sai lệch kết Thiết bị sử dụng phương pháp GC-MS máy sắc ký khí khối phổ lại khơng phổ biến phòng thí nghiệm Việt Nam HPLC phương pháp cho hiệu lực tách tốt, độ lặp độ nhạy tốt tốn dung môi Điện di mao quản chưa sử dụng rộng rãi phân tích phương pháp có hiệu lực tách tốt, 39 hóa chất dung mơi dễ kiếm chi phí thấp Vì nhóm nghiên cứu tiến hành triển khai phân tích đồng thời 5-HMF cafein phương pháp điện di mao quản Hầu hết nghiên cứu trước định lượng hai chất phân tích Theo nghiên cứu [40], cafein dùng làm chuẩn nội cho phép phân tích 5-HMF Tuy nhiên số loại nước Việt Nam thường chứa đồng thời 5-HMF cafein nên sử dụng cafein làm chuẩn nội để định lượng 5-HMF nghiên cứu chưa phù hợp Nghiên cứu [17] định lượng 5-HMF đồ uống có ga sử dụng HPLC với chương trình gradient phức tạp Đối với phương pháp MEKC, nghiên cứu [18] [24] định lượng 5-HMF với nồng độ SDS cao (100 mM), nghiên cứu [19] định lượng cafein sử dụng dung dịch BGE nhiều thành phần kết hợp với SDS nồng độ cao (100 mM) dễ gây bẩn tắc mao quản Phương pháp xây dựng thực định lượng đồng thời 5-HMF cafein, sử dụng dung dịch BGE đơn giản, nồng độ SDS thấp (75 mM) nên làm giảm khả tắc mao quản Về trình xử lý mẫu, sản phẩm nước giải khát thường chứa lượng đường lớn (10-17%), phân tích HPLC phải tiến hành loại đường để khơng gây tắc cột phân tích lượng mẫu lớn [8] Một số nghiên cứu đo quang cần sử dụng thêm acetaldehyd, acid barbituric, p-toluidin trình xử lý mẫu [6] Trong đó, CE sử dụng cột mao quản rỗng nên quy trình xử lý mẫu đơn giản không gây tắc cột thành phần đường mẫu phân tích, từ cho thấy rõ tính tối ưu quy trình xử lý mẫu so với phương pháp khác Về kết định lượng mẫu thực cho thấy mẫu V01 có nồng độ 5-HMF cao (175,8 µg/ml), nhóm nghiên cứu cho hai nguyên nhân: thứ nhất, lượng đường hoa thường lớn, nên sử dụng để sản xuất siro dẫn đến lượng đường sản phẩm cao; thứ hai ảnh hưởng nhiệt độ trình xử lý đặc nhiều lần làm q trình phân hủy đường tạo 5-HMF qua phản ứng Maillard xảy mạnh mẽ, dẫn đến 5-HMF sinh nhiều Các nhà sản xuất thường lạm dụng cafein nước giải khát để làm tăng tỉnh táo, tập trung cho người uống, tình trạng ngộ độc cafein thường xuyên xảy ra, đặc biệt giới trẻ Do nên dùng tối đa từ 2-3 lon nước giải khát chứa cafein ngày tuyệt đối không nên sử dụng liên tục dài ngày để đảm bảo sức khỏe 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau khoảng thời gian dài nghiên cứu làm thực nghiệm, chúng tơi hồn thành hai mục tiêu sau: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng đồng thời 5-HMF cafein với điều kiện điện di: ➢ Mao quản điện di: cột silica nung chảy, chiều dài 44 cm, chiều dài hiệu dụng 36 cm, đường kính 50 µm, đường kính ngồi 375 µm ➢ Bước sóng phát hiện: 284 nm (5-HMF) 274 nm (cafein) ➢ Detector: UV – VIS ➢ Dung dịch điện ly nền: Đệm borat 40 mM + SDS 75 mM ➢ Hiệu điện đặt vào hai đầu mao quản: 15 kV ➢ Chế độ tiêm mẫu áp suất: 50 mbar x 5s ➢ Chương trình hoạt hóa cột: ✓ Xử lý mao quản ✓ Hàng ngày, vào thời điểm đầu ngày ✓ Giữa lần chạy ✓ Thời điểm cuối ngày Phương pháp thẩm định tiêu chí: ➢ Tính tương thích hệ thống: RSD < 2% ➢ Tính chọn lọc ➢ Khoảng tuyến tính đường chuẩn o 5-HMF: 10 – 200 µg/ml, y = 1,3848x + 0,5464, R2 = 0,9996 o Cafein: 10 – 500 µg/ml, y = 1,0103 + 1,1330, R2 = 0,9992 ➢ Giới hạn phát giới hạn định lượng o 5-HMF: LOD = µg/ml, LOQ = µg/ml o Cafein: LOD = µg/ml, LOQ = µg/ml ➢ Độ lặp lại: