TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN TÁCH CHIẾT POLYPHENOL TỪ LÁ ĐÀO TIÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP RSM VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA TỪ LÁ VÀ QUẢ ĐÀO TIÊN (Crescentia cujute) Người hướng dẫn: Th.S ĐOÀN THIÊN THANH Người thực hiện: TRẦN VƯƠNG GIA ĐẠI Lớp: 14060301 Khố: 18 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019 TĨM TẮT Sinh viên: Trần Vương Gia Đại Đề tài:”Tối ưu hóa điều kiện tách chiết polyphenol từ đào tiên phương pháp RSM khảo sát khả kháng oxy hóa từ đào tiên (crescentia cujute L.)” Giảng viên hướng dẫn: Th.S Đoàn Thiên Thanh Địa điểm: Phòng thí nghiệm Hóa Nơng – Viện Cơng Nghệ Hóa Học Thành phố Hồ Chí Minh Đề tài thực nhằm khảo sát điều kiện thích hợp để tách chiết polyphenol từ đào tiên Từ đó, tối ưu hóa quy trình tách chiết polyphenol từ mẫu có hàm lượng polyphenol cao để thu nhận hàm lượng polyphenol cao đánh giá tương tác qua lại yếu tố khảo sát ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol Bên cạnh đó, khảo sát khả kháng oxy hóa từ cao chiết đào tiên Kết đề tài nghiên cứu sau: Điều kiện thích hợp để thu hàm lượng polyphenol từ đào tiên là: dung môi methanol 60% với tỉ lệ nguyên liệu dung môi 1:20 thời gian 24 giở nhiệt độ phòng Và sau thực phương pháp RSM, giá trị tối ưu để thu hàm lượng polyphenol từ đào tiên dung môi methanol 59,3% với tỉ lệ nguyên liệu dung môi 1:23,3 thời gian 30,73 giở nhiệt độ phòng Điều kiện thích hợp để thu hàm lượng polyphenol từ đào tiên là: dung môi methanol 70% với tỉ lệ nguyên liệu dung môi 1:15 thời gian 24 giở nhiệt độ phòng Cao chiết từ đào tiên thể hoạt tính chống oxy hóa tương đối cao với giá IC50 khả bắt gốc tự DPPH 39,79 (mg/mL) Cao chiết từ đào tiên thể hoạt tính chống oxy hóa với giá IC50 khả bắt gốc tự DPPH 77,22 (mg/mL) CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Từ xa xưa, người biết sử dụng cỏ từ thiên nhiên để chữa bệnh làm nguồn dược liệu quí báu dân gian Nước ta có diện tích tương đối khơng rộng lớn có đường bờ biển dài khí hậu nhiệt đới gió mùa, lượng mưa năm cao Những điều kiện thuận lợi góp phần tạo nên hệ sinh thái thực vật đa dạng phong phú Theo thống kê gần đây, ước tính đất nước Việt Nam có khoảng 10.000 lồi, có khoảng 3.000 loài thực vật sử dụng để làm dược liệu dân gian Vậy nên nhiều loài chưa khai thác đào sâu vào cơng dụng tìm hiểu cơng dụng phổ biến rộng rãi Ngày nay, người luôn dành quan tâm đặc biệt cho vấn đề liên quan đến sức khỏe sắc đẹp hợp chất thiên nhiên loại cỏ thiên nhiên lại ý đến nhiều Gốc tự nguyên nhân gây nguyên nhân lão hóa nhiều bệnh tật bao gồm bệnh lý não, mắt, hệ miễn dịch,… Ở mức độ nặng, gốc tự gây nên ung thư quan Từ đó, hợp chất tự nhiên có thảo dược flavonoid, vitamin A, vitamin E, anthocyanin,… ý đến sử dụng bảo vệ thể khả trung hòa gốc tự chúng Hiện nay, nhà khoa học tìm nhiều hợp chất tự nhiên có tác dụng định thể loài thảo dược, đưa hợp chất dạng thực phẩm chức đưa thị trường Các hợp chất tự nhiên có ưu điểm vượt trội so với hợp chất hóa học tổng hợp hoạt tính kháng oxy hóa, khả kháng khuẩn, kháng nấm,… Cây đào tiên (crescentia cujute L.) biết đến loài thực vật sử dụng để lấy dược liệu chữa bệnh dân gian ho, nhuận tràng, kích thích tiêu hóa,… hiệu Từ báo cáo nghiên cứu sơ đào tiên, người ta tìm thấy thành phần hóa học có chứa lượng polyphenol Đây hợp chất tự nhiên thực vật có hoạt