1 ĐẶT VẤN ĐỀ U nguyên bào thần kinh đệm-Glioblastoma(GB) loại u não nguyên phát hệ thần kinh trung ương, chiếm khoảng 15-20% u nội sọ [1] Tổ chức Y tế giới phân loại U nguyên bào thần kinh đệm loại ác tính (độ IV)[2] Tỉ lệ U nguyên bào thần kinh đệm nam cao nữ giới, tuổi phát trung bình khoảng 64 tuổi [3] U nguyên bào thần kinh đệm thường hình thành chất trắng não, phát triển nhanh chóng, thành khối u lớn trước xuất triệu chứng Biểu lâm sàng thường hội chứng tăng áp lực nội sọ nặng, can thiệp điều trị thường không đem lại hiệu quả, thời gian sống thêm bệnh nhân sau mổ trung bình 10-12 tháng [4] Do vậy, việc tìm nguyên, chế bệnh sinh trình sinh bệnh học u nguyên bào thần kinh đệm để can thiệp xác hiệu quả, đồng thời đưa tiên lượng bệnh điều cần thiết Từ nghiên cứu đột phá Y học, chế phân tử ung thư dần sáng tỏ Theo đó, tích lũy đột biến gen theo thời gian dẫn tới phát sinh, phát triển dạng tế bào ung thư thể Quá trình chuyển dạng tế bào sang ác tính thường đánh dấu kích hoạt gen gây ung thư đột biến gây bất hoạt gen áp chế ung thư nằm số vị trí chủ chốt đường tín hiệu tế bào [4, 5] Cơ chế điều hòa gen vốn hoạt động nhịp nhàng chặt chẽ bị rối loạn khiến hệ thống enzym sửa chữa thương tổn gen tế bào khơng thể khắc phục dẫn tới việc tích lũy số lượng lớn đột biến, khởi phát trình ung thư [6-8] Nhưng đột biến lại làm tăng lực thuốc điều trị đích với phân tử ức chế dẫn truyền tín hiệu tế bào ung thư Nhờ chúng làm tăng hiệu thuốc điều trị đích việc tiêu diệt tế bào ung thư [9] Các nhà khoa học giới tìm thấy biến đổi số gen đóng vai trò quan trọng bệnh sinh u nguyên bào thần kinh đệm FGFR, EGFR, RTEL1, TP53, Hes3 [5-8]… Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng, đột biến số vùng gen FGFR EGFR làm tăng lực thuốc ức chế hoạt tính tyrosine kinase, xét nghiệm gen đóng vai trò liệu pháp điều trị bệnh Trong đó, gen RTEL1, TP53, Hes3 sử dụng để đánh giá nguy phát triển u nguyên bào thần kinh đệm [9-12] Trong báo cáo đề cập đến “Xác định đột biến gen bệnh u não Glioblastoma: FGFR,EGFR RTEL1, PT53, Hes3” Thuộc sản phẩm khoa học đề tài: Đề tài: “Nghiên cứu xác định đột biến số gen bệnh u nguyên bào thần kinh đệm (Glioblastoma) I- CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cơ chế bệnh sinh bệnh u nguyên bào thần kinh đệm 1.1.1 Các yếu tố nguy Yếu tố di truyền: yếu tố di truyền có tác động vào xuất số loại u não u nguyên bào võng mạc u thần kinh da Trong nhóm u xơ thần kinh typ 1, u tế bào hình hay gặp nhiều gấp lần Nhóm (được đặc trưng u dây VIII hai bên) tập hợp nhiều u khác (u thần kinh đệm ngoại biên, u xơ thần kinh, u màng não, u thần kinh đệm) Các u nguyên bào mạch não ống sống thường xuất với bệnh Von Hippel Lindau Suy giảm miễn dịch làm tăng nguy mắc u lymphô não Khoảng 20% bệnh nhân có biểu suy giảm miễn dịch kéo dài từ 5% đến 8% bệnh nhân AIDS bị u lymphơ ác tính, thường lympho B 1.1.2.Cơ chế bệnh sinh Cơ chế phân tử vai trò đột biến gen u nguyên bào thần kinh đệm Nghiên cứu tổn thương gen u nguyên bào thần kinh đệm công bố khoảng 35 năm trước Trong nhiều năm sau đó, gen đóng vai trò quan trọng bệnh sinh ung thư thụ thể yếu tố phát triển nguyên bào sợi (fibroblast growth factor receptor, FGFR), thụ thể yếu tố phát triển biểu mô (epidermal growth factor receptor, EGFR), gen áp chế ung thư TP53 nghiên cứu [11, 12] Bên cạnh số gen đánh giá mức độ ác tính biệt hố, hay kiểm sốt phân chia tế bào ung thư RTEL1 Hes3 xem xét đánh giá u nguyên bào thần kinh đệm Dựa tình trạng đột biến gen, nhà khoa học, bác sỹ lâm sàng có nhìn tổng thể nguy cơ, mức độ tiến triển để có biện pháp can thiệp điều trị kịp thời, nâng cao