BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI -*** - O TH TRANG KHảO SáT MộT Số ĐộT BIếN GEN LI£N QUAN TíI CHøNG ¦A HUỸT KHèI DI TRUN ë PHụ Nữ SẩY THAI, THAI CHếT LƯU LIÊN TIếP Chuyờn ngành : Y Sinh Học - Di Truyền Mã số : NT 62726201 LUẬN VĂN BÁC SĨ NỘI TRÚ Người hướng dẫn khoa học: TS ĐOÀN THỊ KIM PHƯỢNG PGS TS HOÀNG THỊ NGỌC LAN HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Lời muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS BS Đồn Thị Kim Phượng, giảng viên Bộ mơn Y Sinh học - Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội, người hướng dẫn khoa học Cô người định hướng cho nghiên cứu, truyền dạy cho kiến thức khoa học sống Sự động viên, giúp đỡ dìu dắt Cơ giúp tơi có thêm nghị lực để vượt lên khó khăn hồn thành nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Hoàng Thị Ngọc Lan, giáo viên đồng hướng dẫn, người ln nhiệt tình giúp đỡ, bảo tơi trình học tập thực nghiên cứu để tơi hồn thành luận văn ngày hơm Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy Cô Anh chị em Bộ môn Y Sinh học - Di truyền, Trường Đại học Y Hà Nội Trung tâm Chẩn đoán trước sinh, Bệnh viện Phụ sản Trung Ương tạo điều kiện cho q trình học tập thực nghiên cứu Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng đào tạo Sau đại học trường Đại học Y Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thiện luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới đối tượng nghiên cứu tình nguyện hợp tác giúp thực nghiên cứu Cuối cùng, xin gửi lời biết ơn tới bố mẹ ủng hộ, động viên, thương u chăm sóc, khích lệ chồng, anh chị em gia đình, người ln bên tơi, chỗ dựa vững để yên tâm học tập hoàn thành luận văn Hà Nội, tháng 09 năm 2017 Đào Thị Trang LỜI CAM ĐOAN Tôi Đào Thị Trang, Bác sĩ nội trú khóa 39, chuyên ngành Y Sinh học - Di truyền, xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực hướng dẫn TS.Đoàn Thị Kim Phượng PGS.TS Hoàng Thị Ngọc Lan Nghiên cứu không trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thơng tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan Tơi xin hồn toàn chịu trách nhiệm cam kết Tác giả luận văn Đào Thị Trang DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT APCR CL CVD DNA FII FXIII Activated protein C resistance Cell Lysis Cardiovascular disease DeoxyriboNucleic Acid Factor II Factor XIII IT Inherited thrombophilia PK Proteinase K tPA Tissue plasminogen activator VTE AT Venous thrombosis embolism Antithrombin LMWH Low-molecular-weight heparin NFW Nuclease Free Water uPA Urokinase plasminogen activator EPCR FVL PAI-1 PCR RPL Kháng protein C hoạt hóa Ly giải tế bào Bệnh tim mạch Yếu tố II Yếu tố XIII Chứng ưa huyết khối/tăng đông di truyền Chất hoạt hóa plasminogen mơ Thun tắc tĩnh mạch Heparin trọng lượng phân tử thấp Chất hoạt hóa plasminogen urokinase Endothelial protein C receptor Thụ thể protein C nội mô Factor V Leiden Yếu tố V Leiden Plasminogen activator inhibitor – Chất ức chế hoạt hóa type1 Polymerase chain reaction Recurrent pregnancy loss plasminogen tuýp Phản ứng chuỗi polymerase Mất thai tái diễn MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Đại cương sẩy thai, thai chết lưu liên tiếp .3 1.2 Chứng ưa huyết khối di truyền 1.2.1 Đại cương 1.2.2 Mối liên quan chứng ưa huyết khối di truyền thai tái diễn 1.2.3 Tiêu chuẩn chẩn đoán sàng lọc IT 11 1.2.4 Một số độ biến gen liên quan tới chứng ưa huyết khối di truyền 13 1.2.5 Một số kỹ thuật phát đột biến gen liên quan đến chứng ưa huyết khối di truyền 20 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Đối tượng nghiên cứu 23 2.2 Địa điểm lấy mẫu phân tích mẫu 23 2.3 Phương tiện nghiên cứu 24 2.3.1 Dụng cụ .24 2.3.2 Hóa chất 24 2.4 Phương pháp nghiên cứu 24 2.4.1 Thiết kế nghiên cứu .24 2.4.2 Cỡ mẫu 24 2.4.3 Phương pháp tiến hành nghiên cứu .24 1.4.5 Đọc kết 28 2.5 Xử lý số liệu .30 2.6 Cách khống chế sai số nghiên cứu 30 2.7 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 31 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32 3.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 32 3.1.1 Tuổi .32 3.1.2 Tiền sử sản khoa 32 3.1.3 Tiền sử tắc mạch 34 3.2 Hoàn thiện quy trình phát số đột biến gen liên quan đến chứng ưa huyết khối di truyền kit CVD-T StripAssay 34 3.3 Mô tả số đột biến gen liên quan đến chứng ưa huyết khối di truyền phụ nữ sẩy thai, thai chết lưu liên tiếp 37 3.3.1 Tỷ lệ đột biến gen 37 3.3.2 Mối liên quan số đột biến gen tiền sử sản khoa 39 Chương BÀN LUẬN 41 4.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 41 4.2 Hoàn thiện quy trình phát số đột biến gen liên quan đến chứng ưa huyết khối di truyền kit CVD-T StripAssay 42 4.3 Mô tả số đột biến gen liên quan đến chứng ưa huyết khối di truyền phụ nữ sẩy thai, thai chết lưu liên tiếp 43 4.3.1 Đột biến yếu tố V Leiden đột biến yếu tố V R2 .43 4.3.2 Đột biến prothrombin G20210A 44 4.3.3 Đột biến MTHFR C677T A1298C 45 4.3.4 Đột biến PAI - 4G/5G .47 4.3.5 Đột biến yếu tố XIII Val34Leu 48 4.3.6 Tổ hợp gen EPCR .48 4.3.7 Sự kết hợp đột biến .49 4.3.8 Mối liên quan số đột biến tiền sử sản khoa 49 KẾT LUẬN 50 KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG, BIỂU Bảng 1.1 Nguyên nhân RPL xét nghiệm đánh giá Bảng 1.2 Mối liên quan số đột biến gen liên quan tới chứng ưa huyết khối di truyên biến chứng sản khoa Bảng 1.3 Hoạt độ enzyme MTHFR tương ứng với đột biến gen .17 Bảng 1.4 Một số gen liên quan đến IT phát với phương pháp lai kít CVD-T StripAssay 21 Bảng 3.1 Tuổi trung bình phân bố theo tuổi .32 Bảng 3.2 Phân bố số lần sẩy thai, thai chết lưu theo ba quý thai kì 33 Bảng 3.3 Phân bố bệnh nhân theo tiền sử bệnh tắc mạch 34 Bảng 3.4 Kết (KQ) theo thời gian chạy điện di 34 Bảng 3.5 Phân bố hiệu lai sản phẩm PCR đạt sau điện di 55 phút .36 Bảng 3.6 Tỷ lệ đột biến gen phát 37 Bảng 3.7 Tần số đột biến gen MTHFR C677T A1298C .37 Bảng 3.7 Tỷ lệ dạng đột biến kép .38 Bảng 3.8 Tần số tổ hợp gen (haplotype) EPCR: A4600G A4678G 39 Bảng 3.9 Tỷ lệ đột biến gen MTHFR PAI-1 4G/5G hai nhóm bệnh nhân RPL quý quý thai kì 39 Bảng 3.10 Tỷ lệ đột biến gen MTHFR PAI-1 4G/5G hai nhóm bệnh nhân RPL chưa có có 40 Bảng 3.11 Mối liên quan số lần RPL với số đột biến .40 Bảng 4.1 So sánh tỷ lệ kiểu gen MTHFR C677T với nghiên cứu phụ nữ RPL .45 Bảng 4.2 So sánh tỷ lệ kiểu gen PAI-1 4G/5G với số nghiên cứu phụ nữ RPL 47 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Phân bố bệnh nhân theo tình trạng có 32 Biểu đồ 3.2 Phân bố bệnh nhân theo số lần RPL 33 Biểu đồ 3.3 Phân bố kết lai sản phẩm PCR 35 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Ngun nhân thai tái diễn .5 Hình 1.2 Con đường đơng máu hệ thống chống đơng thơng qua Protein C hoạt hóa 14 Hình 1.3 Chu trình methionin-homocystein 16 Hình 1.4 Tác động PAI-1 yếu tố XIII lên hình thành ly giải fibrin 18 Hình 1.5 Minh họa nguyên lý phương pháp lai phân tử 20 Hình 2.1 Phương pháp tiến hành nghiên cứu 25 Hình 2.2 Thiết kế lai mẫu .29 Hình 2.3 Các kết lai gặp đột biến .30 Hình 2.4 Cách đọc kết Haplotype gen EPCR .30 Hình 3.1 Hình ảnh điện di 35 Hình 3.2 Kết điện di lai không thành công 36 ĐẶT VẤN ĐỀ Mất thai tái diễn (Recurrent Pregnancy Loss – RPL) tình trạng bệnh lý ảnh hưởng lớn tới tâm lý sức khỏe người phụ nữ gia đình họ RPL có từ hai lần sẩy thai, thai chết lưu trở lên RPL ảnh hưởng tới 5% cặp đơi mong muốn có Có nhiều giả thuyết chế dẫn đến RPL, nhiên nhiều điểm chưa rõ ràng Nhiều nguyên nhân RPL xác định bất thường nhiễm sắc thể bố mẹ, phôi thai, bệnh lý tự miễn, rối loạn nội tiết,…nhưng khoảng nửa trường hợp chưa xác định nguyên nhân Cùng với phát triển lĩnh vực sinh học phân tử, nhà khoa học ngày tập trung tìm chế thực dẫn tới RPL việc sâu nghiên cứu biểu (đột biến tính đa hình) gen khác liên quan đến tình trạng RPL Trong xu hướng đó, chế tăng đông máu nhận quan tâm dựa giả thuyết việc hình thành huyết khối hệ thống mạch máu tử cung – thai dẫn đến gián đoạn cấp máu cho thai nhi, gây sẩy thai thai chết lưu Hàng loạt nghiên cứu tác giả thực nhiều nước giới, nhằm xác định mối liên quan đột biến/tính đa hình gen với tình trạng RPL, tiến hành thử nghiệm can thiệp lâm sàng thuốc chống đông acid folic (hoặc dẫn xuất acid folic) nhằm cải thiện kết mang thai đối tượng RPL Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu khảo sát đánh giá đột biến gen liên quan đến chứng ưa huyết khối/tình trạng tăng đơng di truyền (Inherited Thrombophilia – IT) đối tượng RPL Do đó, nhằm cung cấp liệu ban đầu Việt Nam vấn đề này, tiến hành thực 87 Jeddi-Tehrani M, Torabi R, Zarnani AH, et al (2011) Analysis of plasminogen activator inhibitor-1, integrin beta3, beta fibrinogen, and methylenetetrahydrofolate reductase polymorphisms in Iranian women with recurrent pregnancy loss Am J Reprod Immunol;66(2):149-156 88 Balta G, Altay C, Gurgey A (2002) PAI-1 gene 4G/5G genotype: A risk factor for thrombosis in vessels of internal organs American Journal of Hematology;71(2):89-93 89 Patil R, Ghosh K, Vora S, et al (2015) Inherited and acquired thrombophilia in Indian women experiencing unexplained recurrent pregnancy loss Blood Cells Mol Dis;55(3):200-205 90 Chen H, Nie S, Lu M (2015) Association between plasminogen activator inhibitor-1 gene polymorphisms and recurrent pregnancy loss: a systematic review and meta-analysis Am J Reprod Immunol;73(4):292300 91 Jeon YJ, Kim YR, Lee BE, et al (2013) Genetic association of five plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) polymorphisms and idiopathic recurrent pregnancy loss in Korean women Thromb Haemost;110(4):742-750 92 Magdoud K, Herbepin VG, Touraine R, et al (2013) Plasminogen activator inhibitor 4G/5G and -844G/A variants in idiopathic recurrent pregnancy loss Am J Reprod Immunol;70(3):246-252 93 Subrt I, Ulcova-Gallova Z, Cerna M, et al (2013) Recurrent pregnancy loss, plasminogen activator inhibitor-1 (-675) 4G/5G polymorphism and antiphospholipid antibodies in Czech women Am J Reprod Immunol;70(1):54-58 94 Kim JJ, Choi YM, Lee SK, et al (2014) The PAI-1 4G/5G and ACE I/D polymorphisms and risk of recurrent pregnancy loss: a case-control study Am J Reprod Immunol;72(6):571-576 95 Parveen F, Tuteja M, Agrawal S (2013) Polymorphisms in MTHFR, MTHFD, and PAI-1 and recurrent miscarriage among North Indian women Arch Gynecol Obstet;288(5):1171-1177 96 Said JM, Tsui R, Borg AJ, et al (2012) The PAI-1 4G/5G polymorphism is not associated with an increased risk of adverse pregnancy outcome in asymptomatic nulliparous women J Thromb Haemost;10(5):881-886 97 Su MT, Lin SH, Chen YC, et al (2013) Genetic association studies of ACE and PAI-1 genes in women with recurrent pregnancy loss: a systematic review and meta-analysis Thromb Haemost;109(1):8-15 98 Li X, Liu Y, Zhang R, et al (2015) Meta-analysis of the association between plasminogen activator inhibitor-1 4G/5G polymorphism and recurrent pregnancy loss Med Sci Monit;21:1051-1056 99 Dossenbach-Glaninger A, van Trotsenburg M, Oberkanins C, et al (2013) Risk for early pregnancy loss by factor XIII Val34Leu: the impact of fibrinogen concentration J Clin Lab Anal;27(6):444-449 100 Li J, Wu H, Chen Y, et al (2015) Genetic association between FXIII and beta-fibrinogen genes and women with recurrent spontaneous abortion: a meta- analysis J Assist Reprod Genet;32(5):817-825 101 Elmahgoub IR, Afify RA, Abdel Aal AA, et al (2014) Prevalence of coagulation factor XIII and plasminogen activator inhibitor-1 gene polymorphisms among Egyptian women suffering from unexplained primary