tính kháng oxy hóa, có ý nghĩa sức khỏe người Q trình trích ly biết đến rộng rãi trình tách chiết hợp chất có hoạt tính sinh học từ ngun liệu (Chew et al.,2011) Quy trình khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến q trình trích ly hợp chất tự nhiên nhằm tìm điều kiện thích hợp cho hàm lượng hợp chất cao thường thực theo phương pháp truyền thống Đó là, thay đổi theo mức độ yếu tố cố định thơng số yếu tố lại Tuy nhiên, phương pháp truyền thống tương quan qua lại yếu tố với quy trình Để giải vấn đề nêu phương pháp đáp ứng bề mặt (Response Surface Method) đời Đây là phương pháp sử dụng toán học xử lí thống kê cho phép nghiên cứu tương tác yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quy trình, đồng thời đưa dự đoán giá trị tối ưu yếu tố (Plackett & Burman, 1946) Từ điều trên, đề tài:”Tối ưu hóa điều kiện tách chiết polyphenol từ đào tiên phương pháp RSM khảo sát khả kháng oxy hóa từ đào tiên (crescentia cujute L.)” thực 1.2 Mục đích đề tài Tối ưu hóa điều kiện tách chiết polyphenol từ đào tiên (crescentia cujute L.) phương pháp RSM nhằm tìm kiếm giá trị tối ưu yếu tố ảnh hưởng nhằm thu hàm lượng polyphenol cao Đồng thời, sử dụng cao chiết để khảo sát khả kháng oxy hóa từ đào tiên 1.3 Yêu cầu Xác định điều kiện thích hợp để tách chiết polyphenol từ đào tiên Xác định giá trị tối ưu yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol tách chiết thể tương tác yếu tố Xác định khả kháng oxy hóa cao chiết từ đào tiên CHƯƠNG II: TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu đào tiên 2.1.1 Vị trí phân loại thực vật Hình 2.1 Cây Đào Tiên (Crescentia cujete) (Nguồn: http://en.hortipedia.com/wiki/Crescentia_cujete) Danh pháp khoa học: Crescentia cujete Giới: Plantae (không phân hạng): Angiospermae (không phân hạng): Eudicots (không phân hạng): Asterids Bộ: Lamiales Họ: Bignoniaceae Chi: Crescentia Loài: Crescentia cujute L (Đỗ et al.,2004) Tên gọi khác: Cây bòng, trường thọ 2.1.2 Đặc điểm hình thái Đào tiên thuộc dạng thân gỗ trung bình, điều kiện tự nhiên đạt chiều cao 6m, tán rộng, xanh tươi quanh năm Cây hoa quanh năm, sinh trưởng với tốc độ trung bình, sống điều kiện thời tiết khác Cây ưa sáng, nhu cầu nước trung bình, nhân giống từ hạt (Phạm et al.,1999) Lá xanh đậm, nhẵn, dày cứng, dạng thn dài mọc thành vòng, hình muỗng, thon hẹp dài gốc, chóp thon, dài 10-15cm, rộng 3-4 cm, mọc khít thành chùm hay hơn, men cuống (Hình 2.2a) Hoa thường mọc đơn độc đầu cành hay kẽ lá, to, buông rũ xuống, với cánh tràng màu vàng xanh, gốc màu đỏ tía, điểm hạt nhỏ, hợp thành ống loe đỉnh chia thành mơi, có nhị (Hình 2.2b) Quả mọng hình cầu hình trứng đường kính 6-12 cm, giống dạng bưởi, vỏ cứng có màu xanh; có thịt (còn gọi cơm hay nạc), màu trắng, vị chua, có nhiều hạt dẹt nhỏ, vỏ hạt dày cứng Nhưng cơm nạo ra, để trời nhanh chóng bị chuyển sang màu đen (Hình 2.2a) b a Hình 2.2 Bộ phận đào tiên a) Quả b) Hoa (Nguồn: http://www.richardlyonsnursery.com/crescentia-cujete-calabash-tree2/ https://www.flickr.com/photos/mazuu/14201799773) 2.1.3 Nguồn gốc, phân bố Họ núc nác (Bignoniaceae) họ lớn với nhiều chi, chủ yếu vùng nhiệt đới trừ số chi vùng ôn đới Chi Crescentia chi loài vùng nhiệt đới châu Mỹ từ Mexico Tây Ấn đến vùng Amazon Brazil Cây đào tiên (Crescentia cujute) loài trồng rộng rãi suốt thời tiền sử phạm vi ban đầu chưa khám phá (Phạm et al., 2006) Ngày nay, đào tiên trồng