hiệu điều trị theo dõi tiên lượng bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm [13] Đột biến gen thụ thể yếu tố phát triển nguyên bào sợi (FGFRs) thụ thể yếu tố phát triển biểu mô (EGFR) FGFRs nhóm thụ thể xuyên màng có hoạt tính tyrosine kinase [14] Phân tử FGFRs gồm vùng gắn kết phối tử nằm màng tế bào, vùng xuyên màng đặc hiệu vùng nội bào Phần ngồi màng FGFRs có hai vùng giàu cystein nơi để gắn kết phối tử FGFRs Vùng xuyên màng trọng lượng nhỏ tập trung vùng phân cực phospholipid màng Phần tế bào protein kinase với đuôi tận carboxyl nơi xảy phản ứng tự phosphoryl hóa FGFRs [15,16] Ngay sau hoạt hóa cách gắn với phối tử chúng, vùng nội bào FGFRs tự phosphoryl hóa, khởi đầu dòng thác tín hiệu lan tỏa khắp tế bào gây kích hoạt: đường PI3K/Akt, tăng sinh mạch máu, di ức chế q trình chết theo chương trình (appoptosis), tín hiệu Ras/mitogen-activated protein kinase, đường dẫn truyền tín hiệu phiên mã (hình 2) [17-19] Do đột biến làm rối loạn hoạt động gen FGFRs đề làm thay đổi hoạt động sống tế bào nguyên nhân cho hình thành phát triển ung thư Hình 1.1 Cấu trúc, vị trí hoạt động đường tín hiệu thơng qua thụ thể yếu tố phát triển nguyên bào sợi FGFRs Nguồn: Haugsten et al Mol Cancer Res 2010;11,1439-1452 Nghiên cứu Shing cộng vào năm 2012 cho thấy đột biến dung hợp gen FGFRs-TACC đóng vai trò quan trọng bệnh sinh u nguyên bào thần kinh đệm [20] Bên cạnh đó, đột biến điểm N546K R576W nằm vùng có hoạt tính tyrosin kinase gen FGFRs nhiễm sắc thể số tìm thấy bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm (hình 3) [21] Các đột biến làm tăng lực thuốc điều trị với thụ thể trở thành đích tác dụng thuốc điều trị hướng đích ức chế hoạt tính tyrosine kinase bệnh nhân Glioblastoma [13,22] Như ngồi vai trò bệnh sinh u nguyên bào thần kinh đệm đột biến gen FGFRs có tác dụng định hướng điều trị xét nghiệm gen thiếu bác sỹ lâm sàng triển khai liệu pháp điều trị bệnh nhân Hình 1.2 Đột biến gen FGFRs bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm (A) Hình ảnh minh hoạ cấu trúc gen FGFRs vùng phát đột biến exon 12 13 vùng có hoạt tính tyrosine kinase (B) Kết giải trình tự gen trực tiếp xác định đột biến N546K R576W gen FGFRs Nguồn: Rand et al PNAS 2005;102,14344-14349 Bên cạnh thụ thể yếu tố phát triển biểu mơ, EGFR đóng vai trò quan trọng chế phân tử định hướng điều trị u nguyên bào thần kinh đệm [23,24] Gen EGFR nằm vị trí p11.2 nhiễm sắc thể số Giống FGFR, EGFR có hoạt tính tyrosine kinase có tác dụng kích hoạt loạt gen sinh ung thư chủ chốt đường tín hiệu nội bào khởi phát trình ung thư [25] Nghiên cứu Libermann cộng công bố vào năm 1985 cho thấy khoảng 3540% bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm có khuếch đại gen EGFR [26] Khơng lâu sau nhà khoa học chứng minh đột biến gây hoạt hố gen EGFR đóng vai trò quan trọng bệnh sinh u nguyên bào thần kinh đệm Tỷ lệ đột biến gen u nguyên bào thần kinh đệm lên đến 30-40% Các dạng đột biến bao gồm: đột biến xoá đoạn EGFRvIII (del.aa 30-297) đột biến điểm nằm chủ yếu vùng N-tận EGFR (hình 4) [27,28] Đột biến gây kiểm sốt gen EGFR thường xảy với bệnh nhân mang khối u nguyên phát Các dạng đột biến ảnh hưởng chủ yếu đến hoạt động vùng ngoại bào phân tử EGFR, nơi xảy tương tác với phối tử chúng [29] Đây đột biến làm tăng lực EGFR với thuốc ức chế hoạt tính tyrosine kinase loại Chính loại thuốc có hiệu hướng đích bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm có đột biến gen EGFR [30,31] Hình 1.3 Đột biến gen EGFR bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm Hình ảnh minh hoạ vùng gen EGFR vị trí đột biến xác vùng tương ứng gen Nguồn: Wilson cộng sự, Trung tâm gen, Đại học Washington Do đó, với mong muốn mang lại hiệu điều trị cao cho bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm Việt Nam, bên cạnh khảo sát đột biến gen FGFR, đề xuất thêm việc xác định đột biến gen EGFR Nắm tình trạng đột biến gen cấp thông tin hữu ích để phối hợp thuốc điều trị đích nhằm gia tăng thời gian sống cho bệnh nhân ung thư [32-35] Đột biến gen PT53 TP53 gen áp chế ung thư nằm đường tín hiệu p53 đóng vai trò quan trọng việc trì tính ổn định gen tác động yếu tố có hại thương tổn DNA, giảm oxy máu, rối loạn chuyển hóa hay tăng cường hoạt động gen sinh ung thư [36] Gen TP53 nằm vị trí p13.1 nhiễm sắc thể số 17 Khi hoạt động, TP53 có tác dụng sửa chữa thương tổn DNA, thúc đẩy chết tế bào thương tổn DNA khơng thể sửa chữa Ngồi p53 kiểm soát nhiều hoạt động chức khác tế bào thông qua tăng cường hay ức chế chép loạt gen đường tín hiệu p53 Chính vậy, p53 xem trạm gác gen tế bào (guardian genome) [36,37] Tỷ lệ đột biến gen TP53 u nguyên bào thần kinh dao động từ 35-40%, tỷ lệ cao khối u thứ phát phát triển từ u thần kinh đệm có mức độ ác tính thấp [38] Đột biến gen TP53 u nguyên bào thần kinh đệm hầu hết đột biến điểm nằm rải rác toàn chiều dài gen PT53 tập trung chủ yếu ba mã hoá codon-175, -248 -273 [39,40] Các dạng đột biến chứng minh có vai trò quan trình tiến triển xâm lấm ung thư [41] Chính việc xác định đột biến gen TP53 xem marker quan trọng đánh giá tiên lượng điều trị bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm Hình 1.4 Hình ảnh minh hoạ phân bố tần suất đột biến gen TP53 bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm Nguồn: The UMD p53 database Đột biến đa hình thái đơn gen RTEL1 Hes3.Nhiều nghiên cứu giới thống kê thành viên gia đình bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm có nguy cao mắc loại ung thư số loại hình ung thư khác Điều gợi ý đến tính nhạy cảm gen hình thành phát triển ung thư [42] Với thành công kiện giải mã gen người, nhà khoa học chứng minh đột biến đa hình thái đơn (single nucleotide polymorphism, SNPs) yếu tố quan trọng định đến tính nhạy cảm gen Hiện tượng đa hình thái đơn khác trình tự DNA xảy nucleotide đơn - A, T, C hay G - gen khác cá thể loài hay cặp NST người Trong u nguyên bào thần kinh đệm, nhà khoa học tìm thấy dạng đột biến đa hình thái đơn rs6010620 rs2297440 gen RTEL1 [43,44] Đây gen có tác dụng trì ổn định gen, nằm nhiễm sắc thể số 20 vị trí q13.3 Các dạng SNPs chứng minh yếu tố nguy hình thành tiến triển u nguyên bào thần kinh, đặc biệt thành viên gia đình bệnh nhân Ngồi bệnh nhân điều trị việc xác định dạng SNPs yếu tố đánh giá tiên lượng theo dõi hiệu điều trị [44,45] Bên cạnh số dạng đột biến đa hình thái đơn gen Hes3 nghiên cứu Gen Hes3 nằm nhiễm sắc thể số vị trí p36.31, quy định tổng hợp yếu tố điều hoà liên quan đến phân chia chết theo chương trình tế bào thần kinh, đặc trưng tế bào ung thư Các dạng SNPs Hes3 bao gồm: rs6304634 rs6304696 [46,47] Tuy nhiên vai trò SNPs gen Hes3 u nguyên bào thần kinh khác chủng tộc người Chính chúng tơi khảo sát vai trò SNPs gen Hes3 bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm Việt Nam 1.2 Các phương pháp xác định đột biến gen 1.2.1 Kỹ thuật polymerase chain reaction (PCR) Nguyên tắc chung: dựa vào hoạt tính DNA polymerase có khả tổng hợp mạch DNA từ mạch DNA khuôn, với nguyên liệu bốn loại nucleotid Phản ứng đòi hỏi có mặt mồi xi mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu trình tự DNA khn.Phản ứng PCR chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, chu kỳ gồm ba bước: Bước 1: giai đoạn biến tính (denaturation), phân tử