BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BỘ Y TẾ Dược HÀ NỘI NGUYỄN CHIẾN BINH NGHIÊN CỨU Đ ặ C ĐI ể M t h ực V ậ T v • • • THÀNH PHẦN HỐ HỌC CỦA MỘT s ố LOÀI Asarum L., DÙNG LÀM THUố C Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC s ĩ Chuyên ngành: Mã sô: Dược HỌC Dược liệu- Dược cổ truyền 60.73.10 Người hướng dẫn: TS NGUYễ N DUY THUẦN TS NGUYỄN VIẾT THÂN Hà Nội - 2007 _ LỜI CÁM ƠN Trong trình nghiên cứu hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, nhận nhiều giúp đỡ quý báu thầy, cô giáo, nhà khoa học đồng nghiệp bạn bè Trước tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Duy Thuần TS Nguyễn Viết Thân, người thầy tận tình hướng dẫn, hết lòng bảo tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu học Đồng thời, xin tỏ lòng biết ơn tới: KS Đinh Văn Mỵ cán Trạm nghiên cứu trồng chế biến thuốc Sa Pa tạo điều kiện giúp đỡ trình lấy mẫu nghiên cứu TS Nguyễn Tập, CN Ngơ Văn Trại, CN Ngô Đức Phương Khoa tài nguyên dược liệu, Viện dược liệu; TS Dương Đức Huyến, CN Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật giúp đỡ việc thẩm định tên khoa loài nghiên cứu TS Phan Văn Kiệm, Ths Nguyễn Xuân Cường cán phòng Xúc tác hữu cơ, Viện hóa học hợp chất thiên nhiên nhiệt tình giúp đỡ, hướng dẫn việc phân lập, biện giải phổ xác định cấu trúc hóa học chất DS.CKI Nguyễn Kim Bích, TS Nguyễn Bích Thu đồng nghiệp khoa Hóa Phân tích tiêu chuẩn, Viện Dược liệu giúp đỡ nghiên cứu, tạo điều kiện sở vật chất động viên tinh thần cho Tôi xin chân thành cám ơn Ban lãnh đạo Viện Dược liệu, phòng Sau Đại học, trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ thực luận văn Cuối xin chân thành cám ơn tới gia đình, người thân toàn thể bạn bè động viên hết lòng giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Hà Nội, tháng 01 năm 2007 Nguyên Chiến Binh Trang Những chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình ĐẬT VẤN ĐỂ Chương TỔNG QUAN 1.1 Thực vật học 1.1.1 Vài nét họ Nam mộc hương (Aristoìochiaceae Juss., 1789) 1.1.2 Một số cơng trình nghiên cứu chi Tế tân (Asarum L.) 1.1.3 Đặc điểm thực vật phân bố số loài chi Tế tân (.Asarum L.) Việt Nam 1.2 Những nghiên cứu thành phần hố học lồi 13 chi Tế tân (.Asarum L.) 1.2.1 Những nghiên cứu tinh dầu 13 1.2.2 Những nghiên cứu thành phần hóa học khác 15 1.3 Tác dụng công dụng số vị thuốc chi Tế tân 17 Chương Đối tượng phương pháp nghiên cứu 19 2.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Nghiên cứu thực vật 19 2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 20 2.2.3 Xử lý kết thực nghiệm 22 Chương THỰC NGHIỆM VÀ Kế T QUẢ 23 3.1 Nghiên cứu thực vật 23 3.