hầu khắp nước nhiệt đới Cựu lục địa Có hai lồi nhập vào Đông Nam Á C alata C cujete Ở Việt Nam, chi Crescentia có đại diện đào tiên (C cujete), trồng chủ yếu tỉnh phía nam, từ Quảng Ngãi, Bình Định đến hầu hết tỉnh đồng sông Cửu Long Cây đào tiên ưa sáng, ưa khí hậu nóng ẩm vùng nhiệt đới, sinh sống điều kiện khác kể điều kiện khắc nghiệt nhất, trồng nhiều loại đất Tuy nhiên cần phải chăm sóc cách khơng nên để thiếu nước héo cho không mọng, đẹp Thời điểm thích hợp để trồng non mùa xuân, đất ẩm ướt có mưa phùn Cây phát triển nhanh đặc biệt chăm nhiều Muốn cho đào tiên hoa kết nhiều quả, cần có kế hoạch cách chăm sóc vơ kỹ lưỡng Bởi lẽ đào tiên có mang lại giá trị vô lớn Yêu cầu đất trồng phải đảm bảo đủ dinh dưỡng mức trung bình, thơng thống nước tốt, có hàm lượng hữu cao Trong trình trồng Đào tiên cần phải bón phân lân phân đạm để kích thước tăng trưởng cho Mỗi năm nên bón khoảng lần chia theo tháng Quá trình trồng đào tiên cần để ý tới loại sâu bệnh thối gốc, chảy mủ…Những loại bệnh tạo điều kiện thuận lợi cho loài nấm Phythopthora spp phát triển Cần phải tránh loại bệnh cách phun thuốc Aliette 2,5%, Ridomil 2% để phòng bệnh Ngoài đào tiên hay bị bệnh lt, sâu bò vẽ, bọ xít xanh, sâu đục thân đục cành cần phòng trừ bệnh từ đầu Để đảm bảo không bị hưởng thuốc bảo vệ thực vật tự bắt sâu móc sắt, phun loại thuốc đặc trị theo hướng dẫn bao bì Cây đào tiên có thời gian trồng thời gian thu hoạch khoảng từ 4-5 năm so với giống ăn khác Quả đào tiên có hình cầu hình trứng, trơng giống bưởi, lớp vỏ màu xanh, lúc non mỏng, già vỏ cứng dần 2.1.4 Thành phần hóa học tác dụng dược lý Vỏ rễ đào tiên chứa β – sitosterol, acid ursolic, acid vanillic acid – hydroxybenzoic Quả thu hái Việt Nam chứa 15 chất, có iridoid glucosid, iridoid, chất – hydroxyoctanol glycoside, chất 2,4 – pentanediol glycoside chất – hydroxyl – pentanon (Đỗ et al.,2004) Cao methanol vỏ rễ đào tiên có tác dụng ức chế vi khuẩn gram dương Acid vanillic có nồng độ ức chế thấp 125 175 µg/ml Staphylococcus aureus Bacillus subtilis tương ứng; acid – hydroxybenzoic có nồng độ ức chế thấp 250 µg/ml hai chủng vi khuẩn (Đỗ et al.,2004) 2.1.5 Cơng dụng Quả đào tiên ăn phần lớn loại dùng làm thuốc chữa bệnh Do thành phần đào tiên có nhiều dược tính điều trị đươc nhiều loại bệnh kể đến nhuận trường, tẩy xổ trị tình trạng ngủ hiệu (Đỗ et al.,2004) Theo số tài liệu có nói đào tiên có tác dụng tăng cường tuổi thọ, trị suy nhược thể, dưỡng sinh lực điều hòa kinh lạc Ngồi ra, đào tiên làm siro trị viêm họng, ho, viêm họng mạn Nhân hạt đào vị đắng ngọt, tính bình, có cơng hiệu phá huyết tan ứ, có tác dụng hoạt huyết hành huyết, làm tan huyết tự ứ, làm tan đờm, nhuận tràng, điều hòa chức quan hô hấp, giảm ho Trong điều trị lâm sàng, đào nhân thường dùng chữa trị bế kinh, đau bụng kinh, cao huyết áp, viêm ruột thừa, tụ huyết sưng đau chấn thương Đối với chứng liệt nửa người tắc nghẽn mạch máu, đào nhân có tác dụng điều trị định Còn phần rễ đào dùng ngồi da có tác dụng chữa sưng đau, sắc uống chữa bệnh viêm gan vàng da Nếu thường xuyên ăn trái đào tiên giúp bạn tăng cường tuổi thọ, trị suy nhược thể hàng ngày, giúp điều hòa kinh lạc…Nếu lấy trái đào tiên chưa chín hết có cơng dụng đặc biệt giúp nhuận tràng, chống táo bón Ở số nước khác, phần cơm đào tiên người ta nấu chín với đường tạo thành chất siro chữa ho hiệu Phần vỏ đào tiên nghệ nhân sử dụng để tạp