recurrent miscarriage J Reprod Immunol;103:18-22 102 Bagheri M, Rad IA, Omrani MD, et al (2011) The Val34Leu genetic variation in the A subunit of coagulation factor XIII in recurrent spontaneous abortion Syst Biol Reprod Med;57(5):261-264 103 Lopez Ramirez Y, Vivenes M, Miller A, et al (2006) Prevalence of the coagulation factor XIII polymorphism Val34Leu in women with recurrent miscarriage Clin Chim Acta;374(1-2):69-74 104 CT ESMON (1992) The protein C anticoagulant pathway Arterioscler Thromb;12(135, 145) 105 Saposnik B, Reny J-L, Gaussem P, et al (2004) A haplotype of the EPCR gene is associated with increased plasma levels of sEPCR and is a candidate risk factor for thrombosis Blood;103(4):1311-1318 106 Medina P, Navarro S, Estelles A, et al (2005) Influence of the 4600A/G and 4678G/C polymorphisms in the endothelial protein C receptor (EPCR) gene on the risk of venous thromboembolism in carriers of factor V Leiden Thromb Haemost;94(2):389-394 107 Medina P, Navarro S, Estelles A, et al (2004) Contribution of polymorphisms in the endothelial protein C receptor gene to soluble endothelial protein C receptor and circulating activated protein C levels, and thrombotic risk Thromb Haemost;91(5):905-911 108 S UITTE DE WILLIGE VVM, F.R ROSENDAAL, H.L VOS, DE VISSER, R.M., BERTINA (2004) Haplotypes of the EPCR gene, plasma sEPCR levels and the risk of deep venous throm- bosis J Thromb Haemost;2(1305, 1310) 109 L.M REGAN DJS-K, S KUROSAWA, J MOLLICA, K FUKUDOME, C.T ESMON (1996) The endothelial cell protein C receptor Inhibition of activated protein C anticoagulant function without modulation of reaction with proteinase inhibitors J Biol Chem;271:17499, 17503 110 Pasquier E, Bohec C, Mottier D, et al (2009) Inherited thrombophilias and unexplained pregnancy loss: an incident case-control study J Thromb Haemost;7(2):306-311 111 Poursadegh Zonouzi A, Chaparzadeh N, Ghorbian S, et al (2013) The association between thrombophilic gene mutations and recurrent pregnancy loss J Assist Reprod Genet;30(10):1353-1359 112 Wolski H, Barlik M, Drews K, et al (2017) Contribution of inherited thrombophilia to recurrent miscarriage in the Polish population Ginekol Pol;88(7):385-392 113 D.C.Rees MC, J.B.Clegg (1995) World distribution of factor V Leiden Lancet;346:1133, 1134 114 Kabukcu S, Keskin N, Keskin A, et al (2007) The frequency of factor V Leiden and concomitance of factor V Leiden with prothrombin G20210A mutation and methylene tetrahydrofolate reductase C677T gene mutation in healthy population of Denizli, Aegean region of Turkey Clin Appl Thromb Hemost;13(2):166-171 115 Incebiyik A, Hilali NG, Camuzcuoglu A, et al (2014) Prevalence of thromogenic gene mutations in women with recurrent miscarriage: A retrospective study of 1,507 patients Obstet Gynecol Sci;57(6):513-517 116 Mukhopadhyay R, Saraswathy KN, Ghosh PK (2009) MTHFR C677T and factor V Leiden in recurrent pregnancy loss: a study among an endogamous group in North India Genet Test Mol Biomarkers;13(6):861-865 117 Androutsopoulos G, Mougiou A, Karakantza M, et al (2007) Combined inherited thrombophilia and adverse pregnancy outcome Clin Exp Obstet Gynecol;34(4):236-238 118 Bick RL, Hoppensteadt D (2005) Recurrent miscarriage syndrome and infertility due to blood coagulation protein/platelet defects: a review and update Clin Appl Thromb Hemost;11(1):1-13 119 Arabkhazaeli N, Ghanaat K, Hashemi-Soteh MB (2016) H1299R in coagulation Factor V and Glu429Ala in MTHFR genes in recurrent pregnancy loss in (Yazd);14(5):329-334 Sari, Mazandaran Int J Reprod Biomed 120 Luddington R, Jackson A, Pannerselvam S, et al (2000) The factor V R2 allele: risk of venous thromboembolism, factor V levels and resistance to activated protein C Thromb Haemost;83(2):204-208 121 Aytekin