Đang tải... (xem toàn văn)
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH VIRUS CỦA CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.) CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi 1.Thesis title: Evaluation virus resistant ability of transgenic tobacco (Nicotiana tabacum L.) containing RNAi construct. 2.Objective 1) To obtain CP gene of pathogenic strain of Tobacco mosaic virusTMV for designing structural RNAi transformation vector. 2) To construct RNAi vectors carrying single gene of TMV or multifragment of multiple virus (Tobacco mosaic virus, Cucumber mosaic virusCMV, Tomato yellow leaf curl virusTYLCV and Tomato spotted wilt virusTSWV). 3) To develop transgenic lines of tobacco resistant to virus.
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH VIRUS CỦA CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.) CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AGO ATP bp CP Protein Argonaute Adenosin triphosphat Base pair Coat protein (protein vỏ) CMV Cucumber mosaic virus DNA Kb kDa RNA RNas Deoxyribonucleic acid Kilobase Kilodalton Ribonucleic acid Ribonuclease TMV TSW Tobacco mosaic virus Tomato spotted wilt e V virus TYL CV Tomato yellow leaf curl virus MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .1 LỜI CAM ĐOAN Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây thuốc bệnh virus gây hại 1.1.1.Giới thiệu thuốc 1.1.1.1 Nguồn gốc, phân loại 1.1.1.2 Đặc điểm sinh học 1.1.1.3 Ý nghĩa khoa học tình hình sản xuất thuốc nguyên liệu 11 1.1.2.Bệnh virus hại thuốc 12 1.1.2.1 Giới thiệu chung bệnh hại thuốc 12 1.1.2.2 Virus gây bệnh thuốc 13 1.1.2.3 Biện pháp phòng trừ bệnh virus thuốc 20 1.2 .Giới thiệu công nghệ RNAi 27 1.2.1.Lược sử nghiên cứu 27 1.2.2.Cơ chế hoạt động RNAi thực vật 29 1.2.2.1 Cơ chế hoạt động RNAi 30 1.2.3 Đặc điểm vai trò chế RNAi 34 1.3 .Ứng dụng RNAi tạo chuyển gen kháng virus 35 1.3.1.Ứng dụng RNAi tạo trồng kháng loại virrus 35 Bảng 2.1 Thành phần phản ứng cắt 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 145 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1 Hình ảnh mẫu bệnh biểu triệu chứng bệnh khảm thuốc Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR khuếch đại đoạn gen MP-CP (A) phần RdRp (B) TMV gel agarose 1% .4 Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR chọn dòng khuẩn lạc dương tính Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm tách chiết plasmid tái tổ hợp (A) sản phẩm cắt enzyme cắt giới hạn Bam HI (B) dòng khuẩn lạc mang pBT/RdRp-TMV Hình 3.5 Hình ảnh tổng hợp số trình tự gene CP TMV số dòng thu thập vùng khác nước 10 Hình 3.6 Hình ảnh so sánh trình tự amino acid đoạn gen CP phân lập mẫu TMV Việt Nam 10 Hình 3.7 Cây phát sinh chủng loại dựa vào trình tự nucleotide gen CP TMV Việt Nam 11 Hình 3.8 Hình ảnh so sánh trình tự amino acid đoạn gen MP phân lập mẫu TMV Việt Nam 12 Hình 3.9 Cây phát sinh chủng loại dựa vào trình tự nucleotide gen MP TMV Việt Nam 13 Hình 3.10 Hình ảnh so sánh trình tự amino acid đoạn gen RdRp TMV Việt Nam 14 Hình 3.11 Hình ảnh so sánh trình tự amino acid đoạn gen RdRp TMV Việt Nam 16 Hình 3.12 Hình ảnh khuẩn lạc E coli DB3.1 mơi trường chọn lọc .17 Hình 3.13 Kết điện di sản phẩm tách chiết plasmid pK7GWIWG2(II) .17 Hình 3.14 Kết điện di sản phẩm cắt plasmid pK7GWIWG2(II) enzyme Sph I 18 Hình 3.15 Kết điện di sản phẩm tách chiết plasmid pNOV-gusplus 19 Hình 3.16 Kết điện di sản phẩm cắt plasmid pNOV-gusplus Pme I Hind III 19 Hình 3.17 Bản đồ cấu trúc vector pK7M 21 Hình 3.18 Kết điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen CP TMV 23 Hình 3.19 Ảnh điện di sản phẩm ghép nối tạo đoạn gen đa đoạn TCYS 24 Hình 3.20 Kết điện di sản phẩm colony-PCR chọn dòng khuẩn lạc mang pENTR-TMV 25 Hình 3.21 Kết điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp pK7M-TMV (A), pK7M-TCYS (B) enzyme Xba I Hind III 27 Hình 3.22 Kết điện di sản phẩm colony-PCR chọn dòng khuẩn lạc mang pK7M-TMV 28 Hình 3.23 Ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid tách chiết từ A.tumefacien enzyme giới hạn Xba I Hind III 30 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Thuốc (Nicotiana tabacum L.) cơng nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế cao đem lại nguồn thu ngân sách đáng kể cho nhiều quốc gia giới Việc trồng sản xuất thuốc thu hút nhiều nhân công, góp phần tạo cơng ăn việc làm thu nhập cho nhiều đối tượng lao động Không để sản xuất thuốc lá, sử dụng làm ngun liệu sản xuất nicotin, axit hữu cơ, dùng làm thuốc trừ sâu hay chiết xuất dầu thực vật từ hạt Ngồi ra, thuốc xem mơ hình cho nhiều nghiên cứu sinh học nghiên cứu trình trao đổi chất thực vật, hay vai trò, chức gen protein,… Với khả dễ tái sinh chấp nhận gen ngoại lai, thuốc mơ hình cho nghiên cứu mang tính ứng dụng sản xuất vacine thực vật hay dược liệu, làm nguồn nhiên liệu sinh học thay Tuy nhiên, với đặc điểm sinh học mình, thuốc trồng mẫn cảm với nhiều bệnh hại, đặc biệt bệnh virus gây nên, ảnh hưởng nghiêm trọng đến suất chất lượng thuốc Trong đó, số loại virus gây hại phổ biến kể đến là: TMV (Tobacco mosaic virus) TSWV (Tomato spotted wilt virus), Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), Cucumber mosaic virus (CMV) Khi nhiễm virus, thiệt hại suất lên tới 95-100% Cho đến chưa có loại thuốc bảo vệ thực vật có khả chống lại bệnh virus gây trồng Con người hạn chế tác hại virus kiểm sốt mức độ định thơng qua số biện pháp thông dụng sử dụng giống kháng bệnh, giống bệnh, biện pháp canh tác,… Song biện pháp mang tính chất phòng trừ, đòi hỏi nhiều thời gian cơng sức, hiệu kinh tế thấp Hiện nay, với tiến lĩnh vực sinh học, người ta tạo số loại trồng kháng bệnh virus gây thông qua biện pháp tạo trồng chuyển gen mang gen đoạn gen có nguồn gốc từ virus gây bệnh (Reddy el al., 2009) Cho tới năm cuối kỷ 20, cấu trúc dạng kẹp tóc (ihpRNA) hay kỹ thuật RNAi xem kỹ thuật đại hữu hiệu việc chống lại bệnh virus gây thực vật Bên cạnh đó, việc thay gen chọn lọc gây nên lo lắng độ an toàn với sức khỏe người môi trường gen kháng lại kháng sinh hygromycin (hpt) kanamycin (nptII) kháng lại chất diệt cỏ phosphinothricin (bar) chlorosulfuron (als) hệ gen chọn lọc tích cực, thân thiện với mơi trường vấn đề quan tâm nghiên cứu chuyển gen vào thực vật Ở Việt Nam, thuốc trồng phổ biến tỉnh miền núi trung du phía Bắc, tỉnh Nam Trung Bộ, Tây Nguyên miền Đông Nam Bộ đánh giá công nghiệp ngắn ngày, đem lại hiệu kinh tế cao cho nông dân thu nhập quốc gia Song bệnh hại (đặc biệt bệnh virus) đe dọa nghiêm trọng đến suất phẩm chất thuốc Và nghiên cứu việc tạo trồng chuyển gen kháng bệnh trồng chuyển gen vấn đề quan tâm thử nghiệm nước ta Xuất phát từ sở tiến hành đề tài “Nghiên cứu khả kháng bệnh virus thuốc (Nicotiana tabacum L.) chuyển gen mang cấu trúc RNAi” Mục tiêu nghiên cứu đề tài 1) Phân lập, đánh giá đa dạng di truyền TMV, xác định trình tự bảo thủ gen CP (coat protein) mã hóa cho protein vỏ TMV phục vụ cho thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi 2) Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi mang gen đơn đoạn TMV gen đa đoạn chứa trình tự gen đồng thời virus TMV, CMV, TYLCV TSWV 3) Tạo dòng thuốc chuyển gen kháng đơn virus kháng virus phổ rộng 4) Đánh giá khả kháng virus, mức độ an toàn sinh học, khả sinh trưởng dòng thuốc chuyển gen Nội dung nghiên cứu 1) Khảo sát, thu thập mẫu thuốc nghi nhiễm TMV vùng trồng thuốc nguyên liệu Việt Nam 2) Tách dòng, xác định trình tự gen, phân tích đa dạng di truyền TMV phân lập 3) Thiết kế vector mang cấu trúc RNAi chứa đơn gen TMV chứa gen đa đoạn virus TMV, CMV, TYLCV, TSWV sử dụng gen chọn lọc manA 4) Xác định ngưỡng chọn lọc mannose thích hợp hồn thiện quy trình chuyển gen vào giống thuốc K326 C9-1 sử dụng chất chọn lọc mannose 5) Tạo thuốc chuyển gen mang cấu trúc RNAi thiết kế phương pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens 6) Đánh giá khả kháng virus, mức độ an toàn sinh học tiêu liên quan đến suất, chất lượng dòng thuốc chuyển gen Đóng góp luận án - Luận án cơng trình Việt