DNA biến tính nhiệt độ cao Tm (nhiệt độ nóng chảy) phân tử, thường 94 oC - 95oC vòng 30 giây - phút Bước 2: giai đoạn bắt cặp (annealing) Nhiệt độ hạ thấp cho phép mồi bắt cặp với khuôn, dao động khoảng 40 oC - 70oC, tuỳ thuộc Tm mồi sử dụng kéo dài khoảng 30 giây - phút Bước 3: giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension) Nhiệt độ tăng lên 72oC để DNA polymerase polymerase chịu nhiệt (Taqpolymerase, Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động tổng hợp tốt Thời gian phụ thuộc vào độ dài trình tự chuỗi DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút 10 Sau chu kỳ chuỗi đôi DNA tạo thành tiếp tục dùng làm DNA để tổng hợp DNA chu kỳ Sản phẩm cuối phản ứng PCR đoạn DNA mạch kép có chiều dài khoảng cách hai đoạn gen mồi, hai đầu tận sản phẩm xác định đầu tận 5’ hai đoạn gen mồi [18], [19], [20] Số lượng sản phẩm DNA tạo thành hoàn thành phản ứng PCR biểu thị công thức sau: N = 2n N: số lượng copy sản phẩm tạo thành n số chu kỳ phản ứng Hình 1.5 Các bước kỹ thuật PCR (Nguồn: quora.com) 1.2.2 Kỹ thuật giải trình tự gen Giải trình tự gen phương pháp xác định vị trí xếp nucleotid phân tử DNA Đoạn DNA cần giải trình tự sử dụng trình tự mẫu cho phản ứng khuếch đại gen (PCR) vị trí gắn mồi Hỗn hợp deoxy- dideoxynucleotid sử dụng phản ứng với nồng độ cho dideoxynucleotid gắn vào vị trí mà deoxynucleotid thường gắn đoạn DNA tổng hợp.Sự gắn dideoxynucleotidsẽ làm gián đoạn trình kéo dài đoạn DNA tổng hợp, kết tạo hỗn hợp sợi DNA 31 D) E) Hình 3.10 Hình ảnh minh họa kết giải trình tự gen exon (A), exon (B), exon (C), exon (D) exon (E) gen TP53 bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm Nhận xét: Kết giải trình tự rõ nét, đỉnh tín hiệu rõ ràng, khơng bị nhiễu, tín hiệu thấp Kết thu tương ứng với kết giải trình tự so sánh với GenBank Tuy nhiên, kết giải trình tự gen TP53 60 mẫu bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm không phát đột biến exon 5, exon 6, exon 7, exon 8, exon Gen áp chế ung thư TP53 đóng vai trò quan trọng việc trì tính ổn định gen tác động yếu tố có hại thương tổn DNA, giảm ơxy huyết, rối loạn chuyển hóa hay tăng cường hoạt động gen sinh ung thư… TP53 hoạt động yếu tố điều hòa bám vào vị trí đặc hiệu DNA để kiểm sốt q trình chép gen TP53 tương tác với nhiều protein 32 khác tế bào để ức chế tăng sinh mạch máu, thúc đẩy chết theo chương trình tế bào hạn chế khả phát sinh phát triển ung thư Mức độ biểu hoạt động chức TP53 tế bào kiểm soát chặt chẽ nhiều enzym khác Khi tín hiệu ngoại bào tác động vào thụ thể đường tín hiệu TP53 dẫn đến phosphorylation, acetylation, ubiquitylation hay methylation vùng đặc hiệu phân tử TP53 làm hoạt hóa chức TP53 Khi hoạt động, TP53 kiểm soát nhiều hoạt động chức tế bào thông qua tăng cường hay ức chế chép loạt gen đường tín hiệu TP53 Đột biến gen TP53 đồng hợp tử (homozygous) dị hợp tử (heterozygous), đột biến dẫn đến thay đổi chức TP53 Kỹ thuật giải trình tự gen áp dụng rộng rãi với độ xác cao để phát hầu hết dạng đột biến (mất đoạn, thêm đoạn, thay nucleotid…) Nguyên vật liệu để nghiên cứu có sẵn hầu hết phòng thí nghiệm làm Tuy nhiên, kỹ thuật có số hạn chế như: trường hợp gen dài phải nhiều phản ứng giải trình tự tốn Nếu sản phẩm PCR khơng đặc hiệu, có nhiều sản phẩm phụ ảnh hưởng trực tiếp đến kết giải trình tự làm cho tín hiệu nhiễu khơng đọc kết Kỹ thuật giải trình tự đòi hỏi qua nhiều bước nên tốn thời gian, khó áp dụng bệnh cần chẩn đoán sớm Mặc dù nhiều nhược điểm kỹ thuật giải trình tự kỹ thuật áp dụng nhiều nghiên cứu Để đạt hiệu nghiên cứu cần kết hợp nhiều phương pháp để đem lại hiệu tối đa giúp cho nghiên cứu