hình, khắc chữ, khắc hình họa lên vỏ làm đồ thủ công mỹ nghệ đẹp đem lại giá trị kinh tế cao Còn với người Việt ta, theo kinh nghiệm dân gian cha ông ta để lại, đào tiên có tính thảo dược, người ta dùng để chữa nhiều bệnh nhuận trường, tẩy xổ, làm mứt dẻo, chữa chứng ngủ, ăn không ngon…  Một số thuốc kết hợp từ đào tiên: Lấy chín xào với rượu đế trắng, nóng để vào vải mỏng, đắp lên chỗ đau, bó lại bóp tay chân, trị đau nhức khớp Nếu dùng chín phơi thả sương đêm, sau phơi nắng, ngâm rượu đế thơm uống, có tác dụng trị nhức mỏi Cơm đào tiên phơi khô cho héo, đem sắc nước uống giúp ăn được, ngủ được; làm êm dịu trường hợp bị căng thẳng thần kinh, tim hồi hộp; giúp người gầy yếu, suy dinh dưỡng cảm thấy khỏe hơn; giúp bổ phổi, chữa ho làm dễ thở trường hợp bị suyễn Bên cạnh đó, lấy cơm trái đào tiên cho vào rượu gạo với tỉ lệ 1:5 ngâm từ 710 ngày, sau ngâm ngày bạn uống từ 2-3 lần, lần 30ml trước ăn đảm bảo bạn ăn ngon miệng nhiều đặc biệt tốt cho tiêu hóa 4.2.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu dung môi đến hàm lượng polyphenol Ngoài yếu tố loại dung mơi nồng độ dung mơi tỉ lệ ngun liệu dung mơi góp phần ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol (Bảng 4.5, biểu đồ 4.3, phụ lục 7) Bảng 4.5 Ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu dung môi tách chiết đến hàm lượng polyphenol đào tiên Tỉ lệ nguyên liệu Hàm lượng polyphenol (mg GAE/mg ck) Hàm lượng polyphenol (mg GAE/mg ck), X±D Mẫu Mẫu dung môi 1:10 3,71d ± 0,61 16,49c ± 1,47 1:15 7,25d ± 0,50 31,50a ± 2,69 1:20 55,52a ± 0,85 20,49b ± 0,22 1:25 39,47b ± 3,47 19,09bc ± 0,43 1:30 26,68c ± 3,03 18,24bc ± 0,88 a,b,c,d: khác biệt có nghĩa theo xử lí thống kê phân hạng theo hàng dọc mức 5% 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 1:10 Mẫu 1:15 1:20 1:25 1:30 Mẫu Tỉ lệ mẫu dung môi (g/mL) Biểu đồ 4.3 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu dung môi tách chiết đến hàm lượng polyphenol đào tiên Dựa vào bảng 4.5 biểu đồ 4.3, có kết hiệu suất trích ly dung mơi với tỉ lệ nguyên liệu dung môi khác Qua đó, mẫu lá, tỉ lệ cho hàm lượng polyphenol cao tỉ lệ 1:20 với 55,52 ± 0,85 (mg GAE/mg ck), vượt trội hẳn kết khác biệt có ý nghĩa so với tỉ lệ khác thí nghiệm mẫu Do đó, điều kiện methanol 60% tỉ lệ 1:20 điều kiện thích hợp để sử dụng cho thí nghiệm mẫu Tương tự vậy, mẫu quả, tỉ lệ cho hàm lượng polyphenol cao tỉ lệ 1:15 với 31,50 ± 2,69 (mg GAE/mg ck), hàm lượng cao khác biệt có ý nghĩa so với tỉ lệ khác thí nghiệm mẫu Mặc dù, hàm lượng polyphenol thấp hẳn so với nhiều so sánh thí nghiệm kết cao thí nghiệm khảo sát Vì vậy, khảo sát đào tiên chọn điều kiện methanol 70% tỉ lệ 1:15 để tiếp tục sử dụng cho mẫu thí nghiệm 4.2.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng thời gian tách chiết đến hàm lượng polyphenol Yếu tố thời gian yếu tố quan trọng có ảnh hưởng định q trình trích ly polyphenol (Bảng 4.6, biểu đồ 4.4, phụ lục 9) Bảng 4.6 Ảnh hưởng thời gian tách chiết đến hàm lượng polyphenol đào tiên Hàm lượng polyphenol (mg GAE/mg ck), X±D Mẫu Mẫu c 12 5,86 ± 0,38 10.75b ± 1,05 24 54,38a ± 2,38 31.50a ± 2,69 36 46,20b ± 3,37 31.27a ± 3,06 48 6,28c ± 0,43 27.65a ± 1,28 a,b: khác biệt có nghĩa theo xử lí thống kê phân hạng theo hàng dọc mức 5% Thời gian Hàm lượng polyphenol (mg GAE/mg ck) 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 12 24 36 48 Thời gian chiết Mẫu Mẫu Biểu