Nam có đánh giá đa dạng di truyền virus khảm thuốc cách toàn diện đoạn gen genome TMV - Luận án sử dụng gen chọn lọc thân thiện với môi trường thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi Tạo thuốc kháng virus phổ rộng, với việc kháng đồng thời virus gây hại phổ biến thuốc Khả kháng dòng chuyển gen di truyền ổn định đến T2 - Là cơng trình đầu thực việc đánh giá an toàn sinh học ảnh hưởng gen chuyển đến tiêu liên quan đến suất chất lượng dòng thuốc chuyển gen Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây thuốc bệnh virus gây hại 1.1.1 Giới thiệu thuốc 1.1.1.1 Nguồn gốc, phân loại Thuốc cơng nghiệp ngắn ngày có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Trong lịch sử, thuốc trồng châu Mỹ từ 6.000 năm trước công nguyên, sử dụng nghi lễ tôn giáo làm thuốc chữa bệnh (Daryl et al., 2000) Christopher Columbus, người tìm châu Mỹ vào cuối kỉ XV (năm 1492) người châu Âu biết đến thuốc Tuy nhiên, người mang thuốc từ châu Mỹ tới trồng châu Âu vào khoảng năm 1496-1498 lại Pano, nhà truyền đạo người Tây Ban Nha Sau nửa thập kỉ biết đến, thuốc có mặt nhiều nước châu Âu như: Bồ Đào Nha, Tây Ban Nha, Pháp, Anh, Nga,… Sau đó, vào khoảng cuối kỉ XVI, thuốc bắt đầu trồng châu Á châu Phi (Daryl et al., 2000) Ngày nay, với đặc điểm di truyền phong phú, dễ trồng, dễ chăm sóc thích ứng với nhiều vùng khí hậu khác nhau, thuốc trồng phổ biến 120 quốc gia giới với diện tích 4,5 triệu ha, trải dài từ 40 vĩ Nam đến 600 vĩ Bắc, tập trung nhiều vĩ độ Bắc Ở Việt Nam, thuốc du nhập vào từ sớm, khoảng kỉ thứ 17 từ thời vua Lê Thần Tông Tuy nhiên, ngành cơng nghiệp thuốc hình thành phát triển từ sau Cách mạng tháng Tám (Vũ Triệu Mân Lê Lương Tề, 1998) Hiện nay, thuốc trồng phổ biến tỉnh miền núi trung du phía Bắc, tỉnh Nam Trung Bộ, Tây Nguyên miền Đông Nam Bộ Virginia Bland Cash giống thuốc trồng nước ta Sau đó, qua q trình chọn tạo giống, ngày có nhiều giống khác đưa vào sản xuất Các giống trồng phổ biến tỉnh phía Bắc Cao Bằng, Lạng Sơn, Bắc Giang,… C.176, K.326 (giống nhập nội) giống chọn tạo nước gồm C7-1, C9-1, VTL5H C-83, K 51E, Coker 176, Burley Flue-Cured Virginia giống trồng phổ biến Nam Trung Bộ (Đỗ Đình Dũng et al., 2013) Theo phân loại Wilson Loomis (1967), thuốc thuộc họ cà (Solanaceae), hoa mõm sói (Scrophulariales) Thuốc thương mại (Nicotiana tabacum L.) loài thuộc chi Nicotiana, chi chia thành chi phụ, 14 phân chi 65 lồi Trong lồi Nicotiana tabacum L xếp vào chị phụ Tabacum, phân chi Geneuinae, loài gieo trồng phổ biến nhất, chiếm 90% diện tích trồng thuốc giới Lồi N tabacum L (hoa đỏ) lai từ loài N sylvertris Speg & Comes N tomentosiformis Goodspeed N octophora Nicotiana tabacum L chia thành loài phụ là: - Lồi phụ Oriental: nhóm có hàm lượng chất thơm đường cao, chất lượng tốt, dùng để sản xuất nên loại thuốc thơm hảo hạng giới - Lồi phụ American: có màu vàng sáng, chất lượng cao loại trồng phổ biến giới, chiếm 50% sản lượng với loại thuốc chủ yếu Virginia Burley - Lồi phụ Southern: có màu sậm, chất lượng sản lượng thấp - Loài phụ Island: có hàm lượng nicotin tương đối cao, khoảng 3%, dùng để sản xuất xì gà KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I KẾT LUẬN Đã giải trình tự 11 đoạn gene chứa CP MP TMV với kích thước đầy đủ gen 480 519 bp; 23 đoạn gene RdRp TMV với kích thước 663bp Thiết kế thành công vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi bao gồm vector mang gen đơn đoạn CP TMV (RNAi TMV) vector mang gen đa đoạn chứa trình tự gen ghép nối từ virus TMV, CMV, TYLCV TSWV (RNAi TCYS) Xác định ngưỡng chọn lọc mannose cho giai đoạn tái sinh thuốc in vitro 30 g/l Hoàn thiện quy trình chuyển gen vào thuốc sử dụng chất chọn lọc mannose, tỷ lệ chuyển gen thu giống K326 dao động từ 1719%, giống C9-1 9-11% Tạo 20/28 dòng thuốc K326 10/12 dòng C9-1 dương tính với gen chuyển cấu trúc RNAi TMV Kết tương ứng chuyển cấu trúc RNAi TCYS 28/36 20/28 dòng Tỉ lệ kháng TMV thu hệ T0 giống K326 C9-1 70,83% 70% Số T0 kháng hoàn toàn với virus 5/28 K326 2/20 C9-1 Tỉ lệ kháng virus hệ T1 dao động từ 5-20% Kết đánh giá phân li gen chuyển hệ T1 với dòng thuốc chuyển cấu trúc RNAi TMV thu dòng có tỉ lệ phân li 3:1 giống K326 143 C9-1 Số dòng phân li 3:1 cấu trúc đa đoạn dòng K326 dòng C9-1 Ở hệ T2, tìm dòng K326 dòng C9-1 đồng hợp tử gen chuyển CP TMV, dòng giống với cấu trúc đa đoạn Kết đánh giá an toàn sinh học suất, chất lượng dòng chuyển gen T2 cấu trúc cho thấy: Cây chuyển gen không làm ảnh hưởng đến xuất loài sâu hại, thiên địch, cỏ dại; Sự tồn cấu trúc gen chuyển không làm biến đổi khả sinh trưởng phát triển bình thường dòng thuốc mang gen II ĐỀ NGHỊ Các dòng thuốc chuyển gene kháng virus thử nghiệm mơ hình nhà lưới, quy mơ nhỏ, cần phải thử nghiệm trồng quy mô lớn hơn, nơi thường xuyên xảy dịch bệnh virus Lúc khẳng định thêm tính kháng ảnh hưởng sinh vật khác môi trường Tiếp tục phân tích đánh giá tính kháng virus dòng chuyển gen hệ 144 NHỮNG CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Phạm Thị Vân, Nguyễn Thị Thu Hiền, Lê Thị Thủy, Chu Hoàng Hà, Lê Văn Sơn (2012) Đánh giá thuốc chuyển gen kháng bệnh khảm TMV hệ T1 Hội nghị Nghiên cứu Giảng dạy sinh học Việt Nam: 794-800 Lê Thị Thủy, Nguyễn Thị Thu Hiền, Phạm Thị Vân, Lê Văn Sơn (2013) Thiết kế vector chuyển gen kháng virus mang gen chọn lọc thân thiện với mơi trường Tạp chí Sinh học 35(3se): 188-194 Nguyễn Thị Thu Hiền, Lê Thị Thủy, Nguyễn Văn Đoài, Phạm Thị Vân, Chu Hoang Hà, Lê Văn Sơn (2014) Đánh giá ổn định tính kháng số loại virus dòng thuốc chuyển gen đa đoạn Hội thảo Quốc gia Bệnh hại thực vật Việt Nam, 2: 34-41 Lê Thị Thủy, Nguyễn Thị Thái Hà, Nguyễn Thị Thu Hiền, Nguyễn Văn Đoài, Phạm Thị Vân, Lê Văn Sơn (2014) Đánh giá tính kháng virus, khả sinh trưởng tiêu hóa sinh số dòng thuốc chuyển gen hệ T1 Tạp chí Khoa học-ĐHQG, 30(1S): 226-234 Lê Thị Thủy, Nguyễn Thị Thu Hiền, Phạm Thị Vân, Chu Hoàng Hà, Lê Văn Sơn (2014) Tạo thuốc mang gen đa đoạn kháng virus TMV, CMV, TYLCV TSWV kĩthuật RNAi Tạp chí Khoa học ĐHQGHN 30(3): 58-67 145 SUMMARY 1.Thesis title: Evaluation virus resistant ability of transgenic tobacco (Nicotiana tabacum L.) containing RNAi construct 2.Objective 1) To obtain CP gene of pathogenic strain of Tobacco mosaic virus-TMV for designing structural RNAi transformation vector 2) To construct RNAi vectors carrying single gene of TMV or multifragment of multiple virus (Tobacco mosaic virus, Cucumber mosaic virus-CMV, Tomato yellow leaf curl virus-TYLCV and Tomato spotted wilt virus-TSWV) 3) To develop transgenic lines of tobacco resistant to virus 3.Contents 1) Surveying and sampling TMV-infected tobacco in 15 provinces in Vietnam Detection of the presence of TMV in the samples by PCR Cloning and sequence analyzing a coat protein gene Analysis of diverdity and genetic clustering of collected virus trains based on CP gene 2) Constructing vector carrying RNAi structures: single structure that carrying the CP gene of TMV and a structure that carrying partially functional gene of four harmful tobacco viruses in Vietnam which are TMV, CMV, TYLCV and TSWV Both RNAi contruct contain manA that encodes phosphomannose isomerase enzyme allowing using mannose for selection 3) Evaluating inhibition ability of mannose on tobacco regeneration was assessed through three stages: creating multi-shoot, elongating shoot, and rooting of such tobacco cultivars as K326 and C9-1 146 4) Transforming RNAi constructs into two Nicotiana tabacum cv K326 and C9-1 via Agrobacterium tumefaciens 5) Detection of the presence of the transgene in the regenerated plants by the PCR reaction 6) Testing the resistance of the transgenic plants in greenhouse and garden experiment 7) Evaluation biosafe, growth and biochemical parameter of transgenic tobacco lines at T2 generation Results 1) 186 samples of leaves of tobacco mosaic disease in 15 provinces in Vietnam have been surveyed and collected Analysis genetic diversity of TMV genome Having sequenced 11 gene fragment containing both CP and MP of TMV with full