trở nên dễ dàng Sản phẩm PCR mẫu bệnh nhân sau giải trình tự phân tích kết phần mềm CLC Genomics Workbench 9.0 cho thấy đỉnh tín hiệu rõ ràng, có mức tín hiệu thấp, bị nhiễu, chứng tỏ kết thu đáng tin cậy Nghiên cứu tiến hành 60 mẫu bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm không phát đột biến exon đến exon gen TP53 Theo nghiên cứu Shoji Shiraishi cộng (năm 2002) 123 bệnh nhân, tỷ lệ đột biến gen TP53 bệnh nhân U nguyên bào thần kinh đệm 31%, 33 82% đột biến sai nghĩa, 43% xảy “hot spot” Trong số đột biến sai nghĩa, 86% đột biến thay nucleotid [48] Năm 2006, Julie Nagpal cộng công bố nghiên cứu với tỷ lệ đột biến gen TP53 bệnh nhân U nguyên bào thần kinh đệm nguyên phát 28% thứ phát 65% Trong số đột biến sai nghĩa, 86% đột biến thay nucleotid [49] 3.5 Xác định đa hình đơn gen Hes3 3.5.1 Kết khuếch đại sản phẩm PCR gen Hes3 Gen Hes3 nằm vùng 6244192-6245578 nhiễm sắc thể 1, với chiều dài 1386bp [Chromosome 1, NC_000001.11 (6244192 6245578)] Trong nghiên cứu tiến hành giải trình tự tồn gen Hes3 với mục đích tìm số điểm đa hình từ so sánh nhóm chứng nhóm bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm Việt Nam DNA sau tách chiết khuếch đại, sản phẩm PCR điện di gel agarose 1,5%.Sau kiểm tra chất lượng tinh sản phẩm PCR, nhóm nghiên cứu tiến hành giải trình tự đoạn gen khuếch đại 60 mẫu bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm máy giải trình tự tự động Kết phân tích phần mềm CLC Genomics Workbench 9.0 34 A) B) Hình 3.11 Hình ảnh minh họa kết giải trình tự gen Hes3 mẫu chứng (A) mẫu bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm (B) Tuy nhiên, kết giải trình tự vùng gen Hes3 60 mẫu bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm nhóm chứng khơng phát đột biến điểm đa hình Với thành cơng kiện giải mã gen người, nhà khoa học chứng minh đột biến đa hình thái đơn (single nucleotide polymorphism, SNPs) yếu tố quan trọng định đến tính nhạy cảm gen Hiện tượng đa hình thái đơn khác trình tự DNA xảy nucleotide đơn - A, T, C hay G - gen khác cá thể 35 loài hay cặp NST người Các dạng SNPs chứng minh yếu tố nguy hình thành tiến triển u nguyên bào thần kinh, đặc biệt thành viên gia đình bệnh nhân Ngồi bệnh nhân điều trị việc xác định dạng SNPs yếu tố đánh giá tiên lượng theo dõi hiệu điều trị Gen Hes3 nằm nhiễm sắc thể số vị trí p36.31, quy định tổng hợp yếu tố điều hoà liên quan đến phân chia chết theo chương trình tế bào thần kinh, đặc trưng tế bào ung thư Vai trò SNPs gen Hes3 u nguyên bào thần kinh khác chủng tộc người Chính nghiên cứu chúng tơi tiến hành khảo sát để tìm điểm đa hình bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm Việt nam, tiến hành xác định đa hình gen Hes3, kinh phí hạn chế, tiến hành nghiên cứu 60 mẫu chứng mẫu bệnh nhân kỹ thuật giải trình tự gen, kỹ thuật đắt tiền Tuy nhiên, chúng tơi chưa tìm thấy điểm đa hình nhóm chứng nhóm bệnh, điều cỡ mẫu nghiên cứu hạn chế, cần tiến hành nghiên cứu với cỡ mẫu lớn 36 IV KẾT LUẬN Qua nghiên cứu phát đột biến đa hình số gen 60 bệnh nhân mắc bệnhh u nguyên bào võng mạc, nghiên cứu rút số kết luận sau: Đột biến gen FGFR: 5/60 mẫu có đột biến gen FGFR Trong đó, mẫu phát thấy đột biến exon 12, mẫu phát thấy đột biến exon 13 Dạng đột biến chiếm tỷ lệ cao R576W exon 13, nghiên cứu phát bệnh nhân có đột biến N546K exon 12 Ngồi ra, nghiên cứu phát thấy 01 đột biến A575V exon 13 Đột biến gen EGFR: Nghiên cứu phát 7/60 mẫu có đột biến xóa đoạn chiếm tỉ lệ 11,6% Đối với đột biến điểm, 8/60 mẫu phát chiếm tỉ lệ 13,3% Trong đó, 4/60 mẫu phát thấy đột biến exon chiếm tỉ lệ 36%, 6/60 mẫu phát thấy đột biến exon chiếm tỉ lệ 