đồ 4.4 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng thời gian tách chiết đến hàm lượng polyphenol đào tiên Dựa vào bảng 4.6 biểu đồ 4.4, có kết hiệu suất trích ly dung mơi với thời gian chiết khác Qua đó, mẫu lá, thời gian thích hợp cho hàm lượng polyphenol cao tỉ lệ 24 với 54,38 ± 2,38 (mg GAE/mg ck), cao hẳn kết khác biệt có ý nghĩa so với mốc thời gian khác thí nghiệm mẫu Tương tự vậy, mẫu quả, thời gian thích hợp cho hàm lượng polyphenol cao 24 với 31,50 ± 2,69 (mg GAE/mg ck) Bên cạnh hàm lượng cao khơng có khác biệt có ý nghĩa so với tỉ lệ khác ngoại trừ khoảng thời gian 12 cho kết thấp thí nghiệm mẫu Kết luận: Qua thí nghiệm tiến hành song song mẫu đào tiên, kết cho thấy mẫu có chứa hàm lượng hàm lượng polyphenol cao mẫu đào tiên hầu hết thí nghiệm Hàm lượng polyphenol cao mà mẫu cho thấy loạt thí nghiệm 58.14 ± 4.82 (mg GAE/mg ck) Còn với mẫu quả, hàm lượng polyphenol cao 31,50a ± 2,69 (mg GAE/mg ck) Từ thấy hiệu suất trích ly hàm lượng polyphenol từ đào tiên cho cao gấp 1,84 lần so với mẫu Do đó, nghiên cứu lựa chọn mẫu đào tiên để tiến hành thí nghiệm tối ưu hóa quy trình tách chiết polyphenol 4.3 Kết khảo sát khả kháng oxy hóa từ cao chiết đào tiên Để khảo sát khả ức chế gốc tự do, phương pháp DPPH dùng phổ biến đơn giản, hữu hiệu, nhanh, đáng tin cậy Đây phương pháp kiểm tra khả khử gốc tự nhóm cho hydro sử dụng để định lượng chất kháng oxy hóa có cấu trúc sinh học phức tạp DPPH hợp chất có màu tím giống màu KMnO4, không tan nước, tan dung môi hữu Hợp chất DPPH, bước sóng cực đại 517nm, dễ dàng nhận điện tử hydro từ phân tử chống oxy hóa để trở thành phân tử nghịch từ ổn định (Soares et al., 1997) Thử nghiệm dựa cho nhận điện tử chất chống oxy hóa để vơ hiệu hóa gốc DPPH, kèm với thay đổi màu sắc đo bước sóng 517nm Sự đổi màu từ tím sang vàng xảy số lượng gốc DPPH môi trường giảm, đó, đổi màu DPPH phản ánh hoạt động “dọn dẹp” triệt để dịch chiết phân tích (Guo et al., 2007; Molyneux, 2004) Do đó, khả khử gốc tự hợp chất cao độ hấp thụ quang phổ bước sóng 517 nm phản ứng DPPH có giá trị giảm ngược lại Từ tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự DPPH, xây dựng phương trình tương quan tuyến tính, từ xác định giá trị IC50 (là nồng độ mà bắt 50% gốc tự DPPH) để làm sở so sánh khả kháng oxy hóa mẫu Mẫu có giá trị IC50 thấp hoạt tính kháng oxy hóa cao Ở thí nghiệm này, đối chứng vitamin C (acid ascorbic) Khả bắt gốc tự DPPH (%) Kết kháng oxy hóa 70.00 60.00 f(x) = 0.15x + 47.47 f(x) 43.3 f(x) = = 0.17x 0.35x ++23.16 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Nồng độ % ức chế DPPH vitamin C Linear (% ức chế DPPH vitamin C) Linear (% ức chế DPPH lá) % ức chế DPPH Linear (% ức chế DPPH quả) Linear (% ức chế DPPH vitamin C) % ức chế DPPH Linear (% ức chế DPPH lá) Linear (% ức chế DPPH quả) Biểu đồ 4.5 Biểu đồ biểu diễn khả bắt gốc tự vitamin C cao chiết từ đào tiên Hiệu bắt gốc tự cao chiết từ đào tiên đánh giá dựa vào khả loại bỏ 50% lượng gốc tự DPPH Thay y = 50 vào phương trình tương quan tuyến tính đồ thị, từ tìm giá trị IC50 vitamin C, cao chiết từ đào tiên 17,22 (mg/mL), 39,79 (mg/mL) 77,22 (mg/mL) Kết cho thấy cao chiết đào tiên có khả khăng kháng oxy hóa khơng cao vitamin C Bên cạnh đó, hoạt tính chống oxy hóa cao chiết đào tiên cao gấp lần so với cao chiết từ Do đó, việc sử dụng đào tiên hiệu đói với bệnh lý liên quan tới tính kháng oxy