size of each gene were 480 and 519 bp; and 23 fragment RdRp of TMV RdRp with size is 663bp 2) Having designed binary carrying construct with inverted repeat transgene cassette , containing patial coat protein gene sequence of TMV and multifragment TCYS flanked by an intron 3) Identified mannose concentrations at 30 g/l and 20 g/l are suitable for creating multi-shoot of K326 and C9-1, respectively In addition, mannose concentration at 30 g/l in combination with 7,5 g/l sucrose is fit for elongating shoot while its concentration at 30 g/l is appropriate for rooting transgenic tobacco in both K326 and C9-1 cultivars The mannose selection of transgenic tobacco using gus gene showed that the transgenic effectiveness is ranging 16-17% of K326 and 911% of C9-1 cultivars 4) Two constructs RNAi TMV and RNAi TCYS were transformed into tobacco (cv K326 and C9-1) via A tumefaciens PCR Analysis of CP and TCYS transgenic K326 lines which regeneration on mannose selective medium using primers revealed 20 and 28 positive lines The corresponding results at transgenic C9-1 lines are 10 and 20 lines 147 5) The rate of resistance to TMV obtained at T0 of cultivar K326 and C9-1 respectively 70.83% and 70% Broad-spectrum antiviral ratio is 5/28 K326 lines and 2/20 C9-1 transgenic lines The rate of generation of antiviral T1 ranged from 520% 6) The results of biosafety, productivity and quality evaluation of transgenic tobacco lines at T2 generation showed that both two transgenes structures not affect the appearance of the pests, natural enemies , weed; The existence of the transgene structure does not alter the growth and normal development of the tobacco lines carrying transgenes 148 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Vũ Thị Bản, Tào Ngọc Tuấn (2005) Kết nghiên cứu chọn tạo số giống thuốc vàng sấy Viện Kinh tế Kỹ thuật thuốc lá, Kết nghiên cứu khoa học 2001-2005, Viện Kinh tế Kỹ thuật thuốc Nxb Nơng nghiệp: 40-46 Nguyễn Ngọc Bích Bùi Cách Tuyến (2005) Kết điều tra theo dõi tình hình sâu bệnh hại thuốc phía Nam, Kết nghiên cứu khoa học 20012005, Viện Kinh tế Kỹ thuật thuốc Nxb Nông nghiệp: 85-89 Nguyễn Văn Biếu, Nguyễn Văn Vân, Vương Chí Hiếu (2001) Thành phần sâu bệnh hại thuốc tỉnh phía Bắc Việt Nam, Kết nghiên cứu khoa học 1996 - 2000, Viện Kinh tế Kỹ thuật thuốc Nxb Nông nghiệp: 70-77 Nguyễn Mạnh Chinh, Nguyễn Đăng Nghĩa (2007) Trồng, chăm sóc phòng trừ sâu bệnh thuốc Nxb Nơng nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh Hà Viết Cường (2012) Bài giảng Virus thực vật, phytoplasma viroid Nxb Đại học Nơng nghiệp Đỗ Đình Dũng, Đào Đức Thức, Nguyễn Hồng Thái, Ngô Văn Dư (2013) Nghiên cứu chọn tạo giống thuốc vàng sấy kháng bệnh khảm TMV, Kết nghiên cứu khoa học 2005 - 2010, Viện Kinh tế kỹ thuật Thuốc Nxb Nông nghiệp: 34-42 Đỗ Tấn Dũng, Hà Viết Cường, Trần Nguyễn Hà (2012) Giáo trình Miễn dịch thực vật Nxb Đại học Nông nghiệp Ngô Mạnh Dũng, Chu Hồng Hà, Lê Văn Sơn (2014) Tách dòng xác định trình tự gen mã hóa protein vỏ (CP) virus gây bệnh xanh lùn (CLRDV) Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 119(05): 151-155 Nguyễn Xuân Dũng, Dương Hoa Xô, Nguyễn Thị Thanh Hảo, Chu Hoàng Hà (2015) Nghiên cứu chuyển gen RNAi qua trung gian Agrobacterium 149 tumefaciens vào Dendrobium Sonia để tạo giống kháng virus khảm vàng Tạp chí Khoa học Phát triển 13(2): 264-271 10 Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Tạ Kim Nhung, Trịnh Thị Minh Thùy, Hà Văn Chiến, Lê Thanh Nga, Lê Thị Thu Về, Lê Thị Thu Hiền, Nông Văn Hải, Lê Huy Hàm (2010) Kết bước đầu nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cryIA(c) vào phơi non dòng ngơ mơ hình Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 8(2): 173-180 11 Chu Hồng Hà, Đỗ Xn Đồng, Phạm Bích Ngọc, Lâm Đại Nhân, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình (2011) Nghiên cứu tạo giống đu đủ kháng bệnh đốm vòng ứng dụng chế RNAi Hội thảo quốc gia Bệnh hại thực vật Việt Nam: 316-326 12 Trần Thị Hồng Hà, Lưu Văn