E, Ergun SG, Ergun MA, et al (2014) Evaluation of GenoFlow Thrombophilia Array Test Kit in its detection of mutations in Factor V Leiden (G1691A), prothrombin G20210A, MTHFR C677T and A1298C in blood samples from 113 Turkish female patients Genet Test Mol Biomarkers;18(11):717-721 122 Dziadosz M, Baxi LV (2016) Global prevalence of prothrombin gene mutation G20210A and implications in women's health: a systematic review Blood Coagul Fibrinolysis 123 Yousefian E, Kardi MT, Allahveisi A (2014) Methylenetetrahydrofolate Reductase C677T and A1298C Polymorphism in Iranian Women With Idiopathic Recurrent Pregnancy Losses Iran Red Crescent Med J;16(7):e16763 124 Al-Achkar W, Wafa A, Ammar S, et al (2017) Association of Methylenetetrahydrofolate Reductase C677T and A1298C Gene Polymorphisms With Recurrent Pregnancy Loss in Syrian Women Reprod Sci;24(9):1275-1279 125 Abu-Asab NS, Ayesh SK, Ateeq RO, et al (2011) Association of inherited thrombophilia with recurrent pregnancy loss in palestinian women Obstet Gynecol Int;2011:689684 126 Rai V (2016) Methylenetetrahydrofolate Reductase C677T Polymorphism and Recurrent Pregnancy Loss Risk in Asian Population: A Meta-analysis Indian J Clin Biochem;31(4):402-413 127 Serapinas D, Boreikaite E, Bartkeviciute A, et al (2017) The importance of folate, vitamins B6 and B12 for the lowering of homocysteine concentrations for patients with recurrent pregnancy loss and MTHFR mutations Reprod Toxicol;72:159-163 128 Wang XP, Lin QD, Ma ZW, et al (2004) [C677T and A1298C mutation of the methylenetetrahydrofolate reductase gene in unexplained recurrent spontaneous abortion] Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi;39(4):238-241 129 Ozdemir O1 YG, Silan F, Köksal B, Atik S, Ozen F, Göl M, Cetin A (2012) Recurrent pregnancy loss and its relation to combined parental thrombophilic gene mutations Genet Test Mol Biomarkers;16(4):279286 130 Rodriguez-Guillen Mdel R, Torres-Sanchez L, Chen J, et al (2009) Maternal MTHFR polymorphisms and risk of spontaneous abortion Salud Publica Mex;51(1):19-25 131 Cao Y, Zhang Z, Xu J, et al (2013) The association of idiopathic recurrent pregnancy loss with polymorphisms in hemostasis-related genes Gene;530(2):248-252 132 Nair RR, Khanna A, Singh R, et al (2013) Association of maternal and fetal MTHFR A1298C polymorphism with the risk of pregnancy loss: a study of an Indian population and a meta-analysis Fertil Steril;99(5):1311-1318.e1314 133 Coriu L, Ungureanu R, Talmaci R, et al (2014) Hereditary Thrombophilia and thrombotic events in pregnancy: single-center experience J Med Life;7(4):567-571 134 Morales-Machin A, Borjas-Fajardo L, Quintero JM, et al (2009) [C677T polymorphism of the methylentetrahydrofolate reductase gene as risk factor in women with recurrent abortion] Invest Clin;50(3):327-333 135 Seremak-Mrozikiewicz A, Drews K, Kurzawinska G, et al (2010) The significance of 1793G>A polymorphism in MTHFR gene in women with first trimester recurrent miscarriages Neuro Endocrinol Lett;31(5):717723 136 Valentina Đorđevic MG, Iva Pruner, et al (2014) The prevalence of PAI-1 4G/5G polymorrphism in women with fetal loss - first data for a Serbian population J Med Biochem;33:203-207 137 Coulam CB, Wallis D, Weinstein J, et al (2008) Comparison of thrombophilic gene mutations among patients experiencing recurrent miscarriage and deep vein thrombosis Am J Reprod Immunol;60(5):426-431 138 Kim SY, Park SY, Choi JW, et al (2011) Association between MTHFR 1298A>C polymorphism and spontaneous abortion with fetal chromosomal aneuploidy Am J Reprod Immunol;66(4):252-258 139 Guan LX, Du XY, Wang JX, et al (2005) [Association of genetic polymorphisms in plasminogen activator inhibitor-1 gene and 5,10methylenetetrahydrofolate spontaneous