64% Xác định đa hình đơn SNPrs6010620, SNPrs2297440 gen RTEL1: - Không thấy khác biệt tỷ lệ kiểu gen TT,TC SNPSNPrs6010620 AA, GA củaSNPrs 2297440 gen RTEL1giữa nhóm bệnh nhóm chứng - Kiểu gen CC SNPrs6010620 gặp nhiều nhóm bệnh (p=0,02) - Kiểu gen GG SNPrs2297440 gặp nhiều nhóm bệnh (p=0,02) - Tỷ lệ phân bố kiểu gen CC GG nhóm bệnh u nguyên bào thần kinh đệm nhóm chứng có khác biệt có ý nghĩa (p = 0,009) CC GG gặp nhiều nhóm bệnh Đột biến gen PT53 Hes3: Không phát thấy đột biến đa hình gen 60 mẫu bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Siegel R, Naishadham D, Jemal A Cancer statistics, 2012 CA Cancer J Clin 2012, 62, 10-29 Siegel R, Naishadham D, Jemal A Cancer statistíc, 2012 CA Cancer J Clin, 62, 10-29 Cancer Facts & Figures Annual publication of the American Cancer Society www.cancer.org/acs/groups/content/@nho/document/acspc-024113.pdf Chin L, Andersen JN et al Cancer genomics: from discovery science to personalized medicine Nat Med 2011, 17(3), 297-303 Lander ES Initial impact of the sequencing of the human genome Nature 2011, 470(7333), 187-197 Vogelstein B, Kinzler KW Cancer genes and the pathways they control Nat Med 2004, 10(8), 789-799 Hanahan D, Weinberg RA The hallmarks of cancer Cell 2000; 100:57-70 Stratton MR, Campell PJ, Futreal PA The cancer genome Nature; 2009;458:719-24 Karpel-Massler G, et al Therapeutic inhibition of the epidermal growth factor receptor in high-grade gliomas: where we stand? Mol Cancer Res 2009;7(7):1000-1012 10 Weingerg RA The biology of Cancer Garland Science; New York:2007 p796 11 Furnari FB, Fenton T, et al Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment Genes Dev 2007; 21 (21): 2683-2710 12 Network Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways Nature 2008; 455 (7216): 1061-1068 13 Cancer Genome Atlas Research Network Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways Nature 2008; 455: 1061-1068 14 Lemmon MA, Schlessinger J Cell signaling by receptor tyrosine kinase Cell 2010; 141: 1117-34 15 Johnson MA, Williams LT Structure and functional diversity in the FGF receptor multigene family Adv Cancer Res 1993; 60: 1-41 16 Ornitz DM, Xu J, et al Receptor specificity of the fibroblast growth factor family J Biol Chem 1996; 271: 15292-7 17 Furnari FB, Fenton T, et al Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment Genes Dev 2007; 21 (21): 2683-2710 18 Network Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways Nature 2008; 455 (7216): 1061-1068 19 Eswarakumar VP, Lax I, Schlessinger J Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors Cytokine Growth Factor Rev 2005; 16: 139-49 20 Tuner N, Grose R Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer Nat Rev Cancer 2010; 10: 116-29 21 Beenken A, Mohammadi M The FGF family: biology, pathophysiology and therapy Nat Rev Drug Discov 2009; 8: 235-53 22 Devendra Singh, Joseph MC, Pỉtro Z (2012) “Transforming fusion of FGF and TACC genes in human glioblastoma” National Institutes of Health, US, pp1231-1235 23 Rand V, Huang J et al Sequence survey of receptor tyrosine kinases reveals mutations in glioblastomas Proc Natl Acad Sci USA 2005; 102, 14344-9 24 Parsons DW et al An integrated genomic analysis of human glioblastoma multiforme Science 2008; 321: 1807-1812 25 Presta M, Dell’Era P et al Fibroblas growth factor/fibroblast growth factor receptor system in angiogenesis Cytokine Growth Factor Rev 2005;16: 159-78 26 Schlessinger J, Plotnikov AN et al Crystal structure of a ternary FGF-FGFRheparin complex reveals a dual role for heparin in FGFR binding and dimerization Mol Cell 2000; 