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật lồi nghiên cứu 23 3.1.2 Đặc điểm vi học 29 3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 39 3.2.1 Định tính nhóm chất dược liệu 39 3.2.2 Xác định hàm lượng tinh dầu 45 3.2.3 Phân tích thành phần tinh dầu 46 3.2.4 So sánh với thành phần tinh dầu dược liệu Tế tân thu 50 mua thị trường 3.2.5 Nghiên cứu phân lập thành phần hóa học tinh dầu 52 Chương BÀN LUẬN VÀ Kế T LUẬN 61 Bàn luận 61 Kết luận 65 Đề nghị 68 Tài liệu tham khảo 69 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ,3C NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (C arbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) 'H NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Magnetic Resonance Spectroscopy), br Rộng (broad), d Doublet, dd Doublet of doublet, dm Dung môi DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Tranfer ESI-MS Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spay Ionization Mass Spectrometry) GC-MS Sắc ký khí khối phổ HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence HSQC Heteronuclear Singlet Quantum Coherence m Multiple! m/z Tỷ lệ số khối/điện tích ion q Quarlet p.u Phản ứng RP Pha đảo (Reversed phase), s Singlet SKLM Sắc ký lớp mỏng SKC Sắc ký cột TT Thuốc thử t Triplet DANH MỤC CÁC BẢNG 1.1 Danh mục lồi chi Asarum L có Trung Quốc 1.2.Thành phần tinh dầu rễ loài Asarum forbesii 15 Maxim 3.1 Đặc điểm hình thái thực vật lồi nghiên cứu 26 3.2 Bảng kết định tính nhóm chất dược liệu 44 3.3 Bảng kết hàm lượng tinh dầu phận khác 45 Tế hoa Petelot 3.4 Bảng kết hàm lượng tinh dầu phận khác 45 Thổ tế tân 3.5 Thành phần tinh dầu phận 46 Tế hoa Petelot 04 petelotiỉ O.C.Schmidt) 3.6 Thành phần tinh dầu dược liệu phận 48 Thổ tế tân 04 caudigerum Hance) 3.7 Thành phần tinh dầu dược liệu Tế tân bắc thân rễ 51 Tế hoa Petelot 3.8 Số liệu phổ 'H-NM R phổ l3C-NMR AP2 57 3.9 Kết phổ HSQC HMBC AP2 58 DANH M ỤC CÁC H ÌN H Trang 24 Hình 3.1 Ảnh lồi Asanim sp l Hình 3.2 Ảnh hoa Asarum spl 24 Hình 3.3 Các phận cấu tạo hoa loài Asarum sp l 24 Hình 3.4 Ảnh lồi Asarum sp2 25 Hình 3.5 Ảnh mang hoa lồi Asarum sp2 25 Hình 3.6 (a, b, c) Hoa lồi Asarum sp2 25 Hình 3.7 (a,b) Ảnh bầu bổ dọc ảnh bao phấn lồi Asarum sp2 25 Hình 3.8 Gân T ế hoa Petelot (A peteỉotii c Schmidt) mang 30 lơng che chở Hình 3.9 Vi phẫu Tế hoa Petelot 04 petelotii o c Schmidt) Hình 3.10 Gân Thổ tê tân (Asarum caudigerum Hance) mang lơng 30 31 che chở đa bào Hình 3.11 Vi phẫu Thổ tế tân (Asarum caudigerum Hance) 31 Hình 3.12 Gân phiến Thổ tế tân (A caudigentm Hance) mang 32 lơng che chở Hình 3.13 Một phần vi phẫu thân Tế hoa Petelot (A petelotii 32 o c Schmidt) Hình 