abortion] reductase gene Zhonghua Yi Xue with Yi recurrent early Chuan Xue Za Zhi;22(3):330-333 140 Huang Z, Tang W, Liang Z, et al (2017) Plasminogen Activator Inhibitor-1 Polymorphism Confers a Genetic Contribution to the Risk of Recurrent Spontaneous Abortion: An Updated Meta-Analysis Reprod Sci:1933719117702013 141 Dossenbach-Glaninger A, van Trotsenburg M, Dossenbach M, et al (2003) Plasminogen activator inhibitor 4G/5G polymorphism and coagulation factor XIII Val34Leu polymorphism: impaired fibrinolysis and early pregnancy loss Clin Chem;49(7):1081-1086 142 Jung JH, Kim JH, Song GG, et al (2017) Association of the F13A1 Val34Leu polymorphism and recurrent pregnancy loss: A meta-analysis Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol;215:234-240 143 Hopmeier P, Puehringer H, van Trotsenburg M, et al (2008) Association of endothelial protein C receptor haplotypes, factor V Leiden and recurrent first trimester pregnancy loss Clin Biochem;41(12):1022-1024 144 Coulam CB, Jeyendran RS, Fishel LA, et al (2006) Multiple thrombophilic gene mutations rather than specific gene mutations are risk factors for recurrent miscarriage Am J Reprod Immunol;55(5):360-368 145 Cao Y, Xu J, Zhang Z, et al (2013) Association study between methylenetetrahydrofolate reductase polymorphisms and unexplained recurrent pregnancy loss: a meta-analysis Gene;514(2):105-111 PHỤ LỤC Quy trình tách chiết DNA kít ReliaPrep Blood gDNA Miniprep System Promega - Bước 1: Mẫu máu rã đông hồn tồn nhiệt độ phòng Mỗi bệnh nhân tuýp 1,5ml Ghi tên/mã số bệnh nhân lên nắp thân tuýp - Bật máy ủ lên nhiệt độ 560C - Bước 2: Hút 20ul dung dịch Protein kinase (PK) vào tuýp 1,5 ml - Bước 3: Trộn mẫu máu pipetting nhẹ nhàng, tránh làm vỡ hồng cầu Sau đó, cho 200ul máu vào tuýp có PK lắc Nếu thực bước trước bước cần vortex kỹ khoảng phút - Bước 4: Thêm tiếp 200ul Cell Lysis Buffer (CLD, nắp viền đỏ) vào tuýp trên, thu hỗn hợp X Vortex X kỹ (khoảng phút) - Bước 5: Ủ tuýp X 10 phút 56 độ C Trong lúc ủ, đặt Column (Cột) vào Collection tube (Tuýp thu thập) Ghi tên/mã bệnh nhân lên Cột tuýp thu thập - Bước 6: Lấy tuýp X từ máy ủ nhiệt ra, thêm 250ul Binding Buffer Acid (BBA) vào X, sau vortex kỹ (30 giây), dung dịch chuyển sang màu xanh đậm (hỗn hợp Y) - Bước 7: Thêm Y vào Cột tương ứng, nắp chặt, sau cho vào máy ly tâm Ly tâm phút với tốc độ 14.000 vòng/phút Sau ly tâm xong, kiểm tra xem lysate hoàn toàn qua màng chưa, chưa qua màng hết (nhiều cặn màu xanh/đen màng lọc cột) ly tâm thêm phút với tốc độ 14.000 vòng/phút - Bước 8: Loại bỏ tuýp thu thập cũ, dung dịch tuýp thu thập cần loại bỏ chất độc hóa học Đặt Cột vào tuýp thu thập Thêm 500 ul dung dịch rửa cột (CWD) vào cột ly tâm phút tốc độ tối đa, 14.000 vòng/phút Sau đó, loại bỏ tuýp thu thập cũ Lặp lại bước thêm lần - Bước 9: Đặt Cột vào tuýp 1,5ml (đã ghi tên/mã bệnh nhân) tương ứng Thêm 50 – 200ul Nuclease-Free Water (NFW) vào cột Đối với bệnh nhân nghiên cứu thường pha loãng 50 ul NFW Ly tâm phút tốc độ tối đa Bỏ Cột giữ lại tuýp 1,5 ml - Lưu ý: Lượng NFW cho vào nồng độ DNA tăng sản lượng giảm Quy trình PCR kit CVD-T StripAssay (ViennaLab) Các hóa chất giữ nhiệt độ – độ C bắt đầu cho vào máy PCR - Pha lỗng DNA NFW để D-DNA (Diluted DNA) có nồng độ – 20ng/ul (hay ug/ml) Trong nghiên cứu này, nồng độ DNA để thực PCR 15 – 20 ng/ul - Pha Taq theo tỷ lệ: 1: 24 (Taq DNA polymerase : Taq Dilution Buffer) D-Taq có nồng độ 0,2 IU/ul - Chuẩn bị tuýp PCR cho mẫu, bao gồm: 15 ul Amplication Mix, ul D-Taq ul D-DNA - Nắp chặt cho vào máy luân nhiệt (máy PCR) cài chương trình sau:  Pre – PCR: 94 độ C/2 phút  Luân nhiệt: 94 độ C/15 giây – 58 độ C/30 giây – 72 độ C/30 giây (35 chu kỳ)  Vòng cuối: 72 độ C/3 phút Lưu trữ sản phẩm PCR nhiệt độ – độ C Quy trình điện di sản phẩm PCR - Chuẩn bị thạch Agarose 3% - Tris