6: 743-50 27 Wells A, EGF receptor Int J Biochem Cell Biol 1999; 31 (6): 637-643 28 Frederick L, Wang AH et al Diversity and frequency of epidermal growth factor receptor mutations in human glioblastomas Cancer Res 2000; 60 (5):1383-1387 29 Gan HK Kaye AH, Luwor RB The EGFRvIII variant in glioblastoma multiforme J Clin Neurosci 2009; 16(6): 748-754 30 Huang PH, Mukasa A et al Quantitative analysis of EGFRvIII cellular signaling networks reveals a combinationtorial therapeutic strategy for glioblastoma Proc Acad Sci USA 2007; 104 (31): 12867-12872 31 Nishikawa R, Ji XD et al A mutation epidermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumorigenicity Proc Natl Acad Sci 1994; 91(16): 7727-7731 32 Shinojima N, Tada K et al Prognostic value of epidermal growth factor receptor in patients with glioblastoma multiforme Cancer Res 2003; 63(20): 6962-6970 33 Nagane M, Coufal F et al A common mutant epidermal growth factor receptor confers enhanced tumorigenicity on human glioblastoma cells Cancer Res 1996; 56 (21): 5079-5086 34 Mischel PS, Cloughesy TF Targeted molecular therapy of GBM Brain Pathol 2003; 13(1):52-61 35 Nishikawa R et al A mutant epidermal growth factor receptor common in human glioma confers enhanced tumorigenicity Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91:7727-7731 36 Rich JN, Bigner DD Development of novel targeted therapies in the treatment of malignant glioma Nat Rev Drug Discov 2004; 3(5):430-446 37 Mellinghoff IK, Wang MY et al Molecular determinants of the response of the glioblastmas to EGFR kinase inhibitors N Engl J Med 2005; 353 (19): 2012-2024 38 Hollstein D et al p53 mutations in human cancers Science; 1991; 253:49-53 39 Dittmer D et al Gain of function mutations in p53 Nat Genet 1993; 4:42-46 40 Watanabe K et al Overexpression of the EGF receptor and p53 mutations are mutually exclusive in the evolution of primary and secondary glioblastomas Brain Pathol 1996; 6: 217-223 41 Sung T, Miller DC et al Preferential inactivation of the p53 tumor suppressor pathway and lack of EGFR amplification distinguish de novo high grade pediatric astrocytomas from de novo adult astrocytomas Brain Pathol 2000; 10: 249-259 42 Parson DW et al An intergrated genomic analysis of human glioblastoma multiforme Science 2008; 321:1807-12 43 Schwartzbaum J et al Polymorphism associated with asthma are inversely related to glioblastoma multiforme Cancer Res 2005; 65:6459-6465 44 Liu Y, Etzel CJ et al Polymorphisms of LIG4, BTBD2, HMGA2 and RTEL1 genes involved in the double-straind break repair pathway predict glioblastoma survival Journal of clinical oncology 2010; 28,14 45 Liu Y et al Tagging SNPs in non-homologous end-joining pathway genes and risk of glioma Carcinogenesis 2007; 28:1906-1913 46 Bethke L et al Comprehensive analysis of the role of DNA repair gene polymorrphisms on the risk of glioma Hum Mol Genet 2008; 17: 800-805 47 Deric M, Park Jinkyu Jung, Jimmy Masjkur (2013) Hes3 reglates cell number in cultures from glioblastoma multiforme with stem cell characteristics www.nature.com/scientificreports 48 Shoji Shiraishi, et al (2002) Influence of p53 mutations on prognosis of patients with glioblastoma Cancer, 95(2), 249-257 49 Nagpal J, et al (2006) Revisiting the role of p53 in primary and secondary glioblastomas Anticancer Res, 26(6C), 4633-9 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ I- CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 Cơ chế bệnh sinh bệnh u nguyên bào thần kinh đệm .3 1.1.1 Các yếu tố nguy 1.1.2.Cơ chế bệnh sinh .3 1.2 Các phương pháp xác định đột biến gen 