Chính, Lê Hữu Cường, Trần Thị Như Hằng, Đỗ Hữu Nghị, Trương Ngọc Hùng, Nguyễn Thị Nga, Lê Mai Hương (2013) Đánh giá hoạt tính sinh học polysaccharide hợp chất tách chiết từ nấm hương (Lentinus edodes) Tạp chí Sinh học 35(4): 445-453 13 Lê Huy Hàm, Phạm Thị Lý Thu (2014) Hệ thống quản lý an toàn sinh học trồng biến đổi gen Nxb Hà Nội 14 Tran Thi Cuc Hoa (2007) Assessment of the inhibition ability of mannose on soybean seed germination, shoot elongation and rooting for the establishment of a mannose selection system in soybean transformation Omorice 15: 21-28 15 Trần Thị Cúc Hòa, Bùi Bá Bổng (2003) Hiệu chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens lúa (Oryza sativa L.) sử dụng hệ thống chọn lọc mannose Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn 1+2: 60-63 16 Trần Đình Kiên (2011) Giáo trình Cây thuốc Nxb Nơng nghiệp, Hà Nội 17 Trần Đăng Kiên, Lê Việt Hùng, Hoàng Tự Lập, Tào Ngọc Tuấn, Đinh Văn Năng (2013) Hồn thiện qui trình cơng nghệ sản xuất hai giống thuốc lai VTL1H, VTL5H Cao Bằng Lạng Sơn, Kết nghiên cứu khoa học 2005 - 2010, Viện Kinh tế kỹ thuật Thuốc Nxb Nông nghiệp: 7-20 150 18 Phạm Văn Lầm (2005) Kỹ thuật bảo vệ thực vật Nxb Lao động 19 Hoàng Tự Lập, Nguyễn Hồng Quân, Kiều Văn Tuyển (2013) Sản xuất thử nghiệm giống thuốc VTL6H, VTL81 Cao Bằng, Lạng Sơn, Kết nghiên cứu khoa học 1986 - 1996, Viện Kinh tế Kỹ thuật thuốc Nxb Nông nghiệp: 20-34 20 Vũ Triệu Mân (2007) Bệnh chuyên khoa Nxb Đại học Nông nghiệp Hà Nội 21 Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề (1998) Giáo trình Bệnh nông nghiệp Nxb Nông nghiệp, Hà Nội 22 Đinh Văn Năng, Nguyễn Văn Cường, Mai Thu Hà, Vũ Minh Tân (2013) Xây dựng hồn thiện qui trình kỹ thuật sản xuất thuốc theo phương pháp khay lỗ tỉnh phía Bắc, Nghiên cứu sử dụng số mùn hữu làm giá thể phân bón sản xuất thuốc nguyên liệu Kết nghiên cứu khoa học 2010-2013, Viện Kinh tế Kỹ thuật thuốc lá: 117-130 23 Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Thị Thùy Linh (2011) Cây trồng công nghệ sinh học: Đánh giá an tồn mơi trường sức khỏe người Nxb Hà Nội 24 Lò Mai Thu, Lê Hồng Trang, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu (2014) Nghiên cứu tạo đậu tương chuyển gen kháng Soybean mosaic virus Bean yellow mosaic virus Tạp chí Khoa học Công nghệ 118(04): 111-115 25 Bùi Thanh Tùng, Hồng Minh Tấn, Nguyễn Đình Vinh (2013) Ảnh hưởng accotab đến khả diệt chồi, sinh trưởng, phát triển suất thuốc lào trồng Hải Phòng Tạp chí Khoa học Phát triển 11(4): 501-505 26 Nguyễn Văn Vân (2014) Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố nông sinh học đến sinh trưởng hoa giống thuốc K.326 trồng miền Bắc Việt Nam Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp Đại học Nông nghiệp Hà Nội 27 Phạm Thị Vân (2008) Tạo thuốc kháng bệnh virus khảm dưa chuột kỹ thuật RNAi Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 6(4A): 679-687 151 28 Phạm Thị Vân, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2009a) Cây thuốc chuyển gen mang cấu trúc RNAi kháng đồng thời hai loại virus gây bệnh khảm Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 7(2): 241-249 29 Phạm Thị Vân, Nguyễn Minh Hùng, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2009b) Xác định virus khảm dưa chuột (Cucumber mosaic virus-CMV) thuốc Cao Bằng Hà Tây thơng qua tách dòng giải trình tự gen mã hóa protein MP CP Tạp chí Khoa học Công nghệ 47(3): 1-7 30 Đỗ Năng Vịnh (2007) Công nghệ can thiệp RNA (RNAi) gây bất hoạt gen tiềm ứng dụng to lớn Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 5(3): 265-275 31 Đào Thị Xuân, Vũ Minh Tân, Nguyễn Xuân Toản (2012) Triển vọng dòng thuốc vàng sấy TL16 qua kết khảo nghiệm sản xuất vùng thuốc ngun liệu phía Bắc Tạp chí Khoa học cơng nghệ, Bộ Công thương 12: 32-34 32 Nguyễn Thị Hải Yến, Phạm Thị Vân, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu, Lê Trần Bình (2008) Phân lập gen mã hóa protrein vỏ virus gây bệnh xoăn vàng cà chua thu thập cà chua dại tỉnh Thái Ngun Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 