Borate EDTA (TBE) 10X: 108g Tris base + 55g acid boric + 800ml nước cất Trộn đều, hòa tan với 40ml EDTA 0,5M, pH Đổ thêm nước cất đến lít dung dịch.Pha loãng TBE 10X với nước cất để TBE 1X - 50ml TBE 1X + 1,5g bột agarose: hỗn dịch đun nóng phút - Thêm 2,5ul Redsafe (1:20000) vào dung dịch trên, lắc đều, tránh tạo bọt - Đổ thạch vào khay thạch để nguội - Chuẩn bị buồng điện di: - Rửa buồng điện di - Cho dung dịch chạy điện di TBE 1X vào buồng điện di - Cài đặt chế độ điện di: 110A, 220V, thời gian chạy điện di thử nghiệm 45 phút, 55 phút 60 phút cho mẫu - Đặt thạch vào buồng điện di - Chạy điện di sản phẩm PCR: - Nhỏ 3ul ladder vào giếng - Nhỏ [4ul dye + 3,5ul DNA (sau PCR)] vào giếng - Nắp buồng điện di mắc điện cực âm (màu đen) dương (màu đỏ) - Nhấn Start kiểm tra dòng điện vào - Với miếng thạch, sau khoảng thời gian thử nghiệm soi buồng tia UV để đánh giá kết - Đánh giá sản phẩm PCR: - Độ dài đoạn DNA khuếch đại: 134, 165, 173, 202, 223, 254, 283, 324 cặp đôi ba-zơ (bp) - Sản phẩm PCR đạt yêu cầu có đủ band điện di tương ứng với kích thước: 134, 165, 173, 202, 223, 254, 283, 324bp - Sản phẩm PCR không đạt yêu cầu thiếu band điện di nêu Quy trình lai kít CVD-T StripAssay (ViennaLab) - Dựa sở lai ngược sản phẩm PCR gắn với biotinyl - Gắn đoạn dò (probes) với gen đột biến gen bình thường theo trình tự song song đoạn nucleotide đặc hiệu alen (allele-specific oligonucleotides) - Kết hợp với đoạn nucleotide cố định lai (teststrip) - Kết xét nghiệm đánh giá mắt thường nhờ phản ứng màu enzyme (Streptavidin-alkaline phosphatase) Các bước thực hiện: 4.1 Bước lai: - Chuẩn bị: - Bật buồng nước nhiệt lên 45 độ C Đặt dung dịch lai (Hybridization) dung dịch rửa A (Wash Solution A) vào buồng nước nhiệt 15 phút, giúp làm tan tinh thể hình thành trình bảo quản lạnh - Bật máy ủ lắc lên nhiệt độ 45 độ - Các hóa chất khác kit để nhiệt độ phòng - Ghi tên bệnh nhân lên khoang lai khay lai (Typing tray) tương ứng - Bước 1: Lấy 10ul DNAT vào khoang lai bệnh nhân - Bước 2: Cho 10ul (có thể từ – 10ul) sản phẩm PCR bệnh nhân vào khoang lai pipetting với DNAT (màu xanh) Để nhiệt độ phòng phút - Bước 3: Lấy dung dịch lai từ buồng nước nhiệt Cho 1ml dung dịch lai vào khoang lai có hỗn hợp [DNAT + sản phẩm PCR], màu xanh Nghiêng lắc nhẹ khay lai - Bước 4: Dùng tay đeo găng nhíp lấy lai cho vào khoang lai chứa dung dịch lai nghiêng lắc Sau cho khay lai vào máy ủ lắc cài đặt nhiệt độ 45 độ C 30 phút 4.2 Bước rửa - Bước 5: Lấy dung dịch rửa A từ buồng nước nhiệt Điều chỉnh máy ủ lắc xuống nhiệt độ 25 độ C.Lấy khay lai từ máy ủ lắc, đổ bỏ dung dịch lai sau thấm khay lai giấy khơ Khi lai không ngâm dung dịch, thao tác bổ sung dung dịch khác vào cần thực nhanh tránh khô lai.Cho vào khoang lai 1ml dung dịch rửa A, nghiêng lắc đổ bỏ dung dịch rửa A - Bước 6: Cho 1ml dung dịch rửa A vào khoang lai sau chuyển khay lai vào máy ủ lắc để 15 phút - Bước 7: Đổ bỏ dung dịch rửa A lặp lại bước lần - Bước 8: Đổ bỏ dung dịch rửa A, thấm khay lai giấy Sau cho vào khoang lai 1ml dung dịch Conjugate, để khay lai máy lắc nhiệt độ phòng 15 phút 4.3 Bước nhuộm - Bước 9: Đổ bỏ dung dịch Conjugate khỏi khay lai Cho 1ml dung dịch rửa B vào khoang lai, nghiêng lắc đổ bỏ - Bước 10: Cho 1ml dung dịch rửa B vào khoang lai, để khay lai máy lắc nhiệt độ phòng phút, sau đổ bỏ dung dịch rửa B - Bước 11: Lặp lại bước 13 thêm lần Trong thời gian này, máy ủ lắc chưa xuống 25 độ C cần chuẩn bị giấy bạc để che phủ khay lai bước sau - Bước 12: Cho 1ml dung dịch Color Developer vào khoang lai, buồng tối (có thể che phủ giấy bạc) máy lắc nhiệt độ phòng 15 phút Sau đó, đổ bỏ dung dịch rửa lai nước cất – lần - Bước 13: Đổ bỏ nước cất, lấy lai khỏi khoang lai để vào giấy thấm có ghi tên bệnh nhân Tránh ánh sáng trực tiếp vào lai - Bước 14: Ghi tên bệnh nhân vào tờ kết dán lai vào