1.2.1 Kỹ thuật polymerase chain reaction (PCR) 1.2.2 Kỹ thuật giải trình tự gen 10 II- ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Đối tượng nghiên cứu .13 2.2 Dụng cụ, trang thiết bị hóa chất sử dụng nghiên cứu 13 2.2.1 Trang thiết bị nghiên cứu 13 2.2.2 Dụng cụ nghiên cứu 14 2.2.3 Hóa chất nghiên cứu .14 2.3 Phương pháp nghiên cứu: 15 2.3.1 Thu thập mẫu nghiên cứu: 15 2.3.2 Quy trình tách chiết DNA 15 2.3.3 Xác định nồng độ độ tinh DNA tổng số sau tách chiết .16 2.3.4 Các quy trình kỹ thuật xác định đột biến gen .16 2.3.5 Kỹ thuật giải trình tự gen 18 2.4 Xử lý số liệu .18 2.5 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 18 III- KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 19 3.1 Kết xác định đột biến gen FGFR 19 3.2 Kết xác định đột biến gen EGFR 22 3.3 Xác định đa hình đơn SNPrs6010620, SNPrs2297440 gen RTEL1.27 3.3.1 Kết xác định đa hình SNPrs6010620 nhóm bệnh nhóm chứng 27 3.3.2 Kết xác định đa hình SNPrs2297440 nhóm bệnh nhóm chứng 28 3.4 Kết xác định đột biến gen TP53 29 3.5 Xác định đa hình đơn gen Hes3 33 3.5.1 Kết khuếch đại sản phẩm PCR gen Hes3 .33 IV KẾT LUẬN 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần điều kiện tham gia phản ứng PCR 17 Bảng 2.2 Thành phần điều kiện tham gia phản ứng PCR 17 Bảng 3.3 Tỷ lệ kiểu gen SNPrs6010620 gen RTEL1 27 Bảng 3.4 Tỷ lệ kiểu gen SNP SNPrs2297440 .28 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc, vị trí hoạt động đường tín hiệu thơng qua thụ thể yếu tố phát triển nguyên bào sợi FGFRs Hình 1.2 Đột biến gen FGFRs bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm Hình 1.3 Đột biến gen EGFR bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm Hình 1.4 Hình ảnh minh hoạ phân bố tần suất đột biến gen TP53 bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm .8 Hình 1.5 Các bước kỹ thuật PCR 10 Hình 1.6 Quy trình giải trình tự theo phương pháp ddNTP 11 Hình 3.1 Tỉ lệ đột biến exon (A) tỉ lệ dạng đột biến (B) gen FGFR .20 Hình 3.2 Đột biến gen FGFRs bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm 21 Hình 3.3 Kết xác định đột biến xóa đoạn exon Giếng M: Marker 100bp Giếng GB20, GB21, GB25, GB26, GB38, GB40, GB43, GB44 mẫu bệnh nhân U nguyên bào võng mạc, (-) mẫu chứng âm, (+) mẫu chứng dương 22 Hình 3.4 Tỉ lệ đột biến exon exon gen EGFR 24 Hình 3.5 Tỉ lệ đột biến đơn đột biến kép exon exon .24 Hình 3.6 Tỉ lệ dạng đột biến gen EGFR .25 Hình 3.7 Đột biến gen EGFR bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm 26 Hình 3.8 Tỷ lệ kiểu gen SNPrs6010620 nhóm bệnh nhóm chứng 27 Hình 3.9 Tỷ lệ kiểu gen SNPrs2297440 nhóm bệnh nhóm chứng 28 Hình 3.10 Hình ảnh minh họa kết giải trình tự gen exon (A), exon (B), exon (C), exon (D) exon (E) gen TP53 bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm 31 Hình 3.11 Hình ảnh minh họa kết giải trình tự gen Hes3 mẫu chứng (A) mẫu bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm (B) .34 5,6,8,10,11,20,21,22,24-28,30,31,34 1-4,7,9,12,13-19,23,29,32,33,35- ... tượng nghiên c u Nhóm bệnh: Nhóm bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm Ti u chuẩn lựa chọn: 60 bệnh nhân chẩn đoán xác định mô bệnh học Bệnh viện Việt Đức u nguyên bào thần kinh đệm Ti u chuẩn loại... TỔNG QUAN TÀI LI U 1.1 Cơ chế bệnh sinh bệnh u nguyên bào thần kinh đệm 1.1.1 Các y u tố nguy Y u tố di truyền: y u tố di truyền có tác động vào xuất số loại u não u nguyên bào võng mạc u thần kinh. .. m u da hay vị trí địa lý ngun nhân gây nên sai khác vị trí đột biến ki u đột biến exon exon gen EGFR bệnh u nguyên bào thần kinh đệm 26 Hình 3.7 Đột biến gen EGFR bệnh nhân u nguyên bào thần kinh