6(4): 467-474 33 Nguyễn Thị Hải Yến, Phạm Thị Vân, Chu Hoàng Hà, Chu Hồng mậu, Lê Trần Bình (2009) Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả kháng virus gây bệnh xoăn cà chua Báo cáo hội nghị tồn quốc Cơng nghệ sinh học: 544-549 34 Nguyễn Thị Hải Yến, Phạm Thị Vân, Chu Hoàng Hà, Chu Hồng Mậu, Lê Trần Bình (2011) Tạo dòng cà chua P18 kháng bệnh xoăn vàng virus kỹ thuật RNAi Tạp chí Cơng nghệ sinh học 9(3): 333-340 35 Nguyễn Thị Hải Yến (2012) Nghiên cứu tạo cà chua kháng bệnh xoăn vàng virus kỹ thuật chuyển gen Luận án Tiến sĩ Sinh học Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam 152 36 Adai A, Johnson C, Mlotshwa S, Archer-Evans S, Manocha V, Vance V and Sundaresan V (2005) Computational prediction of miRNAs in Arabidopsis thaliana Geneome Res 15: 78-91 37 Ahmad M, Arif MI, Ahmad Z, Denholm I (2002) Cotton whitefly (Bemisia tabaci) resistance to organophosphate and pyrethroid insecticides in Pakistan Pest Manag Sci 58(2): 203-208 38 Ambros V, Bartel B, Bartel DP, Burge CB, Carrington JC, Chen X, Dreyfuss G, Eddy SR, Griffiths-Jones S, Marshall M, Matzke M, Ruvkun G, Tuschl T (2003) A uniform system for microRNA annotation RNA 9(3): 277-279 39 Andika IB, Kondo H, and Tamada T (2005) Evidence that RNA silencing-mediated resistance to beet necrotic yellow vein virus is less effective in roots than in leaves Mol Plant Microbe Interact 18: 194-204 40 Babitha KC, Vemanna RS, Nataraja KN, Udayakumar M (2015) Overexpression of EcbHLH57 Transcription Factor from Eleusine coracana L in Tobacco Confers Tolerance to Salt, Oxidative and Drought Stress PLoS One 10(9): e0137098 doi: 10.1371/journal.pone.0137098 41 Bahariah B, Parveez GK, Masani MY, Khalid N (2012) Construction of phosphomannose isomerase (PMI) transformation vectors and evaluation of the effectiveness of vectors in tobacco (Nicotiana tabacum L) Bioinformation 8(3): 151-157 42 Bakshi S, Saha B, Roy NK, Mishra S, Panda SK, Sahoo L (2012) Successful recovery of transgenic cowpea (Vigna unguiculata) using the 6phosphomannose isomerase gene as the selectable marker Plant Cell Rep 31(6): 1093-1103 43 Ballester A, Cervera M, Pena L (2008) Evaluation of selection strategies alternative to nptII in genetic transformation of citrus Plant Cell Rep 27: 10051015 44 Baulcombe D (2004) RNA silencing in plants Nature 431: 356-363 153 45 Beachy RN, Loesch-Fries S, Tumer NE (1990) Coat protein-mediated resistance against virus infection Annu Rev Phytopathol 28: 451-474 46 Berlinger MJ, Taylor RA, Lebiush-Mordechi S, Shalhevet S, Spharim I (2002) Efficiency of insect exclusion screens for preventing whitefly transmission of tomato yellow leaf curl virus of tomatoes in Israel Bull Entomol Res 92(5): 367373 47 Bernstein E, Caudy AA, Hammond SM, Hannon GJ (2001) Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference Nature 409: 295296 48 Bonfim K, Faria JC, Nogueira EO, Mendes EA, Aragão FJ (2007) RNAi-mediated resistance to Bean golden mosaic virus in geneetically engineered common bean (Phaseolus vulgaris) Mol Plant Microbe Interact 20(6): 717-726 49 Bonnet J, Faile A, Malpica JM, García-Arenal F (2005) Role of recombination in the evolution of natural populations of Cucumber mosaic virus, a tripartite RNA plant virus Virology 33: 359-368 50 Braun CJ, Hemenway CL (1992) Expression of amino-terminal portions or full-length viral replicase genees in transgeneic plants confers resistance to potato virus X infection Plant Cell 4: 735-744 51 Brigneti GO, Voinnet WX, Li LH, Ji SW, Ding, and Baulcombe DC (1998) Viral pathogeneicity determinants are suppressors of transgenee silencing in Nicotiana benthaniana EMBL J 17: 6739-6746 52 Bríza J, Růzicková N, Niedermeierová H, Dusbábková J, Vlasák J (2010) Phosphomannose isomerase gene for selection in lettuce (Lactuca sativa L.) transformation Acta Biochim Pol 57(1): 63-68 53 Bucher E, Lohius D, van Poppel PM, Geerts-Dimitriadou C, Gold-bach R, and Prins M (2006) Multiple virus resistance at a high frequency using a single transgene construct J Gen Virol 87: 697-701 54 Buck AH and Blaxter M (2013) Functional diversification of Argonautes in nematodes: an expanding universe Biochem Soc Trans 41(4): 881-886 154 55 Burgyán J and Havelda Z (2011) Viral suppressors of RNA silencing Trends Plant Sci 16(5): 265-272 56 Callaway A, Giesman-Cookmeyer D, Gillok ET, Sit TL, Lommel SA (2001) The multifunctional capsid proteins of plant RNA virus Annu Rev Phytopatho 39: 419-460 57 Carr JP, Beachy RN, Klessig DF (1989) Are the PR1 proteins of tobacco involved in genetically engineered resistance to TMV? Virology 169(2): 470-473 58 Chen D, Ren Y, Deng Y, Zhao J (2010) Auxin polar transport is essential for the development of zygote and embryo in Nicotiana tabacum L and correlated with ABP1 and PM H+-ATPase activities J Exp Bot 61(6): 1853-1867 59 Chen J, Chen H, Hu H (1998) Selection of ningnanmycin overproduction strains by resistance of self-secondary metabolites Wei Sheng Wu Xue Bao 38(6): 484-486 60 Collmer CH, Vogt VM, Zaitlin M (1983) H protein, a minor protein of TMV virions, contains sequences of the viral coat protein Virology 126(2): 429448 61 Covey S, Al-Kaff N, Lãingara A and Turner D (1997) Plants combat infection by genee silencing Nature 385: 781-782 62 Cuellar W, Gaudin A, Solorzano D, Casas A, Nopo L, Chudalayandi P, Medrano G, Kreuze J and Ghislain M (2006) Self-excision of the antibiotic resistance gene nptII using a heat inducible Cre-loxP system from transgenic potato Plant Mol Biol 62: 71-82 63 Czech B and Hannon GJ (2011) Small RNA sorting: matchmaking for Argonautes Nat Rev Genet 12: 19-31 64 Darwish M, Lopez-Lauri F, Vidal V, El Maâtaoui M, Sallanon H (2015) Alternation of light/dark period priming enhances clomazone tolerance by increasing the levels of ascorbate and phenolic compounds and ROS detoxification in tobacco (Nicotiana tabacum L.) plantlets J Photochem Photobiol B 148: 9-20 155 65 Daryl, Bowman T and Sisson V (2000) A historical overview of fluecured Tobacco Breeding in The USA Tobacco Science 44: 59-64 66 De Block M and Debrouwer D (1991) Two T-DNA’s co-transformed into Brassica napus by a double Agrobacterium tumefaciens infection are mainly integrated at the same locus Theor Appl Genet 82: 257-263 67 Degenhardt J, Poppe A, Montag J, Szankowski I (2006) The use of the phosphomannose-isomerase/mannose selection system to recover transgenic apple plants Plant Cell Rep 25(11): 1149-1156 PHỤ LỤC Phụ lục Thành phần môi trường nuôi cấy thuốc in vitro Loại môi trường Nảy mầm hạt Thành phần MS (I-V) + 30 g/l sucrose + g/l agar, pH = 5,8 (MS) Cảm ứng tạo chồi MS (I-V) + 30 g/l sucrose + g/l agar, pH = 5,8 Bổ sung box: mg/l BAP (GM1) 156 Cảm ứng tạo chồi (GM2) MS (I-V) + 30 g/l sucrose + g/l agar, pH = 5,8 Bổ sung box: mg/l BAP + 400 mg/l cefotaxime MS (I-V) + 30 mg/l mannose + g/l agar, pH = 5,8 Ra rễ Bổ sung box: 0,1 mg/l IBA + 250 mg/l (RM1) cefotaxime MS (I-V) + 30 g/l sucrose + g/l agar, pH = 5,8 Ra rễ Bổ sung box: 0,1 mg/l IBA + 250 mg/l (RM2) cefotaxime Phụ lục Thành phần môi trường nuôi khuẩn Môi Thành phần trường LB đặc LB lỏng g/l yeast extract + g/l NaCl + 10 g/l tryptone + 15 g/l bacto agar, pH = 7,0 g/l yeast extract + g/l NaCl + 10 g/l tryptone, pH = 7,0 ½ MS ½ MS (I-V) + 30 g/l sucrose, pH = 5,8 lỏng 157 ... Nghiên cứu khả kháng bệnh virus thuốc (Nicotiana tabacum L.) chuyển gen mang cấu trúc RNAi Mục tiêu nghiên cứu đề tài 1) Phân lập, đánh giá đa dạng di truyền TMV, xác định trình tự bảo thủ gen. .. vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi 2) Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi mang gen đơn đoạn TMV gen đa đoạn chứa trình tự gen đồng thời virus TMV, CMV, TYLCV TSWV 3) Tạo dòng thuốc chuyển. .. chuyển gen kháng đơn virus kháng virus phổ rộng 4) Đánh giá khả kháng virus, mức độ an toàn sinh học, khả sinh trưởng dòng thuốc chuyển gen Nội dung nghiên cứu 1) Khảo sát, thu thập mẫu thuốc