VN U ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ne an dP r VŨ PHƯƠNG THẢO ma c y, KHOA Y DƯỢC ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN GIỮA ĐỘ NGƯNG TẬP TIỂU CẦU VỚI KIỂU ed ici GEN CYP2C19*2, CYP2C19*3 VÀ MỘT ho ol of M SỐ YẾU TỐ KHÁC TRÊN BỆNH NHÂN ĐAU THẮT NGỰC KHÔNG ỔN ĐỊNH Sc TẠI VIỆN TIM MẠCH VIỆT NAM Co p yri gh t@ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2018 VN U KHOA Y DƯỢC r ma c Người thực hiện: VŨ PHƯƠNG THẢO y, ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ne an dP ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN GIỮA ĐỘ NGƯNG TẬP TIỂU CẦU VỚI KIỂU GEN CYP2C19*2, CYP2C19*3 VÀ MỘT ici SỐ YẾU TỐ KHÁC TRÊN BỆNH NHÂN ed ĐAU THẮT NGỰC KHÔNG ỔN ĐỊNH ho ol of M TẠI VIỆN TIM MẠCH VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Sc Khóa: QH.2013.Y Co p yri gh t@ Người hướng dẫn: ThS.BS Nguyễn Thị Thúy Mậu ThS.BS Vũ Ngọc Trung Hà Nội - 2018 VN U LỜI CẢM ƠN y, Trong trình học tập thực khóa luận, tơi nhận nhiều ma c quan tâm, giúp đỡ thầy cô, nhà trường, bệnh viện, gia đình bạn bè Lời đầu tiên, với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc nhất, xin trân trọng cảm ơn ThS.BS Nguyễn Thị Thúy Mậu ThS.BS Vũ Ngọc Trung người hướng dẫn r khoa học, người thầy tận tình bảo, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu, tạo điều kiện giúp đỡ suốt q trình thực hồn thành ne an dP nghiên cứu Tôi xin cảm ơn đề tài khoa học công nghệ cấp ĐHQGHN, mã số QG.15.32 cung cấp kinh phí, tạo điều kiện để tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp ici Tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Khoa Y Dược thầy cô môn Y Dược học sở hết lòng quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện tốt để tơi thực nghiên cứu hồn thành khóa luận ed Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bác sỹ nhân viên Viện Tim mạch Việt Nam giúp đỡ nhiều trình thực nghiên cứu ho ol of M Xin bày tỏ lòng biết ơn yêu thương đến gia đình, người thân bạn bè, người bên cổ vũ, khuyến khích, động viên tạo điều kiện giúp đỡ thời gian học tập thực đề tài khóa luận Co p yri gh t@ Sc Cuối xin gửi lời tri ân tới bệnh nhân tham gia vào nhóm nghiên cứu, đóng góp bệnh nhân giúp tơi hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, ngày 28 tháng 05 năm 2018 Sinh viên Vũ Phương Thảo American college of Cardiology: Trường môn Tim mạch Hoa Kỳ AHA ADP CK - MB American Heart Association: Hiệp hội Tim mạch Hoa Kỳ Adenosin diphosphate Creatine Kinase Myocardial Band isoenzyme COX CRP Cyclooxygenase C-Reactive Protein: Protein phản ứng C DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxyrinucleotidtriphosphate ĐMV ĐTNKÔĐ ĐTĐ EDTA Động mạch vành Đau thắt ngực không ổn định Đái tháo đường Ethylendiamin Tetraacetic Acid GTT GP G-protein HCĐMVC Giải trình tự Glycoprotein Group protein Hội chứng động mạch vành cấp HDL LDL MCV MPV NMCT NTTC PCR PGH2 PGI2 High Density Lipoprotein: Lipoprotein có tỷ trọng phân tử cao Low Density Lipoprotein: Lipoprotein có tỷ trọng phân tử thấp Mean Corpuscular Volume: Thể tích trung bình hồng cầu Mean Platelet Volume: Thể tích trung bình tiểu cầu Nhồi máu tim Ngưng tập tiểu cầu Polymerase chain reaction: Phản ứng chuỗi polymerase Prostaglandin H2 Prostaglandin I2 ma c r ne an dP ici ed ho ol of M Sc gh t@ yri SNP THA y, ACC PLT RBC RLCH lipid RFLP Co p VN U DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Platelet