hóa, cần có nhiều nghiên cứu chuyên sâu để khai thác tiềm đào tiên Ở nghiên cứu tương đồng, theo báo cáo Das cộng (2014) dịch chiết từ đào tiên loại dung môi khác gồm ethanol, chloroform, ethyl acetate nước nồng độ 100 μg/mL Kết phần trăm khả bắt gốc tự DPPH dao động từ 55,32 đến 97,73%, giá trị IC50 dao động từ 8,78 đến 80,21 μg/mL Sự chênh lệch giá trị giải thích có khác biệt nguồn gốc nguyên liệu, thời gian thu hái, điều kiện khí hậu điều kiện tách chiết phương pháp xử lý khác Vì vậy, làm ảnh hưởng đến cao chiết, từ ảnh hưởng đến khả bắt gốc tự DPPH (Das et al.,2014) Mặt khác, chưa tìm thấy báo cáo nghiên cứu quốc tế công bố áp dụng đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa phương pháp DPPH đào tiên, nên chưa thể đối chiếu Tuy nhiên, kết nghiên cứu cho thấy tiềm ứng dụng đào tiên việc điều trị bệnh có nguyên nhân từ stress oxy hóa 4.4 Kết tối ưu hóa điều kiện tách chiết polyphenol từ đào tiên Trong nghiên cứu công bố liên quan đến hàm lượng polyphenol đào tiên, chưa tìm thấy đề tài khai thác sâu mảng tối ưu hóa điều kiện tách chiết polyphenol để tìm thơng số tối ưu Mặt khác, nghiên cứu trước áp dụng phương pháp cổ điển thể ảnh hưởng yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol, rõ tương quan yếu tố với Vì vậy, nghiên cứu này, phương pháp RSM phương pháp đại thích hợp để tiến hành khảo sát nhằm tìm giá trị điều kiện tối ưu để tách chiết hàm lượng polyphenol cao Bên cạnh đó, phương pháp RSM thể rõ tương tác hay ảnh hưởng lẫn yếu tố dự đoán hàm lượng polyphenol theo giá trị tối ưu qua mơ hình Ma trận nghiệm thức thiết kế xử lí phần mềm Minitab 18 theo mơ hình RSM – BBD với yếu tố khảo sát mã hóa mức (-1;0;1) (Bảng 4.7) Sau tiến hành thí nghiệm theo RSM – BBD, tìm phương trình tương quan yếu tố ảnh hưởng tới hàm lượng polyphenol với biến mã hóa sau: Y = 57,52 – 1,02X1 + 11,65X2 + 16,54X3 – 9,14 X1X1 – 10,17 X2X2 – 18,74 X3X3 – 0,31 X1X2 – 0,29 X1X3 + 0,41 X2X3 Trong đó: Y: hàm lượng polyphenol (mg GAE/mg ck) X1: nồng độ dung môi X2: tỉ lệ nguyên liệu dung môi X3: thời gian Với hệ số hồi quy (R2) 83,77%, giá trị có ý nghĩa 83,77%, số liệu thực nghiệm tương thích với số liệu dự đốn theo mơ hình, có 16,23% khác biệt yếu tố không xác định gây (sai số ngẫu nhiên) Optimal High D: 1.000 Cur Predict Low X1 1.0 [-0.0707] -1.0 X2 1.0 [0.5758] -1.0 X3 1.0 [0.4545] -1.0 Y Maximum y = 64.6511 d = 1.0000 Hình 4.1 Giá trị tối ưu yếu tố dự đốn từ mơ hình Bảng 4.7 Kết thí nghiệm thực theo mơ hình RSM – BBD để tối ưu hóa hàm lượng polyphenol từ đào tiên với yếu tố Thí nghiệ m 10 11 12 13 14 15 X1 Yếu tố X2 X3 -1 0 1 -1 -1 -1 -1 0 0 -1 -1 0 -1 -1 -1 0 0 -1 -1 1 Hàm lượng polyphenol (mg GAE/mg ck) Thực nghiệm Mơ hình 60,15 13,49 8,69 44,55 57.83 61,02 60,72 53,70 45,33 16,87 14,79 15,07 13,37 51,17 41,59 51,18 0,84 12,37 57,20 57,52 57,52 48,52 57,52 44,87 25,84 23,30 27,27 13,83 47,49 33,08 Theo dự đốn mơ hình (hình 4.1), hàm lượng polyphenol tối đa đạt tới 64,65 (mg GAE/mg ck) giá trị điều kiện tối ưu yếu tố sau: nồng độ dung môi methanol (X1) 59,3%, tỉ lệ nguyên liệu dung môi 1:23,3 (g/mL) thời gian chiết 30,73 Thông số điều kiện dựa vào kết nội suy từ yếu tố mã hóa thể qua mơ hình – 0,0707 với giá trị nồng độ methanol; 0,5758 ứng với tỉ lệ nguyên liệu dung môi; 0,4545 ứng với giá trị thời gian tách chiết Để kiểm chứng kết mà mô hình đưa ra, cần có thí nghiệm tiến hành giá trị tối