3.14 Một phần vi phẫu thân Thổ tế tân (A caudigerum Hance) 33 Hình 3.15 Một phần vi phẫu rễ Tế hoa Petelot 34 (A petelotỉì c Schmidt) Hình 3.16 Một phần vi phẫu rễ Thổ tế tân (A caudigerum Hance) Hình 3.17 Các đặc điểm bột dược liệu Tế hoa Petelot (A peteìotỉỉ o c Schmidt) 36 Hình 3.18 Các đặc điểm bột dược liệu Thổ tế tân 37 (A caudigerum Hance Hình 3.19 Sắc ký đồ chất AP2 hệ dm I 56 Hình 3.20 sắc ký đồ chất AP2 hệ dm II 56 Hình 3.21 Một số tương tác 59 Hình 3.22 Cấu trúc hố học AP2 phổ HMBC AP2 59 ĐẶT VÂN ĐỂ Công tác điều tra, khảo sát sưu tầm dược liệu năm gần thu kết khả quan có nhiều chuyển biến tích cực, đến biết khoảng 3.800 loài làm thuốc tổng số 11.000 loài thực vật có mặt Việt Nam [4] Dược liệu nước nguồn thuốc quan trọng cho Y học cổ truyền, nguyên liệu cho công nghiệp dược cho xuất Vị thuốc “Tế tân” khai thác từ nhóm lồi chi Asarum L thuộc họ Nam Mộc hương (Aristoỉochiaceae) Tế tân vị thuốc sử dụng lâu đời y học cổ truyền Việt Nam y học cổ truyền Trung Quốc Theo Dược điển Việt Nam III Dược Điển Trung Quốc qui định [10], [29] vị thuốc Tế tân toàn Bắc tế tân (Asarum heterotropoides Fr var mandshuricum Maxim.) Kitag.), Hán thành tế tân (A sieboldii Miq var seulense Nakai) Hoa tế tân (A sieboỉdii Miq.)- Qua tìm hiểu khảo sát thị trường tham khảo số tài liệu thấy vị thuốc Tế tân nhân dân sử dụng nước nhập chủ yếu từ Trung Quốc, loài Tế tân chưa thấy phát mọc nước ta Cùng với việc sử dụng vị thuốc Tế tân nhập nội từ Trung Quốc nhân dân địa phương đặc biệt số đồng bào dân tộc (Dao, H’mông) số vùng núi thuộc tỉnh phía bắc nước ta dùng dược liệu “Tế tân” thu hái từ nguồn mọc hoang với tên gọi Hoa tiên, Trầu tiên, Thổ tế tân, để làm thuốc chữa viêm phế quản, ho khan, ho có đờm, hen suyễn, chữa tê thấp, đau nhức trúng phong hàn, co quắp Ngồi lấy hoa ngâm rượu dùng làm thuốc bổi bổ thể [4], [5], [20], Do vùng phân bố loài hẹp, sống điều kiện khí hậu mát, lạnh quanh năm độ cao khoảng 1000m, nhu cầu sử dụng nhiều nên số loài chi Tế tân nước ta ngày cạn kiệt có nguy bị đe dọa tiêu diệt cao, số loài chi Tế tân đưa vào sách đỏ Việt Nam [6] Theo số tài liệu [2], [9], [11], [20] cơng bố chi Tế tân (Asarum L.) Việt Nam có khoảng lồi, loài: A balansae Franch.; A blumei Duch.; A caudigenim Hance; A glabrum Merr.; A petelotii o c Schmidt; A reticulatum Merr loài A wulingense F Liang Hiện tài liệu đề cặp đến chi Tế tân Việt Nam dừng lại việc thống kê sơ mặt thực vật học, chưa thấy có tác giả nghiên cứu sâu thực vật hố học lồi chi Tế tân Việt Nam Vì vậy, để góp phần nghiên cứu, sử dụng phát triển nguồn dược liệu nước có hiệu hơn, chúng tơi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật thành phần hố học sơ lồi Asarum L dùng làm thuốc Việt Nam” Đề tài nhằm mục tiêu thu thập số lồi Tế tân có mọc Việt Nam, nghiên cứu thực vật bước đầu nghiên cứu số thành phần hóa học dược liệu Để đạt mục tiêu trên, đề tài thực nội dung sau: • Nghiên cứu đặc điểm hình thái thực vật đặc điểm hiển vi dược liệu loài chi Tế tân (Asarum L.) • Nghiên cứu hóa học: - Định tính thành phần hóa học có dược liệu - Xác định hàm lượng tinh dầu phân tích thành phần hố học tinh dầu dược liệu - Phân lập nhận dạng thành phần tinh dầu Display Report - Selected Window Selected Analysis Analysis Name: Kiem0084.d Method: Quang06.m Sample Name: Binh- AP2 Instrument: LC-MSD-Trap-SL Print Date: 12/12/2006 2:34:00 PM Operator: Phuong Acq Date: 12/12/2006 2:29:33 PM Analysis Info:Binh- AP2 LC/MS MSD T p Report V (A4-Opt2) Pa ge of A g ile n t Te ch n o lo g ie s gOl-X SU0ỊUI SW/J1 2dV -Mu!9 ZdV -ụuia Wd Z£-6Z-Z 900Z/ZI/ZI :3}ea -bDV Nd W -Z 900Z/ZT/2I : e a lU ỊJ d õuonqd -Ịs-deji-asw0"l :jo Ịe j3 d o :iU3uinjỊsui SỊSẢỊBUV P P Ị S M o p u Ị M p a p a p s - } J d y Ả e |d S ỊQ urgoBuenò P>800L U 3!» : o j u i SỊSÁỊEUV :auJEN 3|duies :p o q ia w :aujBN s ị s Aịg u v (T»[^voLnc\jLnu2c\jLn''3’ocrỉt-Hr'i^r'^^rO(NHHOơ^ơ^r'ơìơiooco^)'i)^)ư)ưìưì,s r ^ ^ ^ r s'ơ \r' ư)'D^DưìLnLninưìưìưiLT)ưìưìưiưìư)LOLnưìưìư)ưìư)ưiưìư)mfr)fO n r O n O ì ì ^ m K T l C D C D C O O O O O O O O O O O O O O O C O C N l l N o o o C u rre n t D ata P a m e te rs NAME BINH_AP2 EXPNO PROCNO F2 - Acqui s i t i o n P a m e te rs 20061204 D ate_ 12.02 Time av500 INSTRUM PROBHD mm M u ltin u c l zg30 PULPROG 65536 TD CDC13 SOLVENT 16 NS DS 10000.000 Hz SWH 0.152588 Hz FIDRES 3.2769001 se c AQ RG 0 0 u se e DW 0 u se e DE TE 0 K 1.00000000 se c D1 0.00000000 se c MCREST 0.01500000 se c MCWRK ======== CHANNEL f l ======== NUC1 IK PI 0 u se e PL1 - 0 dB SFOl 500.1335009 MHz F2 - P ro c e s s in g p a m e te rs SI 32768 SF 500.1300179 MHz WDW EM SSB LB Hz GB PC 0 p pm Ạ ư~) \—I CM CT> A CM Os] • CO KO \—1 • 00 CM I—1 cr> CM CO C u rre n t D ata P a m e te rs BINH AP2 NAME EXPNO 1 PROCNO CM ro F2 - Acqui s i t i o n P a m e te rs 20061204 D ate_ 12.02 Time av500 INSTRƯM PROBHD mm M u ltin u c l zg30 POLPROG 65536 TD CDC13 SOLVENT 16 NS DS 10000.000 Hz SWH 0.152588 Hz FIDRES 3.2769001 se c AQ 50.8 RG 0.000 u se e DW 0 u se e DE 0 K TE 1.00000000 se c D1 0.00000000 se c MCREST 0.01500000 se c MCWRK ======== CHANNEL f l ======== NUC1 1H PI 0 u se e PL1 _ - ? 