Count: Số lượng tiểu cầu Red Blood Cell: Số lượng hồng cầu Rối loạn chuyển hóa lipid Restriction fragment length polymorphism: Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn Single Nucleotide polymorphism: Đa hình đơn nucleotide Tăng huyết áp vWF von Willebrand factor: yếu tố von Willebrand WBC XVĐM White Blood Cell: Số lượng bạch cầu Xơ vữa động mạch VN U Thromboxan A2 Co p yri gh t@ Sc ho ol of M ed ici ne an dP r ma c y, TXA2 VN U DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Trình tự mồi nhân dòng alen CYP2C19*2 CYP2C19*3 .24 y, Bảng 2.2 Quy trình PCR cho alen *2 25 ma c Bảng 2.3 Quy trình PCR cho alen *3 25 Bảng 2.4 Quy trình RFLP để phân tích kiểu gen alen *2 26 r Bảng 2.5 Quy trình RFLP để phân tích kiểu gen alen *3 26 Bảng 2.6 Cách đọc kết kiểu gen CYP2C19 .27 ne an dP Bảng 3.1 Phân bố yếu tố nguy nhóm nghiên cứu 32 Bảng 3.2 Kết cận lâm sàng nhóm nghiên cứu 33 Bảng 3.3 Kết đo độ NTTC bệnh nhân ĐTNKÔĐ 34 Bảng 3.4 Kết đo nồng độ độ tinh sản phẩm tách DNA .34 Bảng 3.5 Kết kiểu gen tần số alen CYP2C19*2 CYP2C19*3 39 ici Bảng 3.6 Tần số phân bố kiểu gen CYP2C19 nhóm nghiên cứu 39 ed Bảng 3.7 Tỉ lệ phân loại theo mức tác dụng dược lý kiểu gen quy định 40 Bảng 3.8 Độ NTTC kiểu gen CYP2C19*3 40 ho ol of M Bảng 3.9 Độ NTTC kiểu gen CYP2C19*2 40 Bảng 3.10 Độ NTTC kiểu tác dụng dược lý kiểu gen quy định 41 Bảng 3.11 Mối liên quan độ NTTC với số yếu tố nguy cơ: Hút thuốc lá, RLCH lipid, ĐTĐ, THA béo phì 42 Bảng 3.12 Mối liên quan độ NTTC với số lượng yếu tố nguy 43 Co p yri gh t@ Sc Bảng 3.13 Mối liên quan độ NTTC với số yếu tố cận lâm sàng .43 VN U DANH MỤC BIỂU ĐỒ y, Biểu đồ 3.1 Phân bố số lượng bệnh nhân ĐTNKÔĐ theo giới .31 Biểu đồ 3.2 Đặc điểm tuổi bệnh nhân ĐTNKÔĐ 31 ma c Biểu đồ 3.3 Phân bố số lượng yếu tố nguy bệnh nhân ĐTNKÔĐ .32 Biểu đồ 3.4 Độ NTTC kiểu gen CYP2C19*2 41 r Biểu đồ 3.5 Độ NTTC tác dụng (giảm + kém) tác dụng bình thường 41 Biểu đồ 3.6 Tần số alen gen CYP2C19 .51 Co p yri gh t@ Sc ho ol of M ed ici ne an dP Biểu đồ 3.7 So sánh tần số phân bố alen CYP2C19 52 VN U DANH MỤC HÌNH y, Hình 1.1 Cơ chế bệnh sinh ĐTNKÔĐ ma c Hình 1.2 Các glycoprotein màng tiểu cầu chức chúng Hình 1.3 Bám dính ngưng tập tiểu cầu Hình 1.4 Cơ chế tác dụng aspirin lên trình NTTC .8 r Hình 1.5 Q trình chuyển hóa clopidogrel cơng thức cấu tạo chất sau bước chuyển hóa ne an dP Hình 1.6 Cơ chế tác dụng clopidogrel lên trình NTTC .10 Hình 1.7 Mô tả single nucleotide polymorphism (SNP) 10 Hình 1.8 Vị trí gen CYP2C19 nhiễm sắc thể số 10 12 Hình 1.9 Vị trí exon (hộp đen) số alen gen CYP2C19 12 Hình 1.10 Vai trò enzyme Cytochrome P450 chuyển hóa thuốc .15 ici Hình 1.11 Quy trình PCR 16 ed Hình 1.12 Các kiểu cắt RE .17 Hình 2.1 Nguyên lý xét nghiệm độ NTTC 28 ho ol of M Hình 3.1 Điện di DNA tổng số gel Agarose 0,7% 35 Hình 3.2 Điện di sản phẩm PCR nhân vùng gen chứa alen CYP2C19*2 (719 bp) CYP2C19*3 (898 bp) gel agarose 1% 35 Hình 3.3 Kết giải trình tự alen CYP2C19*2 36 Hình 3.4 Kết giải trình tự alen CYP2C19*3 37 Sc Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm cắt alen CYP2C19*2 gel agarose 1,5% 38 gh t@ Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm cắt alen CYP2C19*3 gel agarose 1,5% Co p yri .38 VN U MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ y, CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 ma c 1.1 Đau thắt ngực không ổn định 1.1.1 Định nghĩa .3 1.1.2 Cơ chế bệnh sinh ĐTNKÔĐ .3 r 1.1.3 Tiêu chuẩn chẩn đốn đau thắt ngực khơng ổn định 1.2 Tổng quan ngưng tập tiểu cầu .5 ne an dP 1.2.1 Sinh lý tiểu cầu 1.2.2 Quá trình ngưng tập tiểu cầu 1.2.3 Điều trị ức chế NTTC ĐTNKÔĐ 1.2.4 Thuốc chống NTTC aspirin clopidogrel .8 1.3 Tổng quan đa hình di truyền gen CYP2C19 10 ici 1.3.1 Đa hình đơn nucleotide 10 ed 1.3.2 Gen CYP2C19 vai trò chúng chuyển hóa thuốc .11 1.3.2.1 Gen CYP2C19…………………………………………… 11 ho ol of M 1.3.2.2 Vai trò CYP2C19 chuyển hóa thuốc .13 1.3.3 Các phương pháp phát kiểu gen CYP2C19 15 1.4 Tình hình nghiên cứu mối liên quan độ NTTC với kiểu gen CYP2C19 yếu tố khác bệnh nhân ĐTNKÔĐ giới nước 19 Sc 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 19 1.4.2 Tình hình nghiên cứu nước 19 gh t@ CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .21 2.1 Đối tượng nghiên cứu 21 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn .21 Co p yri 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 21 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 21 2.3 Phương pháp nghiên cứu 21 2.4 Nguyên liệu phương tiện nghiên cứu 21 VN U 2.4.1 Hóa chất 21 2.4.2 Thiết bị 22 2.5 Các bước nghiên cứu .22 y, 2.5.1 Quy trình nghiên cứu .22 ma c 2.5.2 Thu thập, xử lý bảo quản mẫu 23 2.5.3 Tách chiết kiểm tra chất lượng DNA tổng số 23 2.5.3.1 Tách chiết DNA tổng số .23 r 2.5.3.2 Kiểm tra chất lượng DNA tổng số .23 ne an dP 2.5.4 Khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C19*2, CYP2C19*3 PCR kiểm tra chất lượng sản phẩm .24 2.5.4.1 Khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C19*2, CYP2C19*3 PCR .24 2.5.4.2 Kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR…………………… 24 2.5.5 Tinh sản phẩm PCR .25 ici 2.5.6 Xác định kiểu gen SNP CYP2C19*2, *3 sử dụng phương pháp ed cắt enzyme giới hạn (RFLP) có đối chiếu với phương pháp ho ol of M giải trình tự 26 2.5.7 Cách đọc kết kiểu gen CYP2C19 27 2.5.8 Xét nghiệm đo độ ngưng tập tiểu cầu 27 2.6 Xử lý phân tích số liệu 29 2.7 Các loại sai số cách khắc phục 29 2.7.1 Sai số mắc phải 29 Sc 2.7.2 Cách khắc phục sai số 30 2.8 Đạo đức nghiên cứu 30 gh t@ CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 31 3.1 Kết quả…………………………… ……………………………… 31 3.1.1 Một số đặc điểm chung 31 Co p yri 3.1.2 Kết đo số số cận lâm sàng 32 3.1.3 Kết đo độ NTTC .34 3.1.4 Kết phân tích kiểu gen CYP2C19*2 CYP2C19*3 34 VN U KẾT LUẬN Nghiên cứu thực 54 bệnh nhân ĐTNKÔĐ điều trị kháng tiểu cầu kép (aspirin clopidogrel) Viện Tim mạch Việt Nam từ tháng 1/2017 đến y, tháng 1/2018, rút số kết luận theo mục tiêu đề sau: ma c Tần số phân bố kiểu gen CYP2C19*2 CYP2C19*3 bệnh nhân đau thắt ngực không ổn định ➢ Alen CYP2C19*2 (c.681G>A): Tần số kiểu gen: GG (51,9%), GA (37%), AA (11,1%) Tần số alen: G/A: 0,7/0,3 r - ne an dP ➢ Alen CYP2C19*3 (c.636G>A): - Tần số kiểu gen: GG (88,9%), GA (11,1%), AA (0%) ed ici - Tần số alen: G/A: 0,94/0,06 ➢ Tần số kiểu gen: *1*1 (44,4%), *1*2 (33,3%), *1*3 (7,4%), *2*2 (11,1%), *2*3 (3,7%) ➢ Tỉ lệ phân loại theo mức tác dụng dược lý kiểu gen quy định: Tác dụng bình thường: 44,4% Tác dụng giảm: 40,7% Tác dụng kém: 14,9% ho ol of M Mối liên quan độ ngưng tập tiểu cầu với kiểu gen CYP2C19*2 CYP2C19*3 số yếu tố khác bệnh nhân đau thắt ngực không ổn định ➢ Trong alen CYP2C19*2 CYP2C19*3 alen CYP2C19*2 có mối liên gh t@ Sc quan chặt chẽ với độ NTTC Ở bệnh nhân mang alen CYP2C19*2 độ NTTC cao hẳn so với bệnh nhân không mang alen (p