ưu, từ đánh giá độ xác mơ hình Giá trị hàm lượng polyphenol tối ưu mà mơ hình dự đốn 64,65 (mg GAE/mg ck), kết thực kiểm chứng thu 61,85 (mg GAE/mg ck) Do đó, báo cáo thực nghiệm cho kết hàm lượng polyphenol xấp xỉ với dự đốn mơ hình (biểu đồ 4.9), điều thể tính xác hiệu phương pháp RSM Hàm lượng polyphenol (mg GAE/mg ck) 70 64.65 61.85 60 50 40 30 20 10 Kiểm chứng Dự đốn từ mơ hình Biểu đồ 4.6 Biểu đồ so sánh kết hàm lượng polyphenol thực nghiệm dự đoán từ mơ hình RSM Bên cạnh đó, đồ thị biểu diễn tương quan cặp yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol thể qua phần mềm SigmaPlot 10.0 Hình 4.2 mơ tả tương tác cặp yếu tố nồng độ dung môi tỉ lệ ngun liệu dung mơi đến hiệu suất trích ly polyphenol 70 60 50 40 30 70 20 10 65 60 24 10 20 30 40 50 60 70 22 20 55 18 16 50 Hình 4.2 Đồ thị bề mặt đáp ứng thể tương tác nồng độ dung môi với tỉ lệ nguyên liệu dung môi ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol từ đào tiên Qua đồ thị hình 4.2, xét đơn yếu tố nồng độ dung mơi, nhận thấy nồng độ dung mơi tăng cao hàm lượng polyphenol tăng theo đến mức khoảng 64% hàm lượng giảm dần Mặt khác, tỉ lệ, tỉ lệ nguyên liệu dung môi biến thiên theo chiều tăng dần giữ nguyên mức nồng độ dung mơi khoảng 52% hàm lượng polyphenol chạm mốc khoảng 60 (mg GAE/mg ck) Từ đó, nhận xét tỉ lệ nguyên liệu dung môi tỉ lệ thuận với hàm lượng polyphenol đào tiên Còn nồng độ dung mơi thích hợp khoảng 1:25 (g/mL) đồng thời kết hợp với tỉ lệ nguyên liệu dung môi cao đạt giá trị hàm lượng polyphenol từ đào tiên cao mà tăng nồng độ dung mơi hàm lượng tăng dần theo Nếu tiếp tụ gia tăng nồng độ dung môi methanol xu hướng hàm lượng polyphenol trích ly từ đào tiên có chiều hướng xuống Điều xảy nói hoạt động gradient nồng độ thúc đẩy làm tăng hoạt động khuếch tán vào tế bào q trình trích ly điều kiện tỉ lệ ngun liệu dung môi cao (Cacace & Mazza, 2003) Tuy nhiên, nồng độ dung mơi methanol dung để trích ly cao, gây biến tính tế bào làm cho tế bào bị nước cục dẫn tới tượng tế bào bị khô điều làm cho việc trích ly polyphenol khơng hồn tồn Thời gian tách chiết polyphenol yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol tính kinh tế q trình, yếu tố thời gian khảo sát phương pháp đáp ứng bề mặt 70 50 40 30 20 70 60 0 10 20 30 40 50 60 70 30 25 Thoi gi 55 20 a n (h ) 15 gd o 65 10 No n phenol Ham luong poly ) (mg GAE/mg ck 60 50 Hình 4.3 Đồ thị bề mặt đáp ứng thể tương tác nồng độ dung môi với thời gian ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol từ đào tiên Tế bào nguyên liệu cần khoảng thời gian định dung mơi qua trích ly polyphenol Nếu thời gian ngắn, dung môi không kịp ngấm sâu vào tế bào trích ly chưa hết tồn hàm lượng polyphenol Còn thời gian trích ly q dài, xảy tượng thẩm thấu ngược góp phần làm phần hoạt tính tự nhiên vốn có hợp chất polyphenol Kết từ đồ thị (hình 4.3) cho thấy yếu tố thời gian tỉ lệ thuận với hàm lượng polyphenol, tăng dần nồng độ dung môi lượng thời gian khơng thay đổi hàm lượng polyphenol không tăng lên đáng kể Khi tăng đồng thời hai yếu tố này, thấy kết hàm lượng polyphenol cao Bên cạnh đó, đạt nồng độ dung mơi tối ưu dù có tăng lượng thời gian trích ly hiệu khơng thể biến thiên theo chiều tiếp tục tăng Có thể kết luận yếu tố nồng độ dung môi yếu tố thời gian có tương tác qua lại đáng kể ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly polyphenol 70 phenol Ham