00 dB SFOl 500.1335009 MHz F2 - P ro c e s s in g p a m e te rs SI 32768 SF 500.1300179 MHz WDW EM SSB LB Hz GB PC 00 6.5 6.4 o o o 6.3 I "vi1 ro o 1— 1— 6.2 6.1 6.0 5.9 k cr> ư) 5.8 5.7 5.6 5.5 5.4 5.3 5.2 5.1 CM LO \—1 \—1 CO CM 5.0 ppm # ADDRESS 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 17343.2 17346.9 17397.5 18053.4 18075.5 18086.6 18101 18108.6 18119.9 18131.0 18141 18163.9 19446.3 19451.5 19457 19462.3 19490.3 19494 19499.8 19507.0 19512.7 19518.2 19523.1 19526.9 19530.9 19536.6 21439.8 22404.0 22425.9 27797.0 FREQUENCY [Hz] [PPM] 3190.242 6.3788 3189.119 6.3766 3173.672 6.3457 2973.496 5.9454 2966.753 5.9320 2963.358 5.9252 2958.738 5.9159 2956.668 5.9118 2 5.9049 2949.828 5.8981 2946.489 5.8914 2939.780 5.8780 2548.434 5.0955 2546.830 5.0923 2545.160 5.0890 5.0858 2543.539 5.0687 2535.009 5.0664 2533.850 2532.097 5.0629 2529.888 5.0585 5.0550 2528.149 5.0517 2526.488 5.0487 2524.995 2523.817 5.0463 2522.604 5.0439 2520.860 5.0404 1940.061 3.8791 1645.818 3.2908 1639.119 3.2774 -0.003 -0.0000 INTENSITY 40 2.34 2.55 0.63 0.42 14 1 52 1.54 0.54 47 Ọ 76 0.38 0.51 1.12 1.18 0.52 0.75 1.28 1.17 1.16 1.25 0.73 0.83 1.27 94 0.41 16.00 2.39 2.39 2.53 LO co 00 co ro LO ì 00 cn ƠI ro r o CN m LO ro ^ r— cn co co ro rr- C N J ÍO Ư“) K inD cr> r o 'X) CM CM rH o o o m o o o CNl o C urrent Data Param eters NAME BINH AP2 EXPNO PROCNO F2 - A c q u isitio n Param eters 20061204 Date_ 11.05 Time INSTRUM av500 PROBHD nưn M ultinucl zgpg30 PULPROG TD 65536 SOLVENT CDC13 128 NS DS SWH 32679.738 Hz 0.498653 Hz FIDRES 1.0027661 see AQ RG 2580.3 DW 15.300 usec DE 6.00 usec TE 300.0 K DI 2.00000000 see d ll 0.03000000 sec DELTA 1.89999998 sec MCREST 0.00000000 sec MCWRK 0.01500000 sec NUC1 P1 PL1 SF01 ■ UilANNiljJj r 13C 6.50 usee -3.00 dB 125.7703643 MHz CPDPRG2 NUC2 PCPD2 PL2 PL12 PL13 SF02 : CHANNEL f2 = w altzl6 1H 88.00 usee -3 0 dB 15.98 dB 22.00 dB 500.1320005 MHz F2 - P ro cessin g param eters SI 32768 SF 125.7577883 MHz WDW EM SSB LB 1.00 Hz GB 0 “1 80 T I 60 T ĩ 40 T I 20 Ị ' ppm # ADDRESS 10 11 12 13 14 15 10220.0 108 11670.1 12016.3 12157.1 14386.7 15403.9 16044 16228 19243.0 19275.0 19307.1 21861.7 23920.3 28994.0 = k h , NAME=BINH_AP2, EXPNO=2, PROCNO=l M I = OOcm, MAXI=10000 OOcm, PC=1 0 FREQUENCY INTENSITY [Hz] [PPM] 18723.389 148.8845 5.12 18051.146 143.5390 4.60 17277.217 137.3849 9.39 16931.947 134.6393 4.86 16791.557 133.5230 3.44 14567.922 115.8411 10.72 5 107.7741 12.45 12914.938 102.6969 12.50 12731.215 101.2360 12.02 9724.703 77.3288 11.65 9692.736 77.0746 11.81 9660.801 76.8207 11.38 7113.063 56.5616 11.53 5059.973 40.2359 11.28 0.004 0.0000 1.52 DEPT90 ■I I I I I I I I I ’"n " 'I ! ! , ! - - I I I 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 ppm 200 190 180 170 160 50 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 ppm C 13C PD ' ' I I I " I 200 190 180 170 TTỴI .I" — 'T ' I I I r 160 50 140 130 120 110 100 I I I r I I I - ■.■.■■p-.-rn-r^-^rnyrnr.-r 90 80 70 60 50 40 30 20 ppm # ADDRESS 10778.4 13601.3 14658.8 15324 15515.6 21369.8 23509 477 782 FREQUENCY [Hz] [PPM] 17277.203 137.3848 14568.150 115.8429 13553.330 107.7733 12914.877 102.6964 12731.103 101.2351 7113.002 56.5611 5060.011 40.2362 2 1 17.5875 -0.300 -0.0024 INTENSITY 2.33 - 08 4.59 4.39 -3.91 6.50 - 14 0.19 0.25 Jí £ p (S's -o BINH-AP2 -CDC13-HMBC BINH-AP2 -CDC13-HMBC BINH-AP2 -CDC13-HSQC 1-allyl-3-methoxy-4,5-methylenedioxybenzene (Myristicin) 04/Jan/2007 15:50:28 ACD/HNMR DB (v.6.12) M H a \l4^ 14b J 2j Grp.1 11 Grp.2 Value Error 11 9.40 2j 3j 3j 12 12 15.53 2.80 2.40 13a 14a 15.79 — 13a 14b 11.57 — Group nH Shift 2 5.96 Error 0.05 5.96 0.05 6.52 0.05 1 6.06 0.03 11 12 3.89 3.30 0.05 0.06 13a 5.94 0.01 14a 5.16 0.07 14b 5.10 0.05 2 22 T " ” JUL IF IF 17" le] 15] 1Ã~ im IF nr TT lo­ in in JZL ~T~ in Tj ■ỊlẠbl IỊ4?] Tị SZljriiM- Tl TỊ J139L Ti TT TT n r r r r p 10 n r r t I ) T T |T T T T | r i I > Ị n r I rTTTTỴ TTTTTTT I IỴTTTT-Tr r r i ' i m r r m n r i - p n r r TTTTTT p T T T T i rT t I I T T T T T T T -ry r r r rr T T T r n T T T T T T T 04/Jan/2007 15:49:17 ACD/CNMR DB (v.6.12) Carbon No CHo 14 LL 13 Conf Limits 101.28 149.69 0.2 2.8 c c CH 136.32 0.3 1.9 107 0.9 131.76 2.3 103.63 3.9 11 c CH CH 56.16 0.5 12 CH 40.24 0.9 13 CH CH 138.18 1.7 115.51 1.1 c 14 o 148.46 10 ' 120] - ĩTẽl ĨĨÕỊ 138.18(13) 105] CHn CH Chem Shifts 115.5K14Ì /: 103.63(9) 107.00(7) r 101.28(2) 56.16(11^ 40.24(12) 0 95 I IkT &5~ tT Tsl 7Õl 65 Ị ÌĨÕị 55 I 45“ 4ÕT ■351 3Õ ị 148.46(6) 149.69(4) ' 136.32(5) 25 j " ^ ~Ĩ5~ 10 I T r r r p - r m - m I"ỊT'VT'1' I 1 I I I I I I I I I I I I I r m TTT-r-rpr I rT n~r I I I-| I I I I I ĩ I I I I I I r r r r ij- r I I I I I I I I I I I I I I I I I II r I II I ] I I 11 II I I I I I I I I 1 I I 1Ị r n r r r m - j T 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 ... Ị3-Asarone 1,1 0,8 10 Terpinolene 0,3 - 21 2 ',5 '-Dimethoxy 1,1 3,0 11 Borneol 1,7 0,4 22 a-Asarone 1 9,2 5 8,8 1.2.2 Những nghiên cứu thành phần hóa học khác Ở Việt Nam nghiên cứu hóa thực vật l i thuộc... 86 loài (bao gồm 69 loài đặc hữu ), Đài Loan có chi với 11 l i Ở Việt Nam có chi với khoảng 20 loài, mọc hoang [2 ], [9 ], [11 ], [16 ], [26 ], [30 ], [34 ], Đặc điểm chung họ Nam mộc hương (Aristolochiaceae... tân Việt Nam Vì vậy, để góp phần nghiên cứu, sử dụng phát triển nguồn dược liệu nước có hiệu hơn, tiến hành đề tài Nghiên cứu đặc điểm thực vật thành phần hoá học sơ l i Asarum L dùng l m thuốc