tờ kết DANH SÁCH BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 Ngày lấy mẫu 24.08.2015 26.08.2015 09.10.2015 24.09.2015 13.10.2015 22.09.2015 13.10.2015 10.09.2015 09.10.2015 18.08.2015 09.10.2015 14.09.2015 15.09.2015 15.09.2015 08.10.2015 09.10.2015 09.10.2015 26.08.2015 09.10.2015 08.11.2015 08.12.2015 09.12.2015 04.01.2016 22.03.2016 18.05.2016 19.05.2016 14.06.2016 24.06.2016 15.07.2016 15.08.2016 27.08.2016 30.08.2016 15.09.2016 29.09.2016 26.10.2016 Mã số L6851 L6440 L6904 L6823 L6952 L6814 L6950 L6712 L6895 L6505 L6802 L6746 L6935 L6761 V0959 V0909 L6843 L6182 BM001 cvd001 cvd005 cvd007 cvd011 cvd22 cvd30 cvd31 cvd34 cvd37 cvd45 cvd55 cvd57 cvd60 cvd61 cvd62 cvd63 Họ tên BN Trần Thị H Nguyễn Thị H Đặng Thị N Nguyễn Thị T Hoàng Thị Thanh M Lê Thị S Đỗ Thị Trúc Q Đồn Thi H Bùi Thị Bích L Trần Thị K Nguyễn Thị An L Đỗ Thị H Vũ Thị H Đỗ Thị Lan H Hà Thị Mai P Nguyễn Thị Thanh H Phan Thị L Nguyễn Thị T Vương Thị H Ngơ Thị Hương D Trần Thị Bích V Nguyễn Thị Thúy N Lâm Thị H Nguyễn Thị Minh H Vũ Thị N Nguyễn Thị N Nguyễn Minh T Lê Thị Ngọc N Nguyễn Phương T Nguyễn Thị Kim O Bùi Thị Kiều O Bùi Thị Phương T Đàm Lệ T Trần Thị Thu T Vũ Thị N Tuổi 35 25 25 39 28 28 26 45 34 21 28 24 39 42 34 35 32 30 22 32 30 25 28 39 29 29 43 30 32 31 26 32 21 27 41 Quê quán Hà Nội Hà Nội Bắc Giang Nghệ An Hà Nội Thanh Hóa Tuyên Quang Hà Nội Hà Nội Thái Bình Hải Dương Hưng Yên Hà Nội Ninh Bình Sơn La Hà Nội Hà Nội Hòa Bình Hà Nội Hà Nội Hà Nội Hà Nội Hà Nội Hà Nội Hà Nội Hà Nội Hà Nội Phú Thọ Hải Dương Hà Nội Phú Thọ Hà Nội Bắc Ninh Thái Nguyên Hà Nội 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 28.11.2016 07.01.2017 13.01.2017 13.01.2017 10.02.2017 17.02.2017 23.03.2017 25.03.2017 29.03.2017 07.04.2017 10.04.2017 17.04.2017 17.04.2017 26.04.2017 28.04.2017 10.05.2017 12.05.2017 17.05.2017 26.05.2017 29.05.2017 09.06.2017 13.06.2017 14.06.2017 14.06.2017 22.06.2017 23.06.2017 30.06.2017 30.06.2017 13.07.2017 20.07.2017 22.07.2017 26.07.2017 26.07.2017 12.08.2017 15.08.2017 16.08.2017 17.08.2017 cvd73 cvd76 cvd90 cvd91 cvd92 cvd93 cvd100 cvd101 cvd102 cvd104 cvd105 cvd107 cvd106 cvd109 cvd110 cvd111 cvd112 cvd114 cvd113 cvd115 cvd120 cvd129 cvd123 cvd122 cvd128 cvd126 cvd129 cvd130 cvd131 cvd132 cvd133 cvd135 cvd136 cvd138 cvd139 cvd140 cvd141 Hoàng Thị H Nguyễn Thị H Mai Thị M Dương Thị T Chẩu Thị Phương C Phan Thu H Nguyễn Thị C Nguyễn Thị Phương T Đặng Thị M Bùi Thị Thu H Nguyễn Thị Kim D Nguyễn Ngọc H Tống Thị L Nguyễn Thị Hồng L Đỗ Minh T Đồng Thị H Phạm Thị V Nguyễn Thị Thu H Nguyễn Thị Thu H Phạm Thị Hồng L Trần Thị H Tơ Thị Thanh T Nguyễn Thị N Hồng Thị M Đinh Thị N Mai Thị H Đặng Thị M Phạm Thị T Đỗ Thị H Nguyễn Thị T Nguyễn Như Q Lê Thị M Đỗ Thị Thanh M Lưu Thị N Đỗ Thị H Dương Thị Đ Nguyễn Thị T 30 24 39 29 32 30 30 36 36 32 25 25 36 34 31 29 26 41 33 25 25 34 27 45 31 31 27 26 34 36 26 27 28 27 26 37 26 Hà Nội Nghệ An Hải Dương Phú Thọ Hà Nội Hà Nội Thái Bình Bắc Ninh Hà Nội Phú Thọ Bắc Ninh Quảng Ninh Nam Định Vĩnh Phúc Hà Nội Hải Phòng Hà Nội Hà Nội Hải Dương Hà Nội Vĩnh Phúc Hà Nội Bắc Ninh Hà Nội Hà Nội Bắc Ninh Hải Phòng Thanh Hóa Thái Bình Hà Nội Hà Nội Bắc Ninh Thanh Hóa Vĩnh Phúc Hải Phòng Hà Nội Hà Nội ... phát số đột biến gen liên quan đến chứng ưa huyết khối di truyền kit CVD-T StripAssay 34 3.3 Mô tả số đột biến gen liên quan đến chứng ưa huyết khối di truyền phụ nữ sẩy thai, thai chết lưu liên. .. phát số đột biến gen liên quan đến chứng ưa huyết khối di truyền kit CVD-T StripAssay 42 4.3 Mô tả số đột biến gen liên quan đến chứng ưa huyết khối di truyền phụ nữ sẩy thai, thai chết lưu liên. .. Khảo sát số đột biến gen liên quan đến chứng ưa huyết khối di truyền phụ nữ sẩy thai, thai chết lưu liên tiếp với hai mục tiêu: Hồn thiện quy trình phát số đột biến gen liên quan đến chứng ưa