RSD < 5,3 % ➢ Độ đúng: Độ thu hồi 5-HMF nằm khoảng 80-110% cafein nằm khoảng 90-107% 41 Ứng dụng phương pháp xây dựng để định lượng đồng thời 5-HMF cafein số mẫu nước giải khát phổ biến thị trường Kiến nghị Sau thực đề tài này, chúng tơi có số đề xuất sau: - Tiếp tục triển khai phương pháp số đối tượng mẫu khác: thuốc, thực phẩm chức năng… - Cân nhắc trang bị thêm thiết bị điện di để phương pháp ngày phổ biến ứng dụng rộng rãi lĩnh vực nghiên cứu kiểm nghiệm 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y tế (2007), Hóa dược, tập 1, NXB Y học, Hà Nội Bộ Y Tế (2007), Hóa phân tích, tập 1, NXB Y học, Hà Nội Bộ Y Tế (2007), Hóa phân tích, tập 2, NXB Y học, Hà Nội Bộ Y Tế (2018), Dược điển Việt Nam V, tập 1, tr.167, NXB Y học, Hà Nội Bộ Y Tế (2018), Dược điển Việt Nam V, tập 1, tr.462, NXB Y học, Hà Nội Cục an toàn sinh thực phẩm (2012), TCVN 9041:2012, Sản phẩm rau - xác định hàm lượng 5-hydroxymethylfurfural Cục an toàn sinh thực phẩm (2012), TCVN 9723:2013, Cà phê sản phẩm cà phê – xác định hàm lượng cafein sắc ký lỏng hiệu cao Nguyễn Thị Thùy Linh, Trần Thị Nguyệt, Tào Thị Phương, Nguyễn Triệu Quý, Phạm Thị Thanh Hà, (2018), “Xây dựng phương pháp định lượng 5hydroxymethylfurfural số chế phẩm thuốc thực phẩm chức phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao”, Tạp chí Dược học, số 501, 1/2018, tr.1719 Tào Thị Phương, Nguyễn Triệu Quý, Phạm Thị Thanh Hà, Vũ Công Sáu, (2016), “Nghiên cứu định lượng 5-hydroxymethylfurfural nước số thuốc, thực phẩm chức sắc ký khí – khối phổ”, Tạp chí Dược học, số 483, 7/2016, tr.48-52 10 Trường Đại học Dược Hà Nội (2015), Điện di mao quản, NXB Y học, Hà Nội 11 Viện Kiểm nghiệm An Toàn Vệ sinh Thực Phẩm Quốc Gia (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật, Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội Tiếng Anh 12 Abraham.K, Gurtler.R, Berg K, Heinemeyer.G, Lampen A and Klaus E Appel (2011), “Toxicology and risk assessment of 5- Hydroxymethylfurfural in food”, Molecular nutrition & food research, 55(5), pp.667-669 13 AOAC International (2002), “AOAC Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals”, Journal of the AOAC 14 Bolumar F., Olsen J., Rebagliato M., Bisanti L., (1997), “Caffein Intake and Delayed Conception: A European Multicenter Study on Infertility and Subfecundity”, American Journal of Epidemiology, 145(4), pp.324-334 15 British Pharmacopoeia Commisson (2001), British Pharmacopoeia, II, pp.2123 16 Capuano E., Fogliano V., (2011), “Acrylamide and 5-hydroxymethylfurfural (HMF): A review on metabolism, toxicity, occurrence in food and mitigation strategies”, LWT - Food Science and Technology, 44(4), pp.793-810 17 Chih-Yu Lo, et al., (2007), “Reactive dicarbonyl compounds and 5(hydroxymethyl)-2-furfural in carbonated beverages containing high fructose corn syrup”, Food Chemistry, 107(3), pp 1099–1105 18 Corradini D., Corradini C., (1992), “Separation and determination of 5hydroxymethyl-2-furaldehyde and 2-furaldehyde in fruit juices by micellar electrokinetic capillary chromatography with direct sample injection”, Journal of Chromatography, 624(1-2), pp 503-509 19 Cunha R.R., et al., (2015), “Simultaneous determination of caffeine, paracetamol, and ibuprofen in pharmaceutical formulations by high-performance liquid chromatography with UV detection and by capillary electrophoresis with conductivity detection”, Journal of Separation Science, 38(10), pp.1657-1662 20 Durling J.K., Busk L., Hellman E.B (2009), “Evaluation of the DNA damaging effect of the heat-induced food toxicant 5-hydroxymethylfurfural (HMF) in various cell lines with different activities of sulfotransferases”, Food and Chemical Toxicology, 47(4), pp.880-884 21 Fajara B.E.P., Susanti H., (2017), “HPLC determination of caffeine in coffee beverage”, Materials Science and Engineering, 259(1) 22 Fang Liu, et al., (2014), “Solvent extraction of 5-HMF from simulated hydrothermal conversion product”, Sustain Environ Res., 24(2), pp.149-157 23 Ferrer E., et al, (2002), “High-performance liquid chromatographic determination of furfural compounds in infant formulas: Changes during heat treatment and storage”, Journal of Chromatography A, 947(1), pp.85-95 24 Francisco J Morales, Salvio JimeÂnez-PeÂrez, (2000), “Hydroxymethylfurfural determination in infant milk-based formulas by micellar electrokinetic capillary chromatography”, Food Chemistry, 72(4), pp.525-531 25 Gerald I., Arthur D.E., Adedayo A., (2014), “Determination of Caffeine in Beverages: A Review”, American Journal of Engineering Research, 3(8), pp.124137 26 Gurkan R., Altunay N., (11/2015), “Quantification of 5-hydroxymethylfurfural in honey samples and acidic beverages using spectrophotometry coupled with ultrasonic-assisted cloud point extraction”, Journal of Food Composition and Analysis, 42, pp.141-151 27 Hernández G.E., Villanova G.B., Gómez M.J (1992), “Determination of hydroxymethylfurfural in baby cereals by high performance liquid chromatography”, Journal of Liquid Chromatography, 15(14), pp.2551-2559 28 Hughes JR, Oliveto AH, Liguori A, Carpenter J, Howard T., (1998), “Endorsement of DSM-IV dependence criteria among caffeine users”, Drug Alcohol Dependence, 52(2), pp.99 –107 29 Jandlova M., Kucerova J (2016), “Hydroxymethylfurfural in syrupsn doughs and in syrup’ biscuits”, mendelNet, pp.557-581 30 Jensen T.K., et al., (2010), “Caffein Intake and Semen Quality in a Population of 2554 Young Danish Men”, American Journal of Epidemiology, 171(8), pp.883-891 31 Kmen V., Hamide Z.S., Enyuva, (2006), “Improved Method for the Determination of Hydroxymethylfurfural in Baby Foods Using Liquid Chromatography – Mass Spectrometry”, Journal of agricultural and food chemistry, 54(8), pp.2845-2849 32 Lewis, R.J Sr.; Hawley's, (2007), Condensed Chemical Dictionary 15th Edition John Wiley & Sons, Inc New York, pp.675 33 Lewkowski J (2001), “Synthesis, chemistry and applications of 5- hydroxymethylfurfural and its derivatives”, Arkivoc, pp.17-54 34 Louis ZG Touyz, (2017), “Caffeine in Soft Drinks and Beverages: Sources, Pharmacology and Toxicology”, International Journal of Medical Science and Health Research, 1(02) 35 Marinovic M.B., Taugner F., Florian S., Glatt H., (2012), “Toxicity studies with 5hydroxymethylfurfural and its metabolite 5-sulphooxymethylfurfural in wild-type mice and transgenic mice expressing human sulphotransferases 1A1 and 1A2”, Arch Toxicol, 86, pp.701–711 36 Md Abdul Mumin, et al., (2006), “Determination and Characterization of Caffeine in Tea, Coffee and Soft Drinks by Solid Phase Extraction and High performance Liquid Chromatography”, Malaysian Journal of Chemistry, 8(1), pp.45 – 51 37 Melo F.C., et al (2014), “Synthesis of 5-Hydroxymethylfurfural from Dehydration of Fructose and Glucose Using Ionic Liquids”, Journal of the Brazilium Chemical Society, 25(12), pp.2378-2384 38 Meredith S.E., Juliano L.M., Hughes J.R., Griffiths R.R., (2013), “Caffeine Use Disorder: A Comprehensive Review and Research Agenda”, Journal of Caffeine Research, 3(3), pp.114-130 39 National toxicology program (2010), Toxicology and carcinogenesis studies of 5hydroxylmethyl-2-furfural, pp.15 40 Rizelio V M., Gonzaga L V., da Silva Campelo Borges G., Micke G A., Fett R., Costa A C O (2012), “Development of a fast MECK method for determination of 5-HMF in honey samples”, Food Chemistry, 133(4), pp.1640–1645 41 Roger M Smith, (1981), “Determination of 5-hydroxymethylfurfural and caffeine in coffee and chicory extracts by high performance liquid chromatography”, Food Chemistry, 7(1), pp.41-45 42 Smith R.F., Rees D.I., (1963), “The spectrophotometric determination of caffeine in coffee and tea products, with special reference to coffee and chicory mixtures”, The Analyst, 88(1005), pp.310-313 43 Teixido E., Santos F.J., Puignou L., Galceran M.T., (2006), “Analysis of 5hydroxymethylfurfural in foods by gas chromatography – mass spectrometry”, Journal of Chromatography A, 1135, pp 85-90 44 Ulbricht R.J., Northup S.J., Thomas J.A (1984), “A Review of 5Hydroxymethylfurfural (HMF) in Parenteral Solutions”, Fundamental and Applied Toxicology, 4(5), pp.843-853 45 Vlajinac H.D., et al., (2002), “Effect of Caffein intake During Pregnancy on Birth Weight”, American Journal of Epidemiology, 145(4), pp.335-338 46 Vorlová L., et al (2006), “Hydroxymethylfurfural contents in foodstuffs determined by HPLC method”, Journal of Food and Nutrition Research”, 45(1), pp.34-38 47 Wikoff D., Welsh B.T., Henderson R., (2017), “Systematic review of the potential adverse effects of caffeine consumption in healthy adults, pregnant women, adolescents, and children”, Food and Chemical Toxicology, 109, pp.585-648 48 Yang L., Liu Y., Ruan R., (2012), “Rapid determination of 5-hydroxymethylfurfural by ultravioletspectrophotometry in glucose diphasic hydrolysate”, Advanced Materials Research, 361-363, pp.1713-1717 49 Zhao Y., Lunte C.E., (1997), “Determination of caffeine and its metabolites by micellar electrokinetic capillary electrophoresis”, Journal of Chromatography B, 688(2), pp 265-274 50 Zhu Q., Ma C., Chen H., Wu Y., Huang J., (2013), “A molecular imprint-coated stirrer bar for selective extraction of caffeine, theobromine and theophylline”, Microchim Acta, 181(3-4), pp.303-311 51 Zylber-Katz D., et al., (1984), “Relationship between caffeine concentrations in plasma and saliva”, Clinical Pharmacology & Therapeutics, 36(1), pp.133-137 PHỤ LỤC Điện di đồ định lượng mẫu thực V02 V03-1, K=2 V03-2, K=1 V05 V07 V06 V08 V09 V12 V13 V14 V15 V16 V18 V17 ... thức Background electrolyte Dung dịch điện ly Concentration Nồng độ Capillary electrophoresis Điện di mao quản CZE Capillary zone electrophoresis Điện di mao quản vùng EOF Electroendoosmotic... Sắc ký lỏng – khối phổ LD50 Lethal dose 50 Liều gây chết 50% cá thể LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng MEKC Micellar electrokinetic chromatograph... Sulphotransferase Sulphotransferase tM Migration time Thời gian di chuyển UV Ultraviolet Bức xạ tử ngoại VIS Visible Ánh sáng khả kiến BGE C CE GC-MS RSD S SULT DANH MỤC CÁC BẢNG STT Bảng 1.1 Nội