luong poly ) (mg GAE/mg ck 60 10 20 30 40 50 60 70 50 40 30 20 24 10 22 20 30 18 25 20 Thoi gian ( h) 16 15 Hình 4.3 Đồ thị bề mặt đáp ứng thể tương tác tỉ lệ nguyên liệu dung môi với thời gian ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol từ đào tiên Tương tự cặp yếu tố trên, tương tác yếu tố tỉ lệ nguyên liệu dung môi với yếu tố thời gian ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol biểu diễn hình 4.3 Kết cho thấy hàm lượng polyphenol thấp (khoảng 10 mg GAE/mg ck) thời gian khoảng 12 với tỉ lệ khoảng 1:18 Khi cố định thông số giá trị yếu tố cho giá trị yếu tố lại nhận thấy thay đổi hàm lượng polyphenol ít, có khác biệt không nhiều Tuy nhiên, tăng đồng thời yếu tố hàm lượng polyphenol tăng cao gần đến giá trị tối ưu theo thực nghiệm (khoảng 61 mg GAE/mg ck) Rõ ràng áp dụng phương pháp RSM thấy tác động qua lại điều kiện qua lại ảnh hưởng đến hiệu suất sản xuất quy trình Từ đó, áp dụng thơng số tối ưu vào thực nghiệm, điều mang ý nghĩa đem lại lợi ích định mặt kinh tế thời gian cho đơn vị thực Còn nghiên cứu thì, rút thông số điều kiện tối ưu để áp dụng cho quy trình tách chiết polyphenol từ đào tiên dung môi methanol 59,3%; tỉ lệ nguyên liệu dung môi 1:23,3 thời gian tách chiết 30,73 giờ, nhằm đạt hàm lượng polyphenol cao với 64,65 (mg GAE/mg ck) CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu đạt đề tài, rút kết luận sau: Điều kiện thích hợp để thu hàm lượng polyphenol từ đào tiên là: dung môi methanol 60% với tỉ lệ nguyên liệu dung môi 1:20 thời gian 24 giở nhiệt độ phòng Và sau thực phương pháp RSM, giá trị tối ưu để thu hàm lượng polyphenol từ đào tiên dung môi methanol 59,3% với tỉ lệ nguyên liệu dung môi 1:23,3 thời gian 30,73 giở nhiệt độ phòng Điều kiện thích hợp để thu hàm lượng polyphenol từ đào tiên là: dung môi methanol 70% với tỉ lệ nguyên liệu dung môi 1:15 thời gian 24 giở nhiệt độ phòng Cao chiết từ đào tiên thể hoạt tính chống oxy hóa tương đối cao với giá IC50 khả bắt gốc tự DPPH 39,79 (mg/mL) Cao chiết từ đào tiên thể hoạt tính chống oxy hóa với giá IC50 khả bắt gốc tự DPPH 77,22 (mg/mL) 5.2 Kiến nghị Vì thời gian thực đề tài có hạn nên khơng thể xa khả khác cao chiết từ đào tiên Vì vậy, với kết đạt từ đề tài:” Tối ưu hóa điều kiện tách chiết polyphenol từ đào tiên phương pháp RSM khảo sát khả kháng oxy hóa từ đào tiên (crescentia cujute L.), sinh viên thực xin đề xuất số dự kiến sau: Tối ưu hóa quy trình tách chiết polyphenol từ đào tiên Khảo sát khả kháng khuẩn kháng số loài nấm gây bệnh cao chiết từ đào tiên Khảo sát quy trình trích ly flavonoids từ đào tiên Phân tích thành phần hợp chất tự nhiên có phương pháp sắc ký lớp mỏng sắc ký cột Khảo sát khả chữa bệnh nhiễm khuẩn làm hao mòn dần sức khỏe xuất khối u mô thể (nhất phổi), ví dụ điển hình bệnh lao ... tài: Tối ưu hóa điều kiện tách chiết polyphenol từ đào tiên phương pháp RSM khảo sát khả kháng oxy hóa từ đào tiên (crescentia cujute L.)” thực 1.2 Mục đích đề tài Tối ưu hóa điều kiện tách chiết. .. TẮT Sinh viên: Trần Vương Gia Đại Đề tài: Tối ưu hóa điều kiện tách chiết polyphenol từ đào tiên phương pháp RSM khảo sát khả kháng oxy hóa từ đào tiên (crescentia cujute L.)” Giảng viên hướng... nghiệm Hóa Nơng – Viện Cơng Nghệ Hóa Học Thành phố Hồ Chí Minh Đề tài thực nhằm khảo sát điều kiện thích hợp để tách chiết polyphenol từ đào tiên Từ